Vi presenterer en brukervennlig, høy gjennomstrømming operant system for evaluering av smerte atferd i våken, bevisst gnagere. Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) kan vurdere smerte gjennom en belønning / konflikt paradigmet og dermed gi en mer human måte å teste. Denne protokollen vil gi mer klinisk relevante og translasjonsforskning data fra gnagere.
Vi presenterer en operant system for påvisning av smerte i våken, bevisst gnagere. Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) vurderer smerte atferd i en mer klinisk relevant måte ved ikke å stole på refleks-baserte tiltak av nociception. Mat fastet, hårløs (eller barbert) gnagere er plassert i et pleksiglass kammer som har to Peltier-baserte thermodes som kan programmeres til alle temperaturer mellom 7 ° C og 60 ° C. Den gnager er opplært til å ta kontakt med disse for å få tilgang til en belønning flaske. I løpet av en økt, er en rekke atferdsmessige smerte utfall automatisk registrert og lagret. Disse tiltakene omfatter antall belønning flaske aktiveringer (licks) og ansikts kontakt stimuli (ansikt kontakter), men tilpassede tiltak som slikke / ansikt ratio (totalt antall licks per økt / totalt antall kontakter) kan også bli opprettet. Stimulans Temperaturen kan innstilles til en enkelt temperatur eller flere temperaturer i en økt. Den OPADer en høy gjennomstrømning, enkel å bruke operant analysen som vil føre til bedre oversettelse av smerte forskning i fremtiden som det inkluderer cortical inngang i stedet for å stole på spinal refleks-baserte nociceptive analyser.
Kronisk, ukontrollert smerte er fortsatt et stort folkehelseproblem og romanen smertestillende behandlinger ofte ikke klarer å oversette fra benk til sengen. Denne mangel på suksess er delvis på grunn av bruk av ineffektive atferdsmessige assayer refleks baserte målinger av smerte som ikke nødvendigvis helt eller modellere den menneskelige smerte tilstand 1,2, og spesielt, en mangel på en pålitelig og høy gjennomstrømming, kommersielt tilgjengelig , in vivo smerte-assay for vurdering av både rotter og mus. Vi presenterer her en høy gjennomstrømning, lett å bruke versjon av vårt operant baserte nociception analysen. Dette nye systemet er basert på vår forrige operant orofacial smerte analysen som har vist seg å være følsom for å oppdage ulike smerte modaliteter inkludert varme, kulde og mekanisk 3,4,5. Fra disse tiltakene, har en rekke felt blitt studert, inkludert smertestillende 6,3,4,5,7, smerte tilstander som betennelser, hyperalgesia og allodynia <sopp> 3,8, trigeminal 9 nervesmerter, og perifer nosiseptiv modulasjon via TRP kanaler med capsaicin, resiniferatoxin, mentol, og icillin 8,10,5,11. Psykologiske effekter som angst-induced modulering av smerte 12 og placebo effekt 13 har også blitt demonstrert med orofacial operant testing tyder på det kan være hensiktsmessig for å måle den fulle opplevelsen av smerte og ikke bare nociception.
Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) bruker en belønning / konflikt analysen som gjør at en gnager å velge mellom å motta en forsterkende belønning eller rømmer en motvilje stimulans og dermed kontrollere mengden av smerte det føles under en sesjon 14,15. Gnagere er først opplært til å trykke sine ansikter i temperaturkontrollerte thermodes for å få tilgang til en mat flaske som inneholder en væske belønning. Etter trening kan stimulans temperaturen varmes opp eller kjøles og forskjeller i resvarende kan indikere nivået på nociception eller smertestillende midler dyret oppfatter. Den OPAD er også i stand til raske endringer i temperatur som gjør baseline testing og vurdering av smerte ved kulde og varme i en enkelt testøkt. Her presenterer vi en enkel protokoll som fremhever OPAD evne til å oppdage endringer i smerte forårsaket av varme, kalde, og TRPV1 agonist capsaicin 16. Kapsaicin er brukt nedenfor som en termisk sensibiliserende middel fordi det har flere fordeler i denne analysen som den er ikke-vevet skadelig og har vært vist tidligere å indusere ansikts-allodyni og hyperalgesi i gnagermodeller 8. Vi vil vise hvordan OPAD programvaren kan raskt få tak i, analysere, graf, og utføre statistiske analyser på gnagere adferdsdata.
Den OPAD system er en enkel å bruke, høy gjennomstrømning analysen kan oppdage endringer i smerteopplevelse hos gnagere. Den høye gjennomstrømning natur dette systemet betyr at mange dyr kan bli testet i en eneste dag av en enkelt person. Dette skyldes den OPAD programvaresystem som det tillater opp til 16 bokser som skal kjøres samtidig på en enkelt datamaskin. Dette betyr at etter den innledende oppsett tid, kan om lag 48 operant runs (ved 18 min per løp) utføres en time, enda mer hvis økten er satt til mindre tid per scenen. Dette gir mulighet for testing av smerte i hundrevis av dyr om dagen. Denne mengden testing ville ikke være praktisk med de fleste tradisjonelle smertestillende analyser.
Samsvar med vår tidligere arbeid, er gnager atferd endres i henhold smertefulle tilstander. I løpet av de ikke-giftige perioder gnagere har vanligvis lange perioder med drikking der de opprettholder kontakt med thermodes. I løpet av 45 aversivt ° C eller 7 ° C forhold,gnagere har mye kortere anfall som de ikke kan opprettholde kontakt over lengre tid. Derfor slikke / ansikt ratio (antall licks delt på antall ansikts kontakter innenfor en økt) endrer med smerte. Kapsaicin økte følsomhet for varme smerte som vist ved en lavere R / F-forhold i de behandlede versus ubehandlede gnagere ved 45 ° C temperatur. Analgetika kan returnere denne slikke / ansikt forhold til nivåer tilsvarende ikke-smertefulle tilstander tre. Selv smertetilstander som er lett produsert på huden (som bruk av capsaicin krem) er de enkleste metodene for å påvise smerte på denne analysen, kan dyremodeller av mer klinisk relevant dyp nevrale vev smerte som trigeminusnevralgi også endre oppførsel på operant orofacial analyser 9 . Til sammen disse dataene støtter bevis for at OPAD er følsomme for endringer i varme og kalde smerte, smerteterskel, og skadelige kjemiske stoffer som capsaicin i tillegg til operantorofacial smerte analysen evne til å oppdage en rekke andre forhold av smerte og smertelindring 6,3,8,17,10,5,12,18,11,9.
Den OPAD system for måling smerte er en mer klinisk relevant, meningsfylt, og human metode for å påvise smerte enn refleks-baserte tiltak. Disse tradisjonelle tiltak av nociception som pote tilbaketrekning med von Frey filamenter 19 og halen-flick analysen 20 har blitt brukt i over et århundre, men de bare måle responsen til en eksperimentator-påført stimulans. Dyret har liten kontroll og "nociception" er i hovedsak lokalisert til ryggmargen. For mennesker er den subjektive smerteopplevelsen også viktig som folk er rett og slett bedt om å rapportere sine subjektive nivåer av smerte. Muligheten for dyr til selv rapportere sine smerter i operant baserte prosedyrer vil være et gjennombrudd for grunnleggende smerte forskning en. Med OPAD, er dyr som har fått valget om å svare i løpet av apainful stimulus eller ikke. Hvis det er for smertefullt, dyr rett og slett redusere sine forsøk på å nå belønning og dermed begrense sin eksponering for smerte. Dette er en mye mer human og mindre belastende assay i forhold til mange refleks-baserte tiltak hvor dyr har ofte sin bevegelse begrenses, og har ingen kontroll over mengden av smertefulle stimuli som de er utsatt for. Behovet for å flykte fra smerte er en iboende stasjon i alle dyr og OPAD inkorporerer dette problemet i stedet for å kompensere for det som andre nociceptive analyser. Bevegelsen bort fra refleks-baserte tiltak av smerter i operant oppgaver blir stadig mer vanlig i feltet. Andre grupper har brukt ikke-refleks-baserte tiltak som å undersøke måltid varighet 21,22,23 og termisk varme smerte escape paradigmer 24 (For en gjennomgang av andre smertestillende tiltak vi foreslår vår første referanse 1). Den OPAD er i stand til å kombinere elementer av disse til en enhetlig mål, det Lick / Face ratio, which undersøker matinntaket og behovet for å flykte fra smertefulle stimuli. En annen fordel er at denne analysen er i stand til å måle smerte over lange tidsperioder (1-2 måneder) uten å miste følsomhet 7,9. På grunn av sine fordeler i forhold til refleks-basert testing, er dette mindre stressende og mer human analysen godt tilpasset måle langsiktige endringer i nociseptive atferd hos gnagere.
Operant smerte måler ofte gir ulike resultater i forhold til refleks-baserte tiltak i form av opioid dose effekter og smerteterskel. Mens høye doser av opioider brukes vanligvis for refleks-baserte tiltak 25 flere studier tyder på at lavere doser er nødvendig for svarene på operant analyser 26,27,28. Høye narkotika doser kan også forstyrre operant tiltak, men disse kan påvises med OPAD seks. Andre studier har også vist at tersklene for flukt fra en smertefull stimulus er forskjellig for operant Versus refleks-baserte tiltak 29,2,30 tyder en stor forskjell mellom en dyr opplevelse av smerte versus hastigheten på sine spinal reflekser. En fordel med OPAD er at gnagere kan velge om du vil utføre oppgaven, gjør dette at gnager å uttrykke flukt eller unngåelsesatferd. Dette kompleks oppførsel krever kortikale beslutningsprosesser å kontrollere mengden av nociception gnager føles 14,29,15,30. Mens flukt og unngåelse atferd kan forstyrre med refleks baserte tiltak disse smerte atferd er en integrert del av OPAD. Forskjellene i smerteterskel og lavere doser av opioider som trengs for operant analyser tyder på en høyere følsomhet for smerte og smertelindring enn tradisjonelle refleks-baserte tiltak.
Selv om OPAD kan måle smerte mer direkte enn tradisjonelle analyser, flere eksperimentelle betingelser og medikamenter kan ha en ugunstig virkning på denne analysen, og må kontrolleres for. Endrings i appetitive motivasjon kan endre oppførsel på denne analysen. Dette kan bli reflektert av en forskjell i belønning i seg selv 31 eller ved motivasjonen for belønning seks. Hensyn må tas for å sikre at dyrets motivasjon for belønning er konstant så mange medikamenter kan forstyrre motivasjon. For eksempel kan høye doser av morfin og andre opioider føre hyperphagia for søt, fettstoffer 32 som vil endre reagerer på operant orofacial analysen seks. Selv om dette tyder på at dette operant-baserte belønning-konflikten paradigmet har bredere implikasjoner for bruk blant annet innen angst og avhengighet (dvs. endre givende aspektene i nærvær av en gitt smertefull stimulus) er det viktig å kontrollere for appetitive endringer i løpet av smerte testing økter. Disse endringer i motivasjon vises ikke på disse klinisk relevante lavere doser, men den analgetiske effekten forblir intakt tre. En måte å fortsrol for denne mulige forvirre er å sikre at dosen av medikamentet gitt øker ikke oppførsel ved en nøytral (33-37 ° C) temperatur. Testing et medikament mot en ikke-medikamentell gruppe på et nøytralt temperaturen bør være et første steg før du legger en smerte komponent. Også, gitt at flere baseline økter er mulig innenfor en test økt ved å bruke OPAD disse problemene kan oppdages og kan kontrolleres for innenfor en enkelt atferdsmessige sesjon. Som den faste plan kan endre motivasjon på denne analysen er det viktig å holde dette konsekvent. Vi vanligvis gjør en natts faste, men andre tidsplaner er mulig. For eksempel har vi eksperimentert med en daglig kort fort av 6 hr før (upubliserte resultater). Dette gjør det mulig for testing daglig i stedet for hver annen dag. Også har unfasted rotter også reagert godt på analysen ni. Uansett fastende teknikker brukes det i hovedsak er viktig å holde det konsekvent gjennom testing for å kontrollere for motivasjonsfaktorer.
<p class="Jove_content"> I konklusjonen, er det OPAD en enkel å bruke operant analysen som måler smerte på et nivå langt mer lik den menneskelige tilstand enn tradisjonelle smertestillende analyser. Det sentrale trekk ved dette systemet er integreringen av de eksperimentelle parametre og protokoller, datainnsamling og analyse / utfallsmål ved hjelp av en datastyrt system. Dette vil gi et vell av brukerstyrte alternativer og parametere for å samle inn og analysere en rekke utfallsmål i en high-throughput mote. Dette står i kontrast de mest brukte smerte-testing av systemer (f.eks hale flick, von Frey filamenter) som verken er programvare-drevet eller høy gjennomstrømming. Programvaren-drevet system gir et betydelig fremskritt for hvordan atferdsmessige studier er utformet og hvordan dataene samles inn og analyseres og en økning i bruken av denne analysen vil tillate enkel smerte forskning for å bli mer klinisk forskyvbart i fremtiden. Dette systemet forventes å ha en betydelig innvirkning på Advancing fremtidig forskning knyttet til smerte fordi disse operant atferdsmessige studier kan gi den nødvendige koblingen for å forstå innflytelsen av høyere ordens strukturer på generelle smerter atferd.The authors have nothing to disclose.
National Institute on Drug Abuse, NIH stipend 5R44DA026220-03
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Sweetended Condensed Milk | Borden | 5272910108 | |
Capzasin-HP 0.1% | Chattem, Inc. | 0032648-02 | |
Isopropyl alcohol | CVS | 5042826245 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
Opthalamic vet ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Hair remover lotion | Church and Dwight Co., Inc | NRLBB-22339-04 | |
OPAD System | Stoelting | 67500 | |
Additional OPAD cages | Stoelting | 67501 | |
Granulated cylinder | Cole-Parmer | EW-34512-11 | |
Paper towels | ANY | ANY | |
Cotton tipped applicators | Fisher | 23-400-101 | |
Fluotec 4 Vaporizer | Ohmeda | 39711 | |
Hair clippers | Oster | 78005-010 |