Vi presenterar ett användarvänligt, hög genomströmning operant systemet för utvärdering av smärta beteenden i vakna, medvetna gnagare. Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) kan bedöma smärta genom en belöning / konflikt paradigm vilket ger ett mer humant sätt att testa. Detta protokoll kommer att ge mer kliniskt relevanta och translationella data från gnagare.
Vi presenterar ett operant system för detektion av smärta i vaket medvetna gnagare. Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) bedömer smärta beteenden i en mer kliniskt relevant sätt genom att inte förlita sig på reflex-baserade åtgärder för nociception. Mat fastade, hårlösa (eller rakad) gnagare placeras i en plexiglas kammare som har två Peltier-baserade thermodes som kan programmeras till vilken temperatur som helst mellan 7 ° C och 60 ° C. Den gnagare är utbildad för att få kontakt med dessa för att få tillgång till en belöning flaska. Under en session, är ett antal beteendemässiga smärta utfall automatiskt in och sparas. Dessa åtgärder omfattar antalet aktiveringar belöning flaska (slickar) och ansikts stimuli kontakt (ansikte kontakter), men anpassade åtgärder såsom slicka / ansiktet ratio (totalt antal slickningar per session / totalt antal kontakter) kan också skapas vara. Den stimulans temperatur kan ställas in till en enda temperatur eller flera temperaturer inom en session. Den OPADär en hög genomströmning, enkel att använda operant analys som kommer att leda till bättre översättning av smärta forskning i framtiden eftersom det innehåller kortikal ingång istället för att förlita sig på spinal reflex-baserade nociceptiva analyser.
Kronisk, okontrollerad smärta är fortfarande ett stort folkhälsoproblem och nya smärtstillande behandlingar ofta misslyckas med att översätta från bänken till sängkanten. Denna brist på framgång beror delvis på användningen av ineffektiva beteendemässiga analyser i reflex baserade åtgärder av smärta som inte nödvändigtvis eller helt modellera människans 1,2 smärttillstånd, och specifikt, en avsaknad av en tillförlitlig, hög genomströmning, kommersiellt tillgänglig , in vivo-smärta-bedömning analys för både råttor och möss. Vi presenterar här en hög genomströmning, lättanvänd version av vår operant baserade nociception analys. Det nya systemet bygger på vår tidigare operant ansiktssmärta analys som har visat sig vara känslig för att upptäcka olika smärtstillande metoder, inklusive värme, kyla och mekanisk 3,4,5. Från dessa åtgärder, har en mängd olika områden studerats, inklusive analgetika 6,3,4,5,7, smärttillstånd såsom inflammation, hyperalgesi och allodyni <sup> 3,8, trigeminusneuralgi 9, och perifer nociceptiv modulering via TRP-kanaler med capsaicin, resiniferatoxin, mentol, och icillin 8,10,5,11. Psykologiska effekter som ångest-inducerad modulering av smärta 12 och placeboeffekten 13 har också visats med orofacial operant tester tyder på att det kan vara lämpligt för att mäta den fulla upplevelsen av smärta och inte bara nociception.
Den ansiktssmärta Assessment Device (OPAD) använder en belöning / konflikt-analys som tillåter en gnagare att välja mellan att erhålla en armerande belöning eller flyr en aversiv stimulus sålunda kontrollera mängden smärta det känns under en session 14,15. Gnagare är först utbildade för att trycka deras ansikten i temperaturstyrda thermodes i syfte att få tillgång till ett livsmedel flaska innehållande en flytande belöning. Efter träning, kan den stimulans temperaturen värmas eller kylas och skillnader i rerande kan ange nivån på nociception eller analgesi djuret uppfattar. Den OPAD är också kapabel att snabba förändringar i temperatur som tillåter baslinjen testning och bedömning av smärta vid varma och kalla temperaturer inom ett enda test session. Här presenterar vi ett enkelt protokoll som belyser OPAD förmåga att upptäcka förändringar i smärta på grund av värme, kyla, och TRPV1 agonist capsaicin 16. Capsaicin används nedan som en termisk sensibiliseringsmedel eftersom det har flera fördelar för denna analys eftersom den är icke-vävnads skadande och har demonstrerats tidigare att inducera ansikts allodyni och hyperalgesi i gnagarmodeller 8. Vi kommer att visa hur OPAD programmet snabbt kan få, analysera, grafen, och utföra statistiska analyser på gnagare beteendemässiga data.
Den OPAD Systemet är lätt att använda, hög genomströmning analys kan detektera förändringar i smärtupplevelse hos gnagare. Den höga genomströmning karaktären av detta system innebär att ett stort antal djur kan testas på en enda dag av en enda person. Detta beror på det OPAD mjukvarusystem eftersom det tillåter upp till 16 lådor som ska köras samtidigt på en enda dator. Detta innebär att efter den första installationen tid, kan cirka 48 operanta körningar (vid 18 min per körning) utföras en timme, ännu mer om sessionen är satt till mindre tid per steg. Detta möjliggör för smärta testning i hundratals djur per dag. Denna mängd tester skulle inte vara praktiskt med de flesta traditionella smärtstillande analyser.
Jämnt med vårt tidigare arbete, är gnagare beteende förändras enligt smärttillstånd. Under de icke-skadliga perioder gnagare har normalt långa anfall av att dricka i vilken de upprätthåller kontakt med thermodes. Under aversiv 45 ° C eller 7 ° C förhållanden,gnagare har mycket kortare skjutningarna eftersom de inte kan upprätthålla kontakt under långa tidsperioder. Därför slicka / ansiktet ratio (antal slickningar dividerat med antalet ansikts kontakter inom en session) förändrar med smärta. Capsaicin ökade känslighet för värme smärta, vilket framgår av en lägre L / F förhållandet i de behandlade kontra obehandlade gnagare vid 45 ° C temperatur. Analgetika kan returnera detta slicka / ansikte förhållande till nivåer liknande icke-smärtsamma tillstånd 3. Även smärttillstånd som lätt produceras på huden (som tillämpning av capsaicin grädde) är de enklaste metoderna för att upptäcka smärta på denna analys, kan djurmodeller av mer kliniskt relevant djup nervvävnad smärta som trigeminusneuralgi förändrar också beteende operant orofaciala analyser 9 . Sammantaget dessa uppgifter bevis på att OPAD är känslig för förändringar i värme och kyla smärta, trösklar smärta, och skadliga kemiska ämnen som capsaicin utöver operantorofacial smärta analys förmåga att upptäcka många andra villkor för smärta och smärtlindring 6,3,8,17,10,5,12,18,11,9.
Den OPAD system för mätning smärta är en mer kliniskt relevant, meningsfull och human metod för att detektera smärta än reflex-baserade åtgärder. Dessa traditionella mått på nociception som tassbortdragning med von Frey filament 19 och svansen-flick assay 20 har använts i över hundra år, men de bara mäta responsen på en försöksledaren självförvållad stimulans. Djuret har liten kontroll och "nociception" är huvudsakligen lokaliserad till ryggmärgen. För människor är det subjektiva smärtupplevelsen också viktigt eftersom människor helt enkelt uppmanas att redovisa sina subjektiva nivåer av smärta. Möjligheten för djur att själva rapportera sin smärta i operanta baserade förfaranden skulle vara ett genombrott för grundläggande smärtforskning 1. Med OPAD, djuren får välja om de vill svara under apainful stimulus eller ej. Om det är för smärtsamt, djur minskar helt enkelt sina försök att nå belöningen och därmed begränsa sin exponering för smärta. Detta är en mycket humanare och mindre stressande analys jämfört med många reflex-baserade åtgärder där djur ofta har sin rörelse begränsad och har ingen kontroll över hur mycket smärtsamma stimuli som de utsätts för. Behovet av att fly från smärta är en inneboende enhet i alla djur och OPAD införlivar detta beteende istället för att kompensera för det som andra nociceptiva analyser. Rörelsen bort från reflex-baserade åtgärder av smärta i operant uppgifter blir allt vanligare inom området. Andra grupper har använt icke-reflex-baserade åtgärder som att undersöka måltid längd 21,22,23 och värme smärta paradigm escape 24 (För en genomgång av andra smärtstillande åtgärder föreslår vi vår första referens 1). Den OPAD kan kombinera delar av dessa till en enhetlig åtgärd, Lick / Face ratio, WHich undersöker födointag och behovet av att fly från smärtsamma stimuli. En annan fördel är att denna analys är i stånd att mäta smärta under långa tidsperioder (1-2 månader) utan att förlora känslighet 7,9. På grund av dess fördelar jämfört med reflex-baserad testning, är det mindre stressande och mer human analys väl anpassad för att mäta långsiktiga förändringar i nociceptiva beteendet hos gnagare.
Operant smärta mäter ofta ger olika resultat jämfört med reflex-baserade åtgärder i form av opioider effekter och trösklar smärta. Även höga doser av opioider används vanligtvis för reflex-baserade åtgärder 25 flera studier tyder på att lägre doser behövs för svaren på operanta analyser 26,27,28. Höga läkemedelsdoser kan också störa operanta åtgärder men dessa är detekterbara med OPAD 6. Andra studier har också visat att tröskelvärdena för flykt från en smärtsam stimulus är olika för operant versus reflex-baserade åtgärder 29,2,30 tyder på en stor skillnad mellan ett djurens smärtupplevelse kontra hastigheten på sina spinala reflexer. En fördel med OPAD är att gnagare kan välja om eller inte att utföra uppgiften, detta gör att gnagare att uttrycka flykt eller undvikande beteende. Denna komplexa beteende kräver kortikala beslutsfattande för att styra mängden nociception gnagare känns 14,29,15,30. Medan flykt och undvikande beteenden kan störa reflex baserade åtgärder dessa smärta beteenden är en integrerad del av OPAD. Skillnaderna i smärttröskeln och lägre doser av opioider behövs för operant analyser tyder på en högre känslighet för smärta och smärtlindring än traditionella reflex-baserade åtgärder.
Fastän OPAD kan mäta smärtan mer direkt än traditionella analyser, flera experimentella förhållanden och droger kan ha en negativ effekt på denna analys och måste kontrolleras för. Alterationsi appetitive motivation kan förändra beteendet på denna analys. Detta kan avspeglas genom en skillnad i belöning i sig 31 eller motivationen för belöningen 6. Försiktighet måste vidtas för att se till att djurets motivation för belöningen är konstant eftersom många läkemedel kan störa motivation. Exempelvis kan höga doser av morfin och andra opioider orsaka hyperfagi för söta, fettämnen 32 som kommer att förändra svara på skärmen operant orofacial analysen 6. Även om detta inte tyder på att denna operant-baserade belöning-konflikten paradigm har större konsekvenser för användning inklusive områdena ångest och missbruk (dvs. ändra givande aspekterna i närvaro av en viss smärtsam stimulus) är det viktigt att kontrollera för begärstillfredsställande förändringar under smärta testa sessioner. Dessa förändringar i motivation visas inte på dessa kliniskt relevanta lägre doser, men de smärtstillande effekter förblir intakt 3. Ett sätt att fortsrol för detta möjligt förväxla är att säkerställa att dosen av det bestämda läkemedlet ökar inte beteende vid en neutral (33 till 37 ° C) temperatur. Testa ett läkemedel mot en icke-läkemedelsgrupp vid en neutral temperatur bör vara ett första steg innan du lägger ett smärtkomponent. Dessutom, med tanke på att flera grundläggande sessioner är möjliga inom en testperiod med OPAD dessa frågor kan detekteras och kan styras för inom en enda beteendemässiga session. Eftersom den fasta schemat kan förändra motivationen för denna analys är det viktigt att hålla detta konsekvent. Vi gör normalt en natts fasta, men andra scheman är möjliga. Till exempel har vi experimenterat med en daglig kort snabb av 6 h före (opublicerade resultat). Detta gör det möjligt för att testa dagligen istället för varannan dag. Dessutom har unfasted råttor svarade också bra på analysen 9. Oavsett fastande tekniker används är det främst viktigt att hålla det konsekvent genom att testa att kontrollera för motivationsfaktorer.
<p class="Jove_content"> Sammanfattningsvis är OPAD en lättanvänd operant analys som mäter smärta på en nivå som är mycket mer lik människans villkor än traditionella smärtstillande analyser. Det viktigaste inslaget i detta system är integrationen av de experimentella och protokoll, datainsamling och analys / utfallsmått använder en programvara-kontrollerat system. Detta kommer att ge en mängd användarvänliga kontrollerade alternativ och parametrar för att samla in och analysera ett flertal resultatmått i en hög genomströmning fashion. Detta kontrasterar de vanligaste smärta-testsystem (t.ex. svansen flick, von Frey filament) som varken mjukvara-driven eller hög genomströmning. Programvaran-drivna system ger ett betydande framsteg för hur beteendestudier är utformade och hur data samlas in och analyseras och en ökad användning av denna analys kommer att ge grundläggande smärtforskning att bli mer kliniskt översättas i framtiden. Detta system förväntas ha en betydande inverkan på Advancing framtida forskning relaterad till smärta eftersom dessa operanta beteendestudier kan ge den nödvändiga länken för att förstå påverkan av högre ordningens strukturer på total smärta beteende.The authors have nothing to disclose.
National Institute on Drug Abuse, NIH bevilja 5R44DA026220-03
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Sweetended Condensed Milk | Borden | 5272910108 | |
Capzasin-HP 0.1% | Chattem, Inc. | 0032648-02 | |
Isopropyl alcohol | CVS | 5042826245 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
Opthalamic vet ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Hair remover lotion | Church and Dwight Co., Inc | NRLBB-22339-04 | |
OPAD System | Stoelting | 67500 | |
Additional OPAD cages | Stoelting | 67501 | |
Granulated cylinder | Cole-Parmer | EW-34512-11 | |
Paper towels | ANY | ANY | |
Cotton tipped applicators | Fisher | 23-400-101 | |
Fluotec 4 Vaporizer | Ohmeda | 39711 | |
Hair clippers | Oster | 78005-010 |