Vi præsenterer en brugervenlig, high-throughput operant system til evaluering af smertestillende adfærd i vågen, bevidst gnavere. Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) kan vurdere, smerter ved en belønning / konflikt paradigme dermed give en mere human måde at teste. Denne protokol vil give mere klinisk relevante og translationel data fra gnavere.
Vi præsenterer et operant system til påvisning af smerter i vågen, bevidst gnavere. Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) vurderer, smerte adfærd i en mere klinisk relevant måde ved ikke at stole på reflex-baserede mål for nociception. Fødevarer fastede, hårløse (eller glatbarberet) gnavere placeres i en plexiglas kammer, som har to Peltier-baserede thermodes, der kan programmeres til enhver temperatur mellem 7 ° C og 60 ° C. Den gnaver er uddannet til at tage kontakt med disse for at få adgang til en belønning flaske. Under en session, er der en række adfærdsmæssige smerte resultater registreres automatisk og gemmes. Disse foranstaltninger omfatter antallet af belønning flaske aktiveringer (licks) og ansigtsbehandlinger kontakt stimuli (ansigt kontakter), men tilpassede foranstaltninger som slikke / ansigt forholdet (samlet antal licks per session / samlet antal kontakter) kan oprettes også. Stimulus Temperaturen kan indstilles til en enkelt temperatur eller flere temperaturer i en session. Den OPADer en high-throughput, let at bruge operant assay som vil føre til bedre oversættelse af smerte forskning i fremtiden, da det indeholder kortikal input i stedet for at stole på spinal refleks-baserede nociceptive assays.
Kronisk, ukontrolleret smerte er fortsat et stort problem for folkesundheden og nye smertestillende behandlinger ofte undlader at oversætte fra bænken til bedside. Denne manglende succes skyldes til dels brugen af ineffektive adfærdsmæssige assays refleks mål for den smerte, som ikke nødvendigvis eller fuldstændigt modellere den menneskelige smerte tilstand 1,2, og specifikt en mangel på en pålidelig, high-throughput, kommercielt tilgængelig in vivo smerte vurdering assay for både rotter og mus. Vi præsenterer her en high throughput, let at bruge version af vores operant baserede nociception assay. Dette nye system er baseret på vores tidligere operant orofaciale smerter assay, der har vist sig at være følsomme over for afsløringen af forskellige smerter modaliteter, herunder varme, kulde og mekaniske 3,4,5. Fra disse foranstaltninger har en lang række områder blevet undersøgt, herunder analgetika 6,3,4,5,7, smerte lidelser som inflammation, hyperalgesi og allodyni <sup> 3,8, trigeminusneuralgi 9 og perifere nociceptive modulation via TRP kanaler med capsaicin, resiniferatoxin, menthol, og icillin 8,10,5,11. Psykologiske virkninger såsom angst-induceret modulering af smerte 12 og placebo-effekt 13 er også blevet påvist med Orofacial operant test tyder det kan være hensigtsmæssigt for at måle den fulde oplevelse af smerte og ikke blot nociception.
Den Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) bruger en belønning / konflikt assay, der tillader en gnaver at vælge mellem at modtage en forstærkende belønning eller undslippe et afskrækningsmiddel stimulus således styre mængden af smerte føles under en session 14,15. Gnavere er først uddannet til at trykke deres ansigter i temperaturkontrollerede thermodes for at få adgang til en fødevare flaske indeholdende en flydende belønning. Efter træningen kan stimulus temperaturen være opvarmet eller afkølet og forskelle i rerende kan indikere niveauet af nociception eller smertestillende dyret opfatter. Den OPAD er også i stand til hurtige ændringer i temperatur, som tillader baseline testning og vurdering af smerte ved varme og kolde temperaturer inden for en enkelt test session. Her præsenterer vi en simpel protokol, der fremhæver OPAD evne til at detektere ændringer i smerter forårsaget af varme, kulde og TRPV1 agonist capsaicin 16.. Capsaicin nedenfor anvendes som en termisk sensibiliserende agent, fordi det har flere fordele til dette assay, da det er ikke-vævet skadelige og er blevet påvist tidligere at inducere ansigts allodyni og hyperalgesi i gnavermodeller 8. Vi vil vise, hvordan OPAD software, hurtigt kan få, analysere, graf, og udføre statistiske analyser på gnaver adfærdsmæssige data.
Det OPAD systemet er en nem at bruge, high throughput assay stand til at detektere ændringer i smerteopfattelse hos gnavere. Den højt gennemløb karakter af dette system betyder, at mange dyr kan testes på en enkelt dag af en enkelt person. Dette skyldes den OPAD softwaresystem, da det giver op til 16 bokse, der skal køre samtidigt på en enkelt computer. Det betyder, at efter den indledende opsætning tid, kan omkring 48 operant kørsler (ved 18 min pr løb) skal udføres en time, endnu mere, hvis sessionen er sat til mindre tid per scenen. Dette giver mulighed for smerte test i hundredvis af dyr om dagen. Denne mængde test ville ikke være praktisk med de fleste traditionelle smertestillende assays.
I overensstemmelse med vores tidligere arbejde, er gnaver adfærd ændres under smertefulde forhold. I løbet af de ikke-skadelige perioder gnavere typisk har lange anfald af drikkevand, som de opretholder kontakt med thermodes. Under afskrækningsmiddel 45 ° C eller 7 ° C forhold,gnavere har meget kortere anfald, da de ikke kan holde kontakt i lange perioder. Derfor lick / ansigt forholdet (antal slik divideret med antallet af ansigts kontakter inden en session) ændrer med smerter. Capsaicin øget følsomhed over for varme smerte som vist ved et lavere L / F-forhold i de behandlede versus ubehandlede gnavere ved 45 ° C temperatur. Analgetika kan returnere dette slikke / ansigt forholdet til niveauer svarende til ikke-smertefulde vilkår 3. Selvom smertetilstande, som er let produceres på huden (ligesom anvendelse af capsaicin creme) er de enkleste metoder til afsløring af smerte på denne analyse, kan dyremodeller af mere klinisk relevant dybe neurale væv smerter som trigeminusneuralgi også ændre adfærd på operant orofaciale assays 9 . Tilsammen disse data dokumentation at OPAD er følsom over for ændringer i varme og kulde, smerter tærskler, og skadelige kemiske stoffer som capsaicin foruden operantorofaciale smerter assay evne til at detektere talrige andre betingelser for smerte og analgesi 6,3,8,17,10,5,12,18,11,9.
Det OPAD system af måle smerte er en mere klinisk relevant, meningsfuld og human metode til påvisning af smerte end refleks-baserede foranstaltninger. Disse traditionelle mål for nociception ligesom potetilbagetrækning med von Frey filamenter 19 og halen-flick assay 20 er blevet brugt i over et århundrede, men de kun måle reaktion på en eksperimentator skyld i stimulus. Dyret har lidt kontrol og "nociception" er primært lokaliseret til rygmarven. For mennesker, er den subjektive smerteoplevelse også vigtigt, da folk simpelthen bliver bedt om at rapportere deres subjektive niveauer af smerte. Muligheden for dyr til selv indberetter deres smerter i operant baserede procedurer vil være et gennembrud for grundlæggende smerte forskning 1.. Med OPAD, dyrene får valget om at reagere i løbet af apainful stimulus eller ikke. Hvis det er for smertefuldt, dyrene simpelthen reducere deres forsøg på at nå den belønning, og dermed begrænse deres eksponering for smerte. Det er en langt mere human og mindre stressende testen, når sammenlignet med mange refleks-baserede foranstaltninger, hvor dyr ofte har deres bevægelser begrænset, og har ingen kontrol over mængden af smertefulde stimuli, som de udsættes for. Behovet for at flygte fra smerten er en iboende drev i alle dyr og OPAD indarbejder denne adfærd i stedet for at kompensere for det som andre nociceptive assays. Bevægelsen væk fra refleks-baserede foranstaltninger af smerte i operant opgaver er blevet mere almindelig i marken. Andre grupper har brugt ikke-refleks-baserede foranstaltninger som undersøger måltid varighed 21,22,23 og termisk varme smerte flugt paradigmer 24 (For en gennemgang af andre smertestillende foranstaltninger, vi foreslår vores første henvisning 1). Den OPAD er i stand til at kombinere elementer af disse i en samlet foranstaltning, Lick / Face ratio, WHICH undersøger fødeindtagelse og behovet for at flygte fra smertefulde stimuli. En anden fordel er, at dette assay kan måle smerte over lange perioder (1-2 måneder) uden at miste følsomhed 7,9. På grund af dens fordele i forhold refleks-baseret testning, er denne mindre stressende og mere human assay godt tilpasset til måling af langsigtede ændringer i nociceptive adfærd i gnavere.
Operant smerte måler ofte giver forskellige resultater, når sammenlignet med refleks-baserede foranstaltninger i form af opioiddosis effekter og smertetærsklen. Mens høje doser af opioider typisk anvendes til refleks-baserede foranstaltninger 25 flere undersøgelser viser, at lavere doser er nødvendige for respons på operant assays 26,27,28. Høje lægemiddeldoser kunne også forstyrre operant foranstaltninger, men disse er påviseligt med den OPAD 6.. Andre undersøgelser har også vist, at tærsklerne for flugt fra en smertefuld stimulus er forskellige for operant Versus refleks-baserede foranstaltninger 29,2,30 tyder på en væsentlig forskel mellem en dyrenes opfattelsen af smerte versus hastigheden af deres spinal reflekser. En fordel ved OPAD er, at gnaver kan vælge, om ikke at udføre opgaven, dette giver gnaver at udtrykke flugt eller undgåelse adfærd. Dette kompleks adfærd kræver kortikale beslutningstagning til at styre mængden af nociception gnaver føles 14,29,15,30. Mens flugt og undgåelse adfærd kan forstyrre refleks-baserede foranstaltninger disse smerter adfærd er en integreret del af OPAD. Forskellene i smertetærsklen og lavere doser af opioider, der er nødvendige for operant analyser tyder på en højere følsomhed over for smerte og analgesi end traditionelle refleks-baserede foranstaltninger.
Selvom OPAD kan måle smerte mere direkte end traditionelle assays, adskillige eksperimentelle betingelser og narkotika kan have en negativ indvirkning på denne analyse, og skal styres efter. Ændrings i appetitive motivation kan ændre adfærden på dette assay. Det kan afspejles i en forskel i den belønning selv 31 eller af motivation for belønning 6.. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at dyret motivation for belønning er konstant som mange lægemidler kan interferere med motivation. For eksempel kan høje doser af morfin og andre opioider forårsage hyperfagi for sød, fedtstoffer 32, som vil ændre reagere på operant Orofacial assay 6.. Mens dette antyder, at denne operant-baserede belønning konflikten paradigme har videre implikationer for brug herunder områderne angst og afhængighed (dvs. ændre givende aspekter i nærværelse af en given smertefuld stimulus) er det vigtigt at kontrollere for appetitive ændringer under smerte afprøvning sessioner. Disse ændringer i motivation vises ikke på disse klinisk relevante lavere doser, men den analgetiske effekt forbliver intakt 3.. En måde at control for dette mulig forvirre er at sikre dosis af det givne lægemiddel ikke stiger adfærd på en neutral (33-37 ° C) temperatur. Test et lægemiddel versus en ikke-medicinsk gruppen på en neutral temperatur skal være et første skridt, før du tilføjer en smerte komponent. Også i betragtning af at flere baseline sessioner er mulige inden en test session vha. OPAD disse spørgsmål kan opdages og kan styres efter inden for en enkelt adfærdsmæssige session. Da den fastende tidsplan kan ændre motivation på denne assay er det vigtigt at holde dette konsekvent. Vi typisk gør en nats faste, men andre skemaer er mulige. For eksempel har vi eksperimenteret med en daglig kort hurtigt på 6 timer før (upublicerede resultater). Dette giver mulighed for at teste dagligt i stedet for hver anden dag. Desuden har unfasted rotter også reageret godt på analysen 9.. Uanset fastende teknikker anvendes det hovedsageligt vigtigt at holde det konsekvent i hele test for at kontrollere for motivationsfaktorer.
<p class="Jove_content"> Som konklusion OPAD er en nem at bruge operant assay som måler smerte på et niveau langt mere ligner den menneskelige tilstand end traditionelle smertestillende assays. Det centrale element i dette system er integrationen af de eksperimentelle parametre og protokoller, dataopsamling og analyse / resultatmål ved hjælp af en software-kontrolleret system. Dette vil give et væld af brugervenlige kontrollerede muligheder og parametre til at indsamle og analysere en række resultatmål i en høj-throughput fashion. Dette står i kontrast de almindeligt anvendte smerte-testsystemer (f.eks tail flick, von Frey filamenter), som hverken er software-drevet eller high-throughput. Den software-drevet system giver en betydelig fremgang for, hvordan adfærdsmæssige undersøgelser er designet og hvordan data indsamles og analyseres og en stigning i brugen af denne analyse vil give grundlæggende smerte forskning for at blive mere klinisk oversættes i fremtiden. Dette system forventes at have en betydelig indvirkning på advancing fremtidig forskning relateret til smerte, fordi disse operant adfærdsmæssige undersøgelser kan give den nødvendige forbindelse for at forstå indflydelsen af højere ordens strukturer på den samlede smerte adfærd.The authors have nothing to disclose.
National Institute on Drug Abuse, NIH tilskud 5R44DA026220-03
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Sweetended Condensed Milk | Borden | 5272910108 | |
Capzasin-HP 0.1% | Chattem, Inc. | 0032648-02 | |
Isopropyl alcohol | CVS | 5042826245 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
Opthalamic vet ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Hair remover lotion | Church and Dwight Co., Inc | NRLBB-22339-04 | |
OPAD System | Stoelting | 67500 | |
Additional OPAD cages | Stoelting | 67501 | |
Granulated cylinder | Cole-Parmer | EW-34512-11 | |
Paper towels | ANY | ANY | |
Cotton tipped applicators | Fisher | 23-400-101 | |
Fluotec 4 Vaporizer | Ohmeda | 39711 | |
Hair clippers | Oster | 78005-010 |