Summary
Her presenterer vi en systematisk tilnærming for å utvikle fysiologisk relevant, sensitiv og spesifikk
Abstract
Her presenterer vi metoder for utvikling av metoder for å Query potensielt klinisk signifikante nonsynonymous endringer ved hjelp av in vivo complementation i sebrafisk. Sebrafisk (Danio rerio) er et nyttig dyr system på grunn av sin eksperimentelle tractability; embryo er gjennomsiktig slik at lettvinte visning, gjennomgår rask utvikling ex vivo, og kan være genetisk manipulert 1 Disse aspektene har tillatt for betydelige fremskritt i analysen av embryogenesen. molekylære prosesser, og morfogenetiske signalanlegg. Til sammen fordelene ved denne virveldyr modell gjør sebrafisk svært mottagelig for modellering av utviklingsmessige defekter i pediatrisk sykdom, og i noen tilfeller, voksen-utbruddet lidelser. Fordi zebrafisk genomet er svært konservert med den hos mennesker (~ 70% ortologe), er det mulig å repetere humane sykdomstilstander i zebrafisk. Dette skjer enten ved injeksjon av mutant human mRNA for å indusere dominant negativ eller forsterkning av funksjons alleler, eller utnyttelse av morfolino (MO) antisens oligonukleotider for å undertrykke gener for å etterligne tap av funksjon varianter. Gjennom complementation av MO-induserte fenotyper med avkortet menneskelig mRNA, gjør vår tilnærming tolkningen av den skadelige effekten av mutasjoner på menneskelig protein sekvens basert på evnen til mutant mRNA å redde en målbar, fysiologisk relevant fenotype. Modellering av menneskelig sykdom alleler skjer gjennom mikroinjeksjon av sebrafisk embryoer med MO og / eller menneskelig mRNA på 1-4 celle scenen, og phenotyping opp til syv dager etter befruktning (DPF). Denne generelle strategi kan bli utvidet til et bredt spekter av sykdomstilstander fenotyper, som vist i den følgende protokoll. Vi presenterer våre etablerte modeller for morfogenetiske signalering, craniofacial, hjerte-, kar integritet, nyrefunksjon, og muskelavslappende lidelse fenotyper, så vel som andre.
Introduction
Den funksjonelle tolkningen av genetisk informasjon og tildeling av prediktiv klinisk verdi til en genotype representerer et stort problem i medisinsk genetikk og blir stadig mer intens med akselererende teknisk og økonomisk gjennomførbarhet av genom-wide sekvensering. Derfor er det nødvendig å utvikle og implementere nye paradigmer for å teste pathogenicity varianter av ukjent betydning (VUS) oppdaget hos pasienter. Disse analysene må da være nøyaktig, tids-og kostnadseffektiv, og havnen potensial til å katalysere en overgang til klinisk nytte.
Mens musen har vært tradisjonelt førstevalget innen menneskelig sykdom modellering, er sebrafisk fremstår som en vitenskapelig og økonomisk gunstig surrogat. I motsetning til mus, gjør sebrafisk biologi enkel og rask tilgang til alle utviklingsstadier, hjulpet av optisk klarhet av embryoer som gir real-time imaging for å utvikle sykdommer.
Vi merker oss også atre er iboende begrensninger i sebrafisk-modellen system. Selv D. rerio har rask første utviklingen av organsystemer, krever seksuell modenhet lag tre måneder. På grunn av dette, prenatal og barn-utbruddet lidelser er den mest mottagelig for dette forbigående uttrykk modell. Mens ideelt for gjennomføring av store kjemisk forbindelse skjermer, er bruk av genetiske mutanter ikke gjennomførbart for systematisk testing av tusener av nonsynonymous varianter som bidrar til, og fortsetter å bli påvist i pediatriske lidelser.
De complementation testene som er beskrevet her dra nytte av denne eksperimentelle tractability, høy grad av homologi, og bevaring av funksjon mellom menneskelige og sebrafisk proteiner, spesielt så for molekyler som er nødvendige for konserverte utviklingsprosesser. Figur 1 skisserer testing og identifikasjon strategi for ulike allel effekter. Begge tap av funksjon (LOF) og dominante assayer kan utføres. For LOF begynner eksperimentere med undertrykkelse av genet av interesse med en morfolinogruppe knockdown, og analysering for fenotyper som kan være relevante for den kliniske fenotypen under etterforskning. Undertrykkelse kan oppnås enten ved å blokkere oversettelse ved å målrette en MO ved eller nær den translasjonelle start området av zebrafisk-locus (oversettelse blokkering morfolino; tbMO) eller ved å interferere med skjøting ved å plassere en MO den spleisetapen knutepunkt, typisk indusere enten inkludering av en intron eller avvikende ekson hoppe (spleise blokkering morpholino; sbMO).
Deretter blir avkortet mRNA fra ortologe menneskelige transkripsjon innført og kvantifiserbare redning av fenotypen måles. Når analysen ble etablert, kan kandidat-mutasjoner i menneskelig innhold innføres og analysert for deres evne til å redde MO-induserte fenotype ved samme effektivitet som WT human mRNA. Omvendt, for kandidat dominant allel, humant mRNA (men ikke MO) er innføed med en forventning om at WT menneskelig mRNA ikke vil grovt påvirke sebrafisk anatomi og fysiologi, mens innføring av test mutasjoner som har en dominerende innvirkning vil indusere fenotyper analoge med de som ble observert i kliniske tilstand. Dette eksperimentet kan være finkornet ytterligere å dissekere om den dominerende effekten oppstår av en gevinst på funksjon (GOF) eller en dominant-negative mekanismen ved å blande WT og mutant menneskelig mRNA, for GOF hendelser, tillegg av WT menneskelig mRNA er forventet å være irrelevant, bør mens for dominant-negative alleler, blanding av WT og mutante mRNA forandre graden av fenotypen indusert av mutant-melding. I alle tilfeller anbefales det at alle kombinasjoner av injeksjoner (MO med WT humant mRNA g. morpholino med mutant human mRNA etc. kan utføres, fortrinnsvis i løpet av den samme kopling av befruktede egg (se figur 1) Tolkning er som følger.:
For LOF tester:
- Hvis knockdownproduserer en fenotype som kan bli reddet equivalently av mutant og WT mRNA, er allel sannsynlig godartet.
- Hvis mutant redning av knockdown fenotype er umulig å skille fra knockdown fenotype selv, er allel en sannsynlig funksjonell null. Eksperimentet kan ikke diskriminere mellom ekte nuller (ingen funksjonell protein) og ultralav protein aktivitetsnivå som ikke har noen redning kapasitet.
- Hvis det mutante redningen av knockdown fenotype er statistisk bedre enn den MO, men dårligere enn WT, er det sannsynlig at en allele hypomorph som dette resultatet demonstrerer delvis tap av funksjon.
For dominerende tester:
- Hvis det ikke er knockdown fenotype, men injeksjon av WT mRNA gir en fenotype, må en alternativ plan kan brukes hvis forsøket er å fortsette (se nedenfor).
- Hvis det ikke er knockdown fenotype og injeksjon av WT mRNA gir ingen fenotype, fortsetter eksperiment som vanlig.
- Hvis injeksjonav mutert mRNA er ekvivalent til den fra villtype-mRNA, kan det være allele enten benigne eller tap av funksjon, og analysen kan ha sviktet. Dette krever videre eksperimentering til å diskriminere mellom disse alternativene.
- Ved injeksjon av mutante mRNA ikke kan skjelnes fra MO knockdown, er funksjonen av genet produkt sannsynligvis endret på noen måte. For å skjelne endringen i funksjon, bør en titrering av mutert mRNA med villtype mRNA utføres.
- Dersom resultatet av denne titrering er utvisket til villtype mRNA alene, har det vist seg at det mutante proteinet produktet bruker villtype-proteinet som et substrat, slik som dens virkning varierer med mengden av titrering. Dette indikerer en dominant negativ fenotype.
- Dersom resultatet av denne titrering er utvisket til mutante mRNA alene, har det vist seg at det mutante proteinet produkt ikke lenger har den samme funksjon som vill-type, og således ikke påvirkes av mengden av vill-type protein produkt presendt. Dette viser at det er sannsynlig allelet vinning av funksjon.
Beredskapsplan:
- Hvis ingen fenotype presenterer fra MO knockdown, men gjør tilstede med WT mRNA, kan videre eksperimentering forekomme, selv om vi understreke at denne situasjonen ikke er ideell. WT human mRNA titreres for å minimere fenotype, og kan også brukes som en ny børverdi. Videre coinjection av WT og mutant menneskelig mRNA kan evalueres basert på redning evne til mutant.
Protocol
En. Bioinformatikk analyse
- Finn ut om det menneskelige gen av interesse har en sebrafisk ortholog, og hvis ja, hvor mange kopier. Vi anbefaler gjensidig BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ) av det humane proteinet mot sebrafisk genomet, og påfølgende BLAST av de beste sebrafisk truffet mot det menneskelige genom. Sant orthologs vil være det beste treffet i hvert enkelt tilfelle.
- Bestemme størrelsen på den åpne leseramme (ORF) av det humane genet. Hvis mer enn 6 kb, er denne modellen uløselige i dag på grunn av begrensninger av høy kvalitet in vitro transkripsjon av lange maler.
- Skaff eller generere et konstrukt inneholdende humant ORF i pCS2 + vektor ryggrad (eller tilsvarende vektor med et 5 'SP6 transkripsjon området og 3' polyA-signal).
- Designe en MO å blokkere spleising eller oversettelse av målrettet sebrafisk genet. Hvis flere kopier eksisterer i sebrafisk genomet, there er to alternativer: a) utforming av ytterligere MOS, eller b) identifikasjon av en spleis området fullt bevart mellom eksemplarer mot som en enkelt MO kan være effektive. Noen publiserte MO sekvenser er tilgjengelig på www.zfin.org .
2. Expression Analysis i Utvikling sebrafisk Embryo
- Finn ut om sebrafisk ortholog er uttrykt i tid og rom sammenheng relevant for den fenotypiske avlesning. Dersom ingen uttrykk data er tilgjengelig for genet av interesse, utføre revers transkripsjon (RT)-PCR ved anvendelse av cDNA fra hele sebrafisk embryoer eller in situ hybridisering. (Se 2,3).
3. Site-Regissert Mutagenese
- Design mutageneseprosedyrer primere 25-45 baser i lengde, med den ønskede mutasjon i midten. Primeren smeltetemperatur bør være større enn eller lik 78 ° C. Designe en forover og bakover mutagenese primer til anneal til motsatttråder av plasmidet.
- Skaff primere for sekvens bekreftelse av ORF post-mutagenese, og disse bør flis over ~ 300 basepar seksjoner for å dekke hele ORF.
- Monter mutagenese reaksjon med en high-fidelity polymerase og sykle som følger (1: 95 ° C 30 sek, 2: 95 ° C 30 sek, 3: 55 ° C 1 min, 4: 68 ° C 6 min, 5: Gå til to 18x, 6: 4 ° C for alltid, 7: ende).
- Tilsett 1 mL DpnI restriksjonsendonuklease per reaksjon for å fjerne dam metylert mal; Inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
- Transform 2 mL av mutagenese reaksjonsblandingen over i 20 pl kompetente celler i henhold til standard protokoller.
- Pick 3-4 kolonier og inokulere 5 ml LB-medium inneholdende egnede antibiotika. Rist ved 37 ° C over natten ved 225 rpm.
- Miniprep DNA og bestemme konsentrasjonen.
- Sekvens mutasjonen området for å bekrefte tilstedeværelse av mutasjonen av interesse.
- Sequence hele ORF å bekrefte sekvens integritet.
4. In vitro mRNA transkripsjon
- Ved hjelp av en lineær pCS2 + mal, generere avkortet mRNA ved hjelp av mMessage mMachine SP6 kit (Ambion). Vi anbefaler å bruke halvparten av reaksjonen komponent mengder.
- Rens det RNA-prøven med LiCl nedbør eller fenol og kloroform som beskrevet i for settet.
- Bestem konsentrasjonen av mRNA ved hjelp av absorbans, sikre integriteten av mRNA ved hjelp av gelelektroforese, og lagre prøven i tre eller flere alikvoter ved -80 ° C inntil den skal brukes. Vi anbefaler ikke flere fryse-tine sykluser av mRNA mengdene.
5. In vivo-analyse av Variant tap av funksjon
- Skaff sebrafisk embryoer fra naturlige sebrafisk parringer, og vedlikeholde dem ved 28 ° C i embryo vann i 6 eller 10 cm retter.
- Gjennomføre en morfolinogruppe doseresponskurve å evaluere fenotype spesifisitet, MO effektivitet og MO toksisitet. Injisere en dose kurve påminst tre ulike konsentrasjoner mellom 1-10 ng MO inn 50-100 (1-4 cellestadiet) sebrafisk embryo / batch. Effektiv MOS bør gi opphav til doseavhengig økning av andelen berørte embryo i en batch.
- Fenotypefrekvensene embryo på riktig utviklingsstadiet basert på uttrykk for målrettet sebrafisk genet av interesse og scenen der en relevant fenotype vil bli observert. Dette kan enten være kvantitativ (slik som en måling mellom anatomiske strukturer) eller kvalitative (basert på standardiserte fenotypiske kravene). For alle injeksjoner scoret> 24 HPF: Embryoer bør behandles med PTU (0,003% 1-fenyl-2-thiourea i embryo media) ved 24 høypassfilteret til maksimal reduksjon av melanocytter formasjonen.
- For spleise-blokkering Mos, test MO effektivitet ved å trekke total RNA fra hele embryo lysater på tidspunktet av fenotypisk scoring, generere cDNA og gjennomføre RT-PCR av målet genet bruke primere flankerer MO målområde.
- For å verifisere undertrykkelse efficiency av en tb-MO, høste hele embryo protein lysates og gjennomføre immunoblotting å sammenligne nivåene av målrettet protein versus kontroll. Imidlertid er denne metode ikke er mottagelig for alle målgener fordi det er begrenset kryss-reaktivitet for mange kommersielle antistoffer mot sebrafisk proteiner. To indirekte metoder for å vise spesifisitet MO, omfatter: a) som viser at det er en doseavhengig effekt på fenotype, og b) viser at ko-injeksjon av mRNA med villtype-tb-MO redder fenotypen effektivt. Av disse grunner, anbefaler vi en spleise blocker når det er mulig fordi effektivitet kan overvåkes direkte.
- Hvis en fenotype er observert videre til trinn 5.7, hvis ingen fenotypen er observert videre til trinn 6.1.
- For kvalitative fenotyper, velger du en MO dose der 50-75% av embryoer er berørt, for kvantitative fenotyper, velger du en MO dose der fenotypisk tiltaket er signifikant forskjellig fra vill-type (p <0,001). Injisere nye grupper av sebrafisk embryos (1-4 celle stadiet, n = 50-100/batch) med en cocktail som inneholder "analysen" dose av MO og en dose kurve av menneskelig WT mRNA (alt 10-200 pg mRNA, og disse dosene sørger for betydelige overexpression ovenfor grunnlinjen i en enkelt avskrift, som representerer 0,25-0,5% av total polyA mRNA i en sebrafisk embryo). 4
- Gjennomføre maskert scoring av injeksjon partier, velg WT mRNA dose med størst redning i forhold til MO alene, dette er den "analysen" dose av mRNA.
- Injisere nye batcher (1-4 celle stadiet, n = 50-100/batch) med analysen dose av MO og analysen dose av mutant menneskelig mRNA. Fenotypefrekvensene embryo på den aktuelle scenen og sammenligne resultatene til WT menneskelig mRNA redning ved hjelp av en egnet statistisk test (t-test eller chi-kvadrat). Se figur 1 for utfall og gå videre til trinn 7. Injisere analyseresultatene doser av WT og mutant mRNA alene for å kontrollere for mRNA giftvirkninger.
6. In vivo-analyse av Variant Dominant Negativ eller Gain i funksjonsknappene Effects
- Dersom ingen tap av funksjon fenotypen er observert (trinn 5.5), eller hvis mutante mRNA gir opphav til fenotyper ikke signifikant forskjellig fra MO alene (trinn 5.7), injiserer en dose kurve som strekker 10-200 pg WT humant mRNA (vi anbefaler 25, 50 , og 100 pg som en innledende test) i embryo partier (1-4 celle stadiet; 50-100 embryo / batch).
- På et egnet tidspunkt (se 5.3 ovenfor), utføre fenotypisk score, og bestemme den høyeste dose, hvor det ikke er en statistisk signifikant antall døde og / eller påvirkede embryoer i forhold til uninjected kontroller. Dette er den "assay" dose.
- Injisere analysen dose av mutant menneskelig mRNA (1-4 celle stadiet; 50-100 embryo / batch). Fenotypefrekvensene embryoer og sammenligne resultatene til å score fra analysen dose av WT menneskelig mRNA injeksjon eller analysen MO konsentrasjon. Se figur 1 for utfall.
- Hvis resultatene er umulig å skille fra MO, titrere menneskelig mutant mRNA med WT mRNAog sammenligne med menneskelig WT og mutant mRNA injeksjoner. Forbedring av fenotyper med mutant pluss WT mRNA-injisert batcher indikerer en dominerende negativ. Ingen forbedring indikerer en gevinst på funksjon.
7. Reprodusere in vivo testing resultater
- Gjenta in vivo minimum tre ganger.
8. Integrer Sebrafisk in vivo pathogenicity data med andre linjer av bevis
- Sammenligne pathogenicity data innhentet fra sebrafisk eksperimenter til: genetiske data i en stamtavle (hvis aktuelt), kontroll befolkningen frekvens data, in vitro studier (celle-baserte analyser av protein stabilitet, cellular lokalisering, signaliserer utgang, eller enzymatisk aktivitet).
Representative Results
Recessive og Pseudorecessive Disorders
Primære flimmerhårene er nesten allestedsnærværende strukturer på virveldyr kroppen plan som spiller mobilnettet signalering roller i flere celle skjebner, inkludert spredning, polaritet, differensiering, og vev vedlikehold. 5 dysfunksjon av disse organeller fører til et bredt spekter av menneskelige genetiske lidelser referert kollektivt som ciliopathies. 6,7 En slik klinisk enhet er Bardet-Biedl syndrom (BBS), en multisystemisk pediatrisk lidelse preget av retinal degenerasjon, fedme, hypogonadisme, polydactyly, og nedsatt nyrefunksjon. 7 Utviklingen av in vivo-tester av allel pathogenicity var nødvendig for BBS fordi a) det er en genetisk heterogen lidelse forårsaket av hovedsakelig privat nonsynonymous forandringer som forekommer i minst 17 gener 7-10, og b) oligogenic arv i> 25% av BBS familiene, hvori tilstedeværelsen av heterozygote endringer i en annenBBS genet (i tillegg til recessive primære kausale mutasjoner) kan modulere kliniske penetrans og uttrykksfullhet. Vanligvis slike tredje alleler er nonsynonymous heterozygote endringer av, fra et genetisk synspunkt, uklart patogene potensial, og dermed nødvendiggjør nøyaktig tolkning av deres biologiske effekt på protein funksjon. 11-13
For å undersøke patogene potensial for mutasjoner som bidrar til mutational belastning i BBS, vi først testet alle missense endringer identifisert i BBS1 - BBS14. Både vi og andre har vist at tap av basal kroppen proteiner gir opphav til dysregulation av planar celle polaritet (PCP, ikke-kanoniske Wnt signalering). Manifestert som konvergent forlengelse defekter i midten somitic sebrafisk embryoer 14 Ved hjelp av denne fysiologisk relevant fenotypisk avlesning, vi har funnet ut at undertrykkelse av BBS gener resultert i kortere kropp akser, bredere og tynnere somites og brede, knekk notochords. 15 </ Sup> (figur 2) MO-indusert undertrykkelse produsert gastrulation defekter, og co-injeksjon med menneskelig mRNA reddet betydelig (og reproduserbar) disse fenotyper som scoret av tre ulike in vivo metoder. Først ble embryoer scoret levende henhold til kvalitative fenotypiske kriterier (Normal, klasse I og klasse II, for detaljerte definisjoner av fenotypiske klassene se 15). Deretter quantitated vi celle migrasjon under epiboly (en tidlig utviklingsfase preget av tynning og spredning av cellelagene over eggeplomme celle 16) ved å bruke en fluorescein tracer å visualisere trekkende celler. Til slutt målte vi somitt trunk lengde i ni-somitt embryoer in situ hybridisert med en cocktail av krox20, pax2 og Myod riboprobes, som ble flat montert for morfologisk analyse.
Denne metodikken har vært brukt til å teste i overkant av 500 alleler i ciliary mutational plass. I ettstudere alene, in vivo testing av> 130 alleler produsert en rekke fenotypiske score, som indikert av protokoll vår (Figur 1) komplett redder ble klassifisert som godartet (ikke signifikant forskjellig fra WT redning), redder delvis ble klassifisert som hypomorphs (betydelig forbedret fra MO, men mer alvorlig enn WT redning), ble unnlatelse av å redde klassifisert som funksjonell null (ikke signifikant forskjellig fra MO), og fenotyper indusert av mutant mRNA alene i forhold til MO ble klassifisert som dominerende negativer.
Vi har også evaluert sensitivitet og spesifisitet av in vivo komplementering i zebrafisk assay. Spesifisiteten ble bekreftet ved ko-injeksjon av vanlig SNP'er (> 5% mindre allelfrekvens i friske kontrollpersoner populasjoner), og disse ble funnet å gi godartede fenotyper i 14/17 som ble testet (> 82%), og følsomheten ble vist å være 98% som indikert av samsvar mellom in vivo data og genetiske argumenter tilstrekkelig to tilskriver et allel som årsakssammenheng i en BBS stamtavle. 17. I tillegg observerte fenotypiske effekter ved hjelp av tre in vivo tiltak (live-scoring, epiboly sporing, og ISH morphometrics) ble validert in vitro ved hjelp immunoblotting og cellulær lokalisering studier. Mens tolkningen av disse resultatene som kreves forkunnskaper minst en mekanisme for sykdom patogenese, gir dette eksempelet bevis for å underbygge nytten og robusthet i protokollen vår. Vi har siden bekreftet vår in vivo scoring med flere andre linjer av eksperimentelle bevis i en uhildet mutational screening og funksjonell analyse studie av TTC21B, en retrograd intraflagellar transport protein. 18.
Dominant Disorders
Lem hofteholder muskeldystrofier (LGMD) er en autosomal klasse av muskeldystrofi, forårsaker langsom framdrift muskelsvakhet i hofter og skuldre. Denne genetisk og megchanistically heterogen gruppe av lidelser er forårsaket av både dominante og recessive mutasjoner på tvers av flere sarcolemmal, sarcomeric, cytoplasma, og kjernefysiske proteiner. Basert på presentasjonen av kliniske fenotyper og bevis av muskel engasjement fra magnetic resonance imaging, undersøkte vi årsaken til en dominerende LGMD funnet på finsk, USA og italienske familier 19. Sekvensering av posisjonelle kandidater innenfor den kartlagte locus avdekket mutasjoner i DNAJB6, uttrykte et gen som koder for en co-anstand av HSP70 familie som minst to spleise isoformer (kjernekraft og cytoplasmic) hos mennesker. For å få ytterligere innsikt i DNAJB6 funksjon og dens relevans for LGMD, undersøkte vi dens rolle i muskel integritet i sebrafisk. RT-PCR av sebrafisk ortholog (dnajb6b) oppdaget uttrykk så tidlig som fem-somitt scenen, som ble etterfulgt av injeksjon av fostre med en spleise-blokkering morpholino. På 48 timer etter befruktning, viste maskerte scoring avløsning av tregfibre fra sine innsettingspunktene. Spesifisiteten til denne fenotypen ble deretter testet med en andre ikke-overlappende MO og reddet deretter med WT humant DNAJB6 mRNA.
Hvis du vil spørre hvordan tapet av DNAJB6 funksjon fører til feil i muskel integritet, innførte vi missense mutasjoner funnet hos pasienter i menneskelige transkripsjoner av begge isoformer og injisert dem inn sebrafisk embryoer. Mens injeksjon av WT humant mRNA produsert ingen nevneverdig fenotype, phenocopied disse endringene i tap av funksjon effekter av mo når konstruert i cytoplasmiske, men ikke nukleære isoform. Dette ble fulgt av coinjection av ekvimolare mengder av mutanten og WT mRNA, noe som viste forbedret alvorlighetsgraden av muskulære fenotype, noe som tyder på en dominerende virkning. For å teste denne forestillingen, ble ytterligere injeksjoner utføres med å endre Molforholdene av mutant og WT mRNA. I samsvar med den spådommen, et overskudd av mutant mRNA sammenlignet med WT indusert dødelighet i embryo, mens enn overkant av WT produsert en gradvis økt redning. Dette ble etterfulgt av in vitro-eksperimenter for å finne oligimerization egenskaper og mulige protein interaksjoner. Disse viste at mutasjoner forringe antiaggregation aktiviteten til cytoplasmic DNAJB6 og forstyrre omsetningen av både mutant og WT, så vel som samhandler med et annet molekyl, BAG3, som også er relevant for pathomechanism av LGMD, siden LOF BAG3 fører til en pediatrisk form av muskeldystrofi 20. Vi spurte om BAG3 kunne modulere fenotypen indusert av mutant DNAJB6b i sebrafisk. Mens injeksjon av WT BAG3 alene produserte ingen fenotype, coinjection med DNAJB6 mutanter betydelig økt fenotypisk alvorlighetsgrad, noe som tyder på at BAG3 spiller en rolle som formidler patogenesiteten til slike mutanter 19.
| Forbigående Sebrafisk Model | <td> Mutant Sebrafisk LinjeTransgene mus Linje | ||
| Debutalder av menneskelig fenotype under etterforskning |
|
|
|
| Gjennomførbare Fenotyper |
|
|
|
| Tid til bruk (fra fødselen) | 1-7 dager | > 3 måneder | > 6 måneder |
| Gjennomstrømming | middels høy | lav | lav |
| Fordeler |
|
|
|
Tabell 1. Sammenligning av in vivo-modeller.
Tabell 2. Eksempler på in vivo modellering av menneskelige dysmorphologies. Ulike fenotyper testet under presenterte protokollen. En rekke fenotypiske lettleselig og visualisering teknikker kan benyttes basert på type lidelse. Klikk her for å se større tabell.
Figur 1. In vivo funksjonell testing av nonsynonymous varianter. En systematisk tilnærming til funksjonell testing av alleeles av ukjent eller hypotese betydning. Gene knockdown via morpholino mikroinjeksjon er etterfulgt av en serie av (ko) injeksjoner av både WT og mutert human mRNA. Statistiske analyser av fenotypiske utfall informere allel sykdomsframkallende evne og molekylær funksjon. Kort fortalt, for tap av funksjonstester: Hvis knockdown produserer en fenotype som kan bli reddet equivalently av mutant og WT mRNA, er allel sannsynlig benign (grønn boks). Hvis mutant redning av knockdown fenotype er umulig å skille fra knockdown fenotype, er allel en sannsynlig funksjonell null (gul boks). Hvis mutant redning av knockdown fenotype er statistisk bedre enn MO, men verre enn WT, er allel sannsynlig en hypomorph (grønn boks) For dominerende tester:. Hvis injeksjon av mutant mRNA er tilsvarende som for vill-type mRNA , allelet kan enten være godartet eller tap av funksjon, eller i analysen, kan ha sviktet (grønn boks). Hvis injeksjon av mutant mRNA er indis tinguishable fra MO knockdown, er funksjonen av genet produkt sannsynligvis endret på noen måte. For å skjelne endringen i funksjon, titrere mutante mRNA med villtype mRNA. Dersom resultatet av denne titrering er utvisket til villtype mRNA alene, benytter det mutante proteinet produkt villtype-proteinet som et substrat, og derved indikerer en dominant negativ fenotype (blå boks). Dersom resultatet av denne titrering er utvisket til mutante mRNA alene, det mutante proteinet produkt ikke lenger har den samme funksjon som vill-type, og er derfor sannsynligvis en gevinst på funksjon (blå boks). Hvis ingen fenotype presenterer fra MO knockdown, men ikke til stede med WT mRNA kan videre eksperimentering oppstår bør WT human mRNA titreres for å minimere fenotype, og kan også brukes som en ny børverdi. Videre coinjection av WT og mutant menneskelig mRNA kan evalueres basert på reddende evne til mutant (rosa boks).et = "_blank"> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. Kvantitativ og kvalitativ evaluering av MKS1 mutasjoner påvist hos mennesker. Utviklingsmessige defekter i mks1 morphant embryoer. Basert på alvorlighet, ble fenotyper klassifisert i tre grupper. Eksempler på hver klasse er vist (a), og deres utbredelse innenfor deres embryo kohort (n = 100-160 embryoer) ble tabulert (ikke vist). MO injisert embryo med klasse I fenotyper hadde grovt normal morfologi, men var kortere, med overdreven embryonale vev på plommen i forhold til å kontrollere injisert embryo på samme somitic alder (8-9 somites). Klasse II morphants ble tynnet, kort og hadde dårlig utviklet hode og hale strukturer, og i tillegg manglet somitic definisjonog symmetri. Klasse III embryoene ble sterkt forsinket med dårlig utviklet og misdannede somites, undulated notochords, og vanligvis ikke overleve forbi 10-somitt scenen. Co-injeksjon av menneskelig MKS1 mRNA reddet hvert av disse feilene, viser spesifisitet av fenotyper til mks1 undertrykkelse. In situ hybridisering av embryoer på 11-somitt stadiet (± 1 somitt) farget med krox20, pax2 og Myod riboprobes (b, c ). Fenotyper ble kvantifisert ved målinger fra første til siste nevneverdig somitt av hvert embryo (piler), kvantifisert i c. Figur tilpasset med tillatelse fra 15.
Figur 3. Eksempler på in vivo modellering av menneskelig dysmorphology. (A) Craniofacial dysmorphology. Kontroll mRNA injisert embryo (til venstre) og mutant injisert embryo (til høyre) farget med Alcian blå på 5 DPF. Mutanter mRNA-injisert embryo vise særlig små og misdannede hoder med en generell uorden av brusk craniofacial skjelettet inkludert sprikende branchial buer og manglende eller misdannede strukturer. (B) Micro / macrocephaly. Kontroll uninjected embryo (til venstre) og kctd13 MO-injisert embryo (til høyre) ved 5 DPF. Morphants viser utvidelse av hodet, sett fra plassen mellom øynene. 21. (c) Redusert vaskulær integritet. Kontroll uninjected embryo (øverst) og eng MO-injisert embryo (nederst) avbildes med fluorescens mikroskopi på to DPF i en fli1: eGFP transgene reporter linje. Morphants vise svekket spirende av intersegmental skip og andre vaskulære strukturer. 41 (d) Altered hjerte looping. In situ hybridisering av uninjected villtype embryoer (til venstre) viser Spaw uttrykk i venstre lateral plate mesoderm, mens ccdc39 morphant embryoer viste bilateral (høyre) eller, i de fleste tilfeller umulig å oppdage Spaw uttrykk (ikke vist). 43 (e) Nyre cyster. Uninjected WT embryo (øverst) og ift80 morphant (nederst). Morphants vises store nyre cyster (pil), perikardiell ødem (pilspiss) og en krøllet hale. 44 (f) Redusert glomerulær filtrering. Fluorescerende visualisering av en kontroll injisert embryo (øverst) og ift80 morphant (nederst) 24 timer etter injeksjon av rhodamine dekstran inn i hjertet. Fluorescens sprer gjennom de vaskulære system og er nesten fullstendig evakuert via nyrene som sett fullstendig fravær av fluorescens i kontrollen. Den morphant viser vedvarende fluorescerende dekstran, noe som tyder på redusert glomerulær filtrering. 46 (g) muskeldystrofi. WT DNAJB6 mRNA injisert embryoer (øverst) viser normale langsomme myofibers spenner over de somites normalt mellom tilstøtende myosepta som bestemmes av farging med anti-slow myosin antistoff. Mutant DNAJBb (nederst) viste en delvis å fullføre avløsning av myofibers fra myosepta i ett eller flere somites. 19 (h) somitt vinkel. Forstørret live-lateral utsikt over kontrollen uninjected (øverst) eller kif7 morphants (nederst) fotografert ved 30 HPF. Morphants vise unormalt formet somites, skyldes ektopisk Hedgehog signalering i sebrafisk myotome. 47.
Alle tall tilpasset med tillatelse.
Discussion
Metodene som beskrives her, representerer en generell protokoll som gjelder for analysen av nonsynonymous forandringer assosiert med en rekke genetiske sykdommer fenotyper (tabell 2, figur 3). Våre tilnærminger har vist seg nyttig å evaluere den potensielle virkningen av variasjon på sykdom fenotyper, og bidra til å dissekere sykdomsmekanismer (for eksempel bidrag av dominerende negative mutasjoner til Bardet-Biedl syndrom, en primært autosomal recessiv lidelse 17). Hittil gjennom utviklingen av den fremlagte beslutningstre, har vi formet til rimelig pris og tid av over 200 gener kausalt forbundet med genetiske lidelser, til et overskudd av 1000 alleler.
Selv om det ikke diskutert i detalj her, har vi også vist at disse metodene er hensiktsmessig å modellere andre typer genetiske lesjoner, for eksempel kopi nummer varianter (CNVs) samt og genetiske interaksjoner. Analyser av slike hendelser er utenfor rammen avden foreliggende fremgangsmåte beskrivelse, selv om de er fundamentalt avhengig av det samme prinsipp for systematisk testing av kandidat gener (inkludert parene av gener injisert samtidig) for å bestemme induksjonen eller forverring av klinisk aktuelle fenotyper. For eksempel kan for å belyse hvilken av de 29 gener i 16p11.2 CNV være relevant for den observerte microcephaly observert hos pasienter med duplikasjoner av et 660 kb genomisk segment, mRNA som tilsvarer hver av de 29 gener i segmentet ble injisert og hode størrelse målinger ble utført ved to DPF og fem DPF, avslører et stort bidrag av en enkelt avskrift, KCTD13. 21. I tillegg har vi brukt denne modellen til analysen genetiske interaksjoner av genomisk lesjoner hos pasienter med både Bardet-Biedl syndrom og Hirschsprung sykdom. 22. Ved sammenligning av MO undertrykkelse av de kausale gener av de to kliniske identiteter hver for seg og samtidig, var vi i stand til å identifisere de resulterende fenotype som being en synergistisk interaksjon heller enn bare additiv alvorlighetsgrad.
Til tross for å ha etablert høy sensitivitet (98%) og spesifisitet (> 82%) for variantene bidrar til ciliopathies 17, vet vi ennå ikke har tilstrekkelige data for å fastslå om disse er generell nytteverdi for alle fenotypiske readouts i sebrafisk modeller. For å gjøre dette, forutsa et stort antall alleler, genetisk å være enten benigne eller patogene, må prøves i hvert fenotypisk kategori. Dette vil være spesielt viktig for gjennomføringen av slike analyser i klinisk setting, kan der funksjonell tolkning av VUSs informere diagnostisering og behandling bare hvis en robust forståelse av falske positive og falske negative kan følge med levering av slike resultater til leger og pasienter. Likevel kan disse metodene bidra betydelig mot en bedre forståelse av landskapet av menneskelig genetisk sykdom. Vi forventer at disse modellene ikke bare vil tjene som et grunnlaget for en bedre tolkning av klinisk genetisk informasjon, men vil også bli benyttet som nyttige modeller for å gjennomføre terapeutiske skjermer. In vivo data kan også være i forhold til i silico beregningsorientert spådommer fra kilder som PolyPhen 23, sile 24, MutPred SNPs & GO 25, eller 26 vise konkordans. Merk at i en tidligere studie av prediksjon databaser SNPs & GO og MutPred ble funnet å være den mest nøyaktige, med nøyaktighet nå bare 0,82 og 0,81, henholdsvis. 27.
Selv om vi har beskrevet robustheten av disse metodene for et delsett av pediatriske anatomiske defekter (tabell 2, figur 3), visse fenotyper er mindre medgjørlig ved disse metodene. Noen unntak til tross, det er tre hovedklasser av lidelser ikke mottagelig for protokollen vår. Voksen-utbruddet lidelser (for eksempel Parkinsons sykdom) representerer en utfordring å modellere i en embryonale system. Sakte progression degenerative fenotyper (slik som frontotemporal demens) kan kreve mer tid enn de syv dpf vindu av MO aktivitet for å produsere en fenotype. Andre genet knockdown teknologier som RNAi siRNA og er tilgjengelige for å forstyrre eller forringe genet målet, men det har vist seg at ingen er så bestemt, stabil, ikke-giftig, eller langvarig som MOS 28, og dermed også begrenser tidsramme for phenotyping. Det tredje vil enkelte virveldyr strukturer, slik som hos pattedyr lunge, ikke ha en tilstrekkelig ortologe struktur i zebrafisk embryo. Vi har også gitt et forslag til beredskapsplan for etterforskningen av de tilfeller der WT menneskelig mRNA injeksjon fører til en fenotype, selv om vi advare dette er en uvanlig og uønsket situasjon.
Visse sykdommer fenotyper kan da kreve en større grad av abstraksjon og surrogacy. Det er mulig at gen-funksjon har avvek tilstrekkelig til å svekke fenotypisk likhet mellom modell og true fenotype, eller at zebrafisk fysiologi kompliserer iboende virkningen av indusert sykdom. I slike tilfeller foreslår vi videre disseksjon av det produserte fenotype før oppsigelse. Vi har produsert noen vellykkede eksempler der problematiske fenotyper for denne analysen har blitt modellert i sebrafisk embryoer. For eksempel mutasjoner i TCF8, ble et gen assosiert med Fuchs korneadystrofi (FCD), som ble analysert ved hjelp av vår protokoll ved å bruke gastrulation defekter som et surrogat fenotypisk avlesning bakgrunn av den kjente rollene til dette transkript i tidlig utvikling. 29. I andre tilfeller, f.eks som voksen-utbruddet muskeldystrofi skyldes mutasjoner i DNAJB6, var vi i stand til å generere myofiber fenotyper i 5dpf embryoer til tross for det faktum at mennesker er blottet for merkbar muskel patologi i sine første tre-fire tiår av livet. 19.
I tillegg til de forbigående mutant modellene som presenteres her, andre har også tatt BELIGGEge av denne forbigående system for å modellere sykdom hos mennesker i en rekke systemer i kroppen. I ett eksempel ble retinitis pigmentosa modellert i zebrafisk ved knockdown av genet RP2, som resulterer i celledød retinal og redusert retinal laminering. Rescue med human villtype mRNA resultert i utviklingen av alle tre lag med retinal laminering, mens fire av fem mutante mRNA unnlatt å redde. 30. Selv om denne modell av et humant sensorisk forstyrrelse er basert på en morfologisk fenotype, er det også mulig å analysen svar på stimuli som akustisk skremmeeffekt eller prepulse hemming. 47.
Nylig ble en sebrafisk-modellen brukes til å undersøke Alzheimers sykdom patogenesen gjennom amyloidforløperprotein. 31 Forfatterne viste at genet knockdown forårsaket nedsatt aksonal utvekst av motoriske nerveceller, som kunne bli reddet med menneskelig mRNA. Denne modellen har vist seg å være spesielt informativ, som musemodeller bare vise subtil phenotypes (single knockdown) eller postnatal Dødelighet (dobbel knockdown). Evnen til å evaluere sebrafisk embryoer in vivo gjennom hele utviklingen bidratt til å skjelne den patogene effekt av redusert amyloidforløperprotein, samt gitt direkte bevis for at proteinet krever både en ekstracellulær og intracellulær domene for riktig funksjon. Andre kjente modeller inkluderer at ekstra muskeldystrofier 32, Diamond Blackfan 33 anemi, Axenfeld-Reiger syndrom (okulære og kraniofacial utvikling) 34, inflammatorisk tarmsykdom 35 (antibakteriell aktivitet), Parkinsons sykdom 36 (nevroner og bevegelsesevne tap), og beslag 37 (hydrocephalus og hyperaktivitet).
Mer vanlig er mutant sebrafisk linjer som har vist seg også å rekapitulere en menneskelig sykdom fenotype. Gjennomgått i 1,38, modellene inkluderer leukemi, melanom, utvidede kardiomyopati, Duchenne muskeldystrofi,og mange andre.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi erkjenner støtte fra en Duke University Dean Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) fellesskap 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01-EY021872 fra National Eye Institute (EED), R01HD04260 fra National Institute of Child Health and Development (NK), R01DK072301 og R01DK075972 fra National Institute of Diabetes Digestive og nyre lidelser (NK), og Den europeiske union (Finansiert av EU 7. FP henhold GA nr 241955, prosjekt SYSCILIA;. EED, NK) NK er en Distinguished Jean og George W. Brumley professor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
| DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
| Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
| Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
| Equipment | |||
| PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
| Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
| AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
| DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
| DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
| Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements | ||
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Gerdes, J. M., Davis, E. E., Katsanis, N. The vertebrate primary cilium in development, homeostasis, and disease. Cell. 137, 32-45 (2009).
- Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N. Engl. J. Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J. Clin. Invest. 119, 428-437 (2009).
- Marion, V. Exome sequencing identifies mutations in LZTFL1, a BBSome and smoothened trafficking regulator, in a family with Bardet-Biedl syndrome with situs inversus and insertional polydactyly. J. Med. Genet. 49, 317-321 (2012).
- Otto, E. A. Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8 as the cause of a retinal-renal ciliopathy. Nat. Genet. 42, 840-850 (2010).
- Schaefer, E. Molecular diagnosis reveals genetic heterogeneity for the overlapping MKKS and BBS phenotypes. Eur. J. Med. Genet. 54, 157-160 (2011).
- Katsanis, N. The oligogenic properties of Bardet-Biedl syndrome. Hum. Mol. Genet. 13 Spec No 1, R65-R71 (2004).
- Badano, J. L. Dissection of epistasis in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Nature. 439, 326-330 (1038).
- Badano, J. L. Heterozygous mutations in BBS1, BBS2 and BBS6 have a potential epistatic effect on Bardet-Biedl patients with two mutations at a second BBS locus. Hum. Mol. Genet. 12, 1651-1659 (2003).
- Gerdes, J. M. Disruption of the basal body compromises proteasomal function and perturbs intracellular Wnt response. Nat. Genet. 39, 1350-1360 (2007).
- Leitch, C. C. Hypomorphic mutations in syndromic encephalocele genes are associated with Bardet-Biedl syndrome. Nat. Genet. 40, 443-448 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zaghloul, N. A., et al. Functional analyses of variants reveal a significant role for dominant negative and common alleles in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10602-10607 (2010).
- Davis, E. E. TTC21B contributes both causal and modifying alleles across the ciliopathy spectrum. Nat. Genet. 43, 189-196 (2011).
- Sarparanta, J., et al. Mutations affecting the cytoplasmic functions of the co-chaperone DNAJB6 cause limb-girdle muscular dystrophy. Nat. Genet. 44, 450-455 (2012).
- Selcen, D. Mutation in BAG3 causes severe dominant childhood muscular dystrophy. Annals of neurology. 65, 83-89 (2009).
- Golzio, C., et al. KCTD13 is a major driver of mirrored neuroanatomical phenotypes of the 16p11.2 copy number variant. Nature. 485, 363-367 (2012).
- de Pontual, L., et al. Epistasis between RET and BBS mutations modulates enteric innervation and causes syndromic Hirschsprung disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13921-13926 (2009).
- Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7, 248-249 (2010).
- Kumar, P., Henikoff, S., Ng, P. C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat. Protoc. 4, 1073-1081 (2009).
- Calabrese, R., Capriotti, E., Fariselli, P., Martelli, P. L., Casadio, R. Functional annotations improve the predictive score of human disease-related mutations in proteins. Hum. Mutat. 30, 1237-1244 (2009).
- Li, B., et al. Automated inference of molecular mechanisms of disease from amino acid substitutions. Bioinformatics. 25, 2744-2750 (2009).
- Thusberg, J., Olatubosun, A., Vihinen, M. Performance of mutation pathogenicity prediction methods on missense variants. Hum. Mutat. 32, 358-368 (2011).
- Summerton, J. E. Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity. Curr. Top. Med. Chem. 7, 651-660 (2007).
- Riazuddin, S. A., et al. Missense mutations in TCF8 cause late-onset Fuchs corneal dystrophy and interact with FCD4 on chromosome 9p. Am. J. Hum. Genet. 86, 45-53 (2010).
- Shu, X., et al. Knockdown of the zebrafish ortholog of the retinitis pigmentosa 2 (RP2) gene results in retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 2960-2966 (2011).
- Song, P., Pimplikar, S. W. Knockdown of amyloid precursor protein in zebrafish causes defects in motor axon outgrowth. PloS one. 7, e34209 (2012).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, 623-633 (2010).
- Danilova, N., Sakamoto, K. M., Lin, S. Ribosomal protein S19 deficiency in zebrafish leads to developmental abnormalities and defective erythropoiesis through activation of p53 protein family. Blood. 112, 5228-5237 (2008).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D. S., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of axenfeld-rieger syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 7-22 (2012).
- Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4, 832-841 (2011).
- Sheng, D., et al. Deletion of the WD40 domain of LRRK2 in Zebrafish causes Parkinsonism-like loss of neurons and locomotive defect. PLoS genetics. 6, e1000914 (2010).
- Teng, Y., et al. Loss of zebrafish lgi1b leads to hydrocephalus and sensitization to pentylenetetrazol induced seizure-like behavior. PloS one. 6, e24596 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods Cell Biol. 76, 415-436 (2004).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Lee, N. Y. Endoglin regulates PI3-kinase/Akt trafficking and signaling to alter endothelial capillary stability during angiogenesis. Molecular Biology of the Cell. 23, 2412-2423 (2012).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 228, 30-40 (2003).
- Merveille, A. C., et al. CCDC39 is required for assembly of inner dynein arms and the dynein regulatory complex and for normal ciliary motility in humans and dogs. Nat. Genet. 43, 72-78 (2011).
- Beales, P. L. IFT80, which encodes a conserved intraflagellar transport protein, is mutated in Jeune asphyxiating thoracic dystrophy. Nat. Genet. 39, 727-729 (2007).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr. Nephrol. 23, 2095-2099 (2008).
- Putoux, A. KIF7 mutations cause fetal hydrolethalus and acrocallosal syndromes. Nat. Genet. 43, 601-606 (2011).
