Summary
상동 재조합 기술은 크게 발전
Abstract
내생 유전자 좌위의 빠르고 대규모 조작 기술의 지속적인 발전은 인간의 질병 관련 연구를위한 유전자 모델 생물로 초파리의 사용을 확대 할 것이다. 최근 몇 년 동안 상동 재조합 recombineering 같은 기술 발전을 볼 수있다. 그러나 명백한 널 돌연변이 또는 태그 내생 단백질을 생성하는 것은 대부분의 유전자 상당한 노력이 남아있다. 여기, 우리는 생체 내에서 내생 궤적을 대상으로하고 조작하는 데 사용할 수있는 벡터를 생성하는 recombineering 기반 복제 방법을 사용하는 방법을 설명하고 보여 구체적으로, 우리는 세 가지 기술의 조합을 설립했습니다. (1) BAC의 transgenesis / recombineering ( 2) 끝 아웃 상동 재조합 (3) 게이트웨이 기술은 내생 게놈 유전자 좌를 조작하기위한 강력하고 효율적이며 유연한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 방법 (1) 디자인 individua에 대한 단계별 세부 사항을 제공L 벡터, (2) 간격 수리 (3) 방법 recombineering의 두 번째 라운드를 사용하여 이러한 벡터에서 관심의 유전자를 바꾸거나 태그를 사용하여 상동 재조합 벡터로 게놈 DNA의 큰 조각을 복제하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 또한 녹아웃, 또는 노크의를 통해 태그 유전자를 생성하기 위해 생체 내에서 이러한 카세트를 동원하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 쉽게 병렬로 여러 대상에 채택하고시의 적절하고 효율적인 방법으로 초파리의 게놈을 조작하기위한 수단을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
자신의 내생 유전자 좌에서 단일 유전자의 분자 정의 된 조작을 청소하는 진핵 세포 생물학 관련 질문 수많은 연구에 귀중한 도구를 제공합니다. 초파리는 기능 상실 대립 유전자를 생성하는 유전자 기법을 역 Golić 선수와 동료에 도입 될 때까지 도전 할 수 입증했다 생체 내 유전자는 초파리 1-3에 상동 재조합을 사용하여 대상. 그들은 특정 게놈 유전자 좌가 통합 된 형질 전환 구조에서 DNA의 선형 조각을 사용하여 대상이 될 수 있습니다 보여 주었다. 이 선형 "기증자"DNA는 meganuclease I-SCEI와 선형화 다음 FRT-매개 재조합 (소비세에 원형의 분자와 같은 염색체에서 DNA)를 통해 생체 내에서 생성됩니다. 이 방법이 성공적으로 정의 된 병변의 다양한 생성하는 데 사용되었습니다 있지만, 기술은 병렬로 다수의 유전자의 조작에 쉽게 확장되지 않았기 때문에 각 indivi이중 녹아웃 구조는 독특하고 사용자 정의 디자인을 필요로합니다. 예를 들어, 완벽하게 고전적인 제한 효소 / 결찰 복제 또는 PCR뿐만 아니라, 생체 내 변환 벡터 전통의 크기 제한을 사용하여 체외에서 DNA (> 5 개 KB)의 큰 조각을 조작하는데 어려움은 종종 대상 상동 재조합의 신속한 생성을 방해 벡터. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 끝 아웃 유전자가 효율적이고 비교적 빠른 플랫폼을 구축하는 방법론을 대상으로, DNA의 최대 100KB의 하위 복제 및 transgenesis 수 있습니다 recombineering / transgenesis P [acman] 시스템을 결합하는 초파리 유전자 타겟팅 용이하게합니다.
재조합 - 중재 유전 공학 (recombineering)는 4,5 강력한 상동 재조합 기반의 복제 기술입니다. 기존의 제한 효소 / 리가 복제 대조적으로, recombineering는 순서 나 SIZ에 의해 제한되지 않는다조작 된 DNA의 전자. Recombineering는 특별한 E.를 사용 결함 λ prophage 4에서 제공하는 재조합 기계를 품고 대장균 균주. 이 기술은 최근 초파리 6.7에서 사용하기 위해 채택되었다. 초파리에 Recombineering은 P [acman] 6,7이라고 수정 조건부 증폭 세균 인공 염색체 (BAC) 벡터에 의존합니다. OriV, 시퀀싱 및 배아 주입 기저 상태에서 낮은 사본 번호를 유지 오리스에 필요한 DNA의 대량의 정화를위한 화학 유도에 높은 사본 번호가 생성이 벡터는 두 가지 복제 기원을 수행합니다. 또한, P [acman] 벡터는 세균 첨부 (attB) 사이트가 장착되어 있습니다. attB 사이트는 초파리 게놈 8,9에서 소정의 방문 사이트에 큰 DNA 조각의 설립을 허용 ΦC31 integrase-매개 transgenesis위한 기판 역할을합니다.
우리는 끝 아웃 상동 재조합 10,11에 대한 대상 벡터로 사용할 수있는 P [acman] 벡터 (P [acman]-KO 1.0라고도 함) 생성 한. 시스템에 타겟팅 기술을 통합하는 끝을 밖으로 유전자, 우리는 2 FRT와 두 개의 I-SCEI 사이트를 추가했습니다. 우리는 또한 P [acman]-KO 1.0에 상동 팔을 통합하는 프로세스를 간소화하기 위해이 수정 된 벡터 내의 게이트웨이 카세트를 포함했다. 이 대상 벡터에 관심 거의 모든 게놈 영역을 소개하는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서 우리는 P [acman]-KO 1.0 및 방법 내생 현장을 대상으로 생체 내에서이 벡터를 동원하는 방법을 사용하여 대상 벡터를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해 우리는 관심의 유전자를 대체하기 위해 RFP / 칸 카세트를 사용하지만 항생제 선택 마커를 포함하는 카세트의 다양한이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 우리는 카세트의 집합에 대한 설계하고 성공적으로 사용했습니다유전자 교체 및 태그 10,11.
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Protocol
1. BAC의 선택하고 대상 지역
- 관심의 유전자 (GOI) (여기 CG32095가 예제로 사용)에서 CG32095 검색으로 BAC를 취득 www.flybase.org . 섹션 주식 및 시약에서 CG32095을 포함 세기관지은 "게놈 클론"이라는 섹션을 확인합니다. BAC 적어도 10킬로바이트 상류와 5킬로바이트 관심 하류 유전자가 포함되어 있는지 확인합니다. 또한, P [acman] 벡터 7 클론도에서 찾을 수 있습니다 http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
- BAC 클론 DH10B 세포에 와서 P [acman] 클론 EPI300 세포에서 온다. 게놈 클론 recombineering에 대한 의무이다 SW102 세포로 변환해야합니다. "더러운 minipreps는"시작 (열을 사용하여 이소프로판올을 사용하여 DNA를 침전하지 않고 Qiagen의 miniprep) 수행5 ML O / N 문화 BAC를 포함하는 세포를 접종. dH보다 2 O 20 μL에서 갓 만든 DNA 펠릿 다시 중단 후 dH보다 2 O의 100 μL로 1 μl를 희석 electrocompetent SW102를 electroporate 위해 1 μL를 사용합니다. electrocompetent SW102는 다음과 같은 프로토콜을 사용 만들려면 :
- LB 4 ML로 SW102 세포를 접종한다. 32에 문화를 성장 ° CO / N 250 rpm으로 흔들어 중요 :. 재조합 기계의 유도가 필요한 경우를 제외하고 SW102 세포가 32 ° C보다 높은 온도에 노출해서는 안됩니다.
- 44 ML의 LB에 포화 SW102 문화 1 ㎖를 접종하고 0.2 ~ 0.3 (보통 약 1.5 시간) 사이의 OD 600에 32 ° C 통에 성장. 주 : 다른 recombineering 프로토콜에 작은 볼륨 문화를 성장 추천 OD 600 0.6-0.7, 그러나 큰 볼륨에서 낮은 밀도 박테리아 성장을 상당히 변화 efficie을 증가NCY 12. 또한이 수정 대기 시간을 줄일 수 있습니다.
- 5 분 얼음 물 슬러리의 문화를 냉각. 중요 : 다음 단계에서 세포는 저온에서 보관해야합니다. 이것은 좋은 품질 electrocompetent 세포를 얻기 위해 매우 중요합니다.
- 10 분 1,500 XG에서 4 ° C에서 문화를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 감기의 25 ML (4 ° C) 10 % 글리세롤 13 펠렛을 씻으십시오. 첫째, 얼음 - 물 슬러리 튜브를 두드리고 소용돌이 별 5 ML에있는 세포를 resuspend (최대 피펫 DOWN하지 마십시오)하고 나머지 10 % 글리세롤 (20 ML)를 추가합니다.
- 10 분 1,500 XG에서 4 ° C에서 원심 분리, 상층 액을 버리고 25 ML 얼음 차가운 10 % 글리세롤 펠렛를 두 번 씻는다.
- 10 분 1,500 XG에서 4 ° C에서 원심 분리, 상층 액을 버리고 25 ML 얼음 차가운 10 % 글리세롤 펠렛에게 세 번 씻는다.
- 10 분 1500 XG에서 4 ° C에서 원심 분리기 먹다 폐기ernatant. 세포 펠렛이 시점에서 매우 느슨 때 폐기 상층 액을주의해야한다. 차가운 10 % 글리세롤 1 ㎖에 펠렛을 resuspend을. 1.5 ML 튜브에 세포를 전송하고 4 ℃에서 탁상의 microcentrifuge에 12,000 XG에서 30 초 동안 원심 분리 글리세롤 / 세포의 ≈ 90 μl를 떠나 상층 액의 대부분을 폐기하십시오. 세포는 이제 electroporation하여 준비가. 주 :이 시점에서 세포 ° C 나중에 사용하기 위해 -80에 저장할 수 있습니다. 그러나,이 능력이 저하 될 수 있습니다.
- 1,800 V, 25 μF, 200 Ω을 1mm 큐벳을 사용하여 세포에 DNA를 Electroporate. 일렉트로 후, SOC의 300 μl를 추가하고 32에서 세포가 2 시간 동안 복구 할 ° C (흔들림이 필요하지 않습니다). 플레이트 LB 한천의 셀 플러스 25 ㎍ / ㎖ 클로람페니콜 (또는 변형 BAC 또는 PAC에 따라 다른 적절한 항생제)와 24-30 시간 동안 32 ° C에서 알을 품다.
- 표적 유전자 상동 팔은 선택에 의해 설계되었습니다ING 상류 게놈 DNA 10 KB입니다 GOI 하류 상대 5킬로바이트 10킬로바이트의 끝에서 500 bp의 및 증폭하는 5킬로바이트 상동 암 (섹션 2 참조)을 선택합니다 (그림 1). 이 500 bp의 단편은 P [acman] KO 1.0에 GOI을 둘러싼 게놈 영역을 재결합하는 데 사용되는 상동 팔 역할을합니다. 이 조각은 상동 암 '하류 3에 해당하는 지역의 상동 팔과 오른쪽 팔 (RA)'상위 5에 해당하는 지역 왼쪽 팔 (LA)이라고합니다. 중요 : 상동 팔 BamHI을 포함 할 수 없습니다 제한 사이트는 플라스미드의 선형화로 (단계 3.2) BamHI 제한 다이제스트를 통해 수행됩니다.
2. P [acman]-KO 1.0에 상동 팔을 삽입
- 두 개의 개별 PCR 반응을 설정하고, 하나는 RA를 증폭하기 위해 LA와 다른 증폭 할 수 있습니다. LA를 들어, 프라이머 attB1-I-SCEI-LA-F와 BamHI-LA-R을 사용하여 프라이머 BamHI-RA-F와 attB2-I-SCEI-RA-R을 사용하여RA (표 1)를 증폭한다. 단계 1.2 템플릿으로 관심 BAC를 포함한 삶은 하룻밤 세균성 문화의 0.5 μL에서 BAC DNA 1 μL를 사용합니다. 기능을 교정와 DNA 중합 효소를 사용하십시오. 이 단계 2.8과 3.13의 PCR 검사를 제외하고 중합 효소 연쇄 반응 - 모든 이후에 적용 참고 :. 교정 DNA 중합 효소에 대한 연장 시간은 제조 업체에 따라 정기적으로 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 다를 수 있습니다. 15 초 / KB의 비율로 중합 PfuUltra II 퓨전 HotStart는 다음 단계에서 사용할 수 있습니다.
LA / RA PCR
PCR 조건1 μL 혈중 알코올 농도의 단계 1.2에서 더러운 miniprep에서 DNA 0.25 μl를 각 20 μM 뇌관 2.5 μL 10X PfuUltra II 버퍼 825 μL 10MM (각) dNTP 0.5 μL PfuUltra II 퓨전 HotStart의 DNA 중합 효소 19.75 μL 물 25 μL 총 양 STEP1 효소를 활성화하기 위해 95 ° C 2 분 STEP2 95 ° C 20 초 변성 STEP3 60 ° C 20 초 어닐링 4 단계 72 ° C 20 초 연장 STEP5 2 단계 29주기를 반복하려면 이동 STEP6 4 ° C 유지 - 1 % 아가로 오스 겔에서 샘플을 실행하고 Zymoclean DNA 복구 키트를 사용하여 제품을 추출합니다. 멸균 물 10 μL와 Zymoclean 열에서 DNA를 용출.
- (PCR S 확장을 중복하여 접합을 수행2.2 (그림 2)에서 정제 된 각 증폭 제품에서 전체 DNA의 10-30 NG를 사용하여 두 조각에 OE). 이것은 일반적으로 주변에 각각의 정제 된 PCR 제품의 1 / 20 일입니다 :
LA / RA PCR-SOE
PCR 조건0.5 μl를 각 LA와 RA 정제 된 PCR 산물을 약 10-30 NG 0.25 μl를 각 20 μM 뇌관 2.5 μL 10X PfuUltra II 버퍼 825 μL 10MM (각) dNTP 0.5 μL PfuUltra II 퓨전 HotStart의 DNA 중합 효소 19.25 μL 물 25 μL 총 양 STEP1 효소를 활성화하기 위해 95 ° C 2 분 STEP2 95 ° C 20 초 변성 STEP3 55 ° C 20 초 (어닐링을 팔 수 있도록 낮은 온도.) 어닐링 4 단계 72 ° C 20 초 연장 STEP5 2 단계 1주기를 반복하려면 이동 STEP6 95 ° C 20 초 변성 STEP7 60 ° C 20 초 어닐링 STEP8 72 ° C 20 초 연장 Step9 2 단계 27주기를 반복하려면 이동 Step10 4 ° C 유지 - 아가로 오스 겔에 PCR 샘플을 실행하고 젤 추출하여 1.0 KB 밴드를 복구 할 수 있습니다. 이 attB1-LA-BamHI-RA-attB2 카세트입니다.
- 제조업체에서 제공하는 프로토콜에 따라 BP 반응을 설정할 게이트웨이 BP ClonaseII 효소 키트를 사용합니다.2.4에서 생성 된 카세트 기증자의 DNA를 대상 벡터로 P [acman]-KO 1.0 역할을합니다.
- 차가운 10 % 글리세롤 또는 차가운 dH보다 2 O의 30 μl를 추가하여 TransforMax EPI300 electrocompetent 세포의 50 μl를 희석 제조업체에서 제공하는 프로토콜에 따라 electrocompetent 세포에 BP 반응 1 μl를 변환 할 수 있습니다. 물을 첨가 일렉트로 동안 전기 방전 (아크)를 방지하기 위해 BP 반응의 매우 높은 염분 농도를 희석. 1,800 V, 25 μF, 200 Ω을 1mm 큐벳을 사용하여 세포에 DNA를 Electroporate.
- SOC의 300 μl를 추가하고 37 세포는 1 시간 동안 복구 할 ° C (흔들림이 필요하지 않습니다). 플레이트 LB-한천의 셀 + 앰프 (P [acman]-KO 1.0 앰프 저항성 유전자를 포함)의 50 ㎍ / ㎖. 18-24 시간 동안 37 ° C에서 번호판을 품어.
- PCR은 P [acman]-KO 1.0 (그림 게이트웨이 카세트 하류 T3 (T3 시퀀스를 사용하여 기존의 식민지 PCR에 의한 개별 식민지를 확인URE 1)과 attB1-I-SCEI-LA-F 프라이머. 긍정적 인 클론 1.2 KB에서 실행 밴드를 표시합니다.
- 50 ㎍ / ㎖ 암피실린과 LB에 긍정적 인 클론의 야간 문화를 성장.
- 50 ㎍ / 제조 업체의 프로토콜 (에피)에 따라 복사 제어 솔루션을 사용하여 ML 암피실린 문화 10 ㎖의 LB의 LA와 RA를 포함하는 P [acman]-KO 1.0 벡터를 증폭.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 Qiagen의 miniprep을 수행합니다.
3. P [acman]-KO 1.0에 관심 게놈 지역 재결합
1 일
- LB 4 ML 플러스 25 ㎍ / ㎖ 클로람페니콜 (클로로필) 또는 적절한 선택 항생제에 관심 BAC를 포함한 SW102 세포를 접종한다. 32에 문화를 성장 ° CO / N 250 rpm으로 흔들어. 중요 : 고온 재조합 엄마 활성화로 게다가 단계 3.5 유도시, SW102 세포는 32 ° C보다 높은 온도에 노출되지 않도록이러한 세포의 고장난 경우.
2 일
- P [acman]의 다이제스트 0.4 μg을 25 μl의 반응에 BamHI의 ≈ 20 단위와 섹션 2에서 생성 된 LA와 RA 팔을 함유-KO-1.0. 최소 3 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. 중요 : 긴 소화가 모든 DNA의 분해를 보장하는 것이 중요합니다. 이 나중에 오탐 (false positive) 클론의 수를 감소합니다.
- 44 ML LB-엽록소 (25 ㎍ / ㎖)로 포화 SW102/BAC 문화 1.0 mL를 접종하고 0.2 ~ 0.3 (보통 약 1.5 시간) 사이의 OD 600에 32 ° C 통에 성장합니다. 비 HS 제어를위한 추가적인 동일한 샘플을 포함합니다. 이 샘플은 단지 HS를 제외한 모든 단일 측면에서 실험처럼 취급됩니다. 이 아닌 열 충격 문화는 부정적인 제어 역할을합니다. 비 HS 제어 플레이트 (단계 3.13)에 많은 식민지의 모양은 일반적으로 소화 P [acman] KO 1.0 LA로 변환을 나타냅니다플라스미드 / RA.
- 문화가 성장하는 동안, 젤에 BamHI 제한이 P [acman]-KO를 실행합니다. 그런 다음 젤 추출 물 10 μL의 DNA를 용출은 55 예열 ° C. 주 : 버퍼에 DNA를 용출하지 마십시오. 버퍼에 존재하는 염 일렉트로 동안 방전의 원인이 될 수 있습니다.
- 물을 욕조에서 정확히 15 분간 ° C 42의 열 충격 문화. 이 SW102 세포의 recombineering 기계를 활성화합니다. 충격에게 컨트롤 문화를 가열하지 마십시오.
- 후 즉시 열 충격, 전송 열 충격 및 비 HS 제어 문화 냉장 50 ML 표준 튜브에 5 분간 얼음 - 물 슬러리 문화 침착하자. 중요 : 다음 단계에서 세포가 낮은 온도에서 보관해야합니다 . 이것은 좋은 품질 electrocompetent 세포를 얻기 위해 매우 중요합니다.
- 10 분 1,500 XG에 문화를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 감기의 25 ML (4 ° C) 10 % 글리세롤 13 펠렛을 씻으십시오. 첫째,얼음 물 슬러리 (UP 피펫 DOWN하지 마십시오)하고 나머지 10 % 글리세롤 (20 ML)를 추가로 튜브를 두드리고 소용돌이에 5ml에 세포를 resuspend을.
- 10 분 1,500 XG에서 4 ° C에서 원심 분리, 상층 액을 버리고 25 ML 얼음 차가운 10 % 글리세롤 두 번째로 펠렛을 씻으십시오.
- 10 분 1,500 XG에서 4 ° C에서 원심 분리, 상층 액을 버리고 25 ML 얼음 차가운 10 % 글리세롤 세 번째로 펠렛을 씻으십시오.
- 10 분 1,500 XG에서 4 ° C에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 세포 펠렛이 시점에서 매우 느슨 때 폐기 상층 액을주의해야한다. 차가운 10 % 글리세롤 1 ㎖에 펠렛을 resuspend을. 1.5 ML 튜브에 세포를 전송하고 4 ℃에서 탁상의 microcentrifuge에 12,000 XG에서 30 초 동안 원심 분리 . 물 / 세포 주 ≈ 90 μl를 떠나 상층 액의 대부분을 폐기 :이 시점 세포에서 -80 ° C 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. 그러나,이 능력이 저하 될 수 있습니다.
- 2 μl를 추가 BamHI-소화 P [acman] (50 NG에 대한 목표) 세포와 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 섞는다. 1mm electroporation의 쿠 베트에 세포를 전송 및 1,800 V, 25 μF, 200 Ω에서 electroporate.
- SOC의 300 μl를 추가하고 32에서 세포가 2 시간 동안 복구 할 ° C (흔들림이 필요하지 않습니다). 플레이트 LB 한천의 셀 플러스 24-30 시간 동안 32 ° C에서 50 ㎍ / ㎖ 암피실린 및 부화.
3 일
- 적절한 간격 수선하여 식민지 PCR을위한 화면입니다. RA와 T7과 LA (표 1)에 대한 LA 체크 프라이머 프라이머를 확인 T3 및 RA 사용합니다. PCR-체크 RA 및 대상 지역으로 PCR-체크 LA 프라이머 100-200 BP (표 1)을 디자인합니다. . T3 또는 T7과 PCR-체크 LA와 PCR-체크 RA를 사용하여 PCR 반응에서 긍정적 인 식민지 800-1,000 BP (그림 3) 주에서 실행 밴드를 표시합니다 : 그것은 하나의 법인 설립 이후 두 팔을 테스트하는 것이 중요합니다 팔그러나 다른되지는 때때로 관찰된다.
- LB +50 ㎍ / 밤새 ML 암피실린 4 ㎖에 32 ° C에서 PCR-검증 식민지를 성장. 나중에 사용하기 위해이 세포의 냉동 재고를 확인합니다.
4. 대상 카세트 게놈 지역 교체
4 일
- 템플릿 5'HA - RFP / 칸-F와 3'HA - RFP / 칸-R 프라이머 (로 pENTR-RFP/KAN을 (선형화 ASCI 및 NHEI으로 predigested)를 사용하여 PCR에 의한 RFP / KAN 녹아웃 카세트를 증폭 표 1). RFP / KAN 카세트 기준 11 일부터 요청하실 수 있습니다.
- 젤 멸균 물 20 μL의 용출 PCR 제품을 정화. RFP-KAN 카세트 플러스 상동 팔 3킬로바이트 주위를 실행해야합니다.
- 44 ML LB-앰프 (50 ㎍ / ㎖)로 포화 SW102 / P [acman]-KO 문화 (단계 3.13) 1 ㎖를 접종하고 ° C 통 OD 600 0.2 ~ 0.3 사이의 32에 성장합니다. 비 HS 제어를위한 추가적인 동일한 샘플을 포함합니다. 이 샘플은 바로 처리됩니다HS를 제외한 모든 단일 측면에서 실험 같은.
- SW102 / P [acman]-KO 문화가 원하는 농도에 도달하면, 3.5에서 3.10 단계를 수행합니다.
- electrocompetent SW102 / P [acman]-KO 세포의 90 μL에 카세트를 대상으로 약 100 NG를 Electroporate. 1mm electroporation의 쿠 베트에 세포를 전송 및 1,800 V, 25 μF, 200 Ω에서 electroporate. SOC의 300 μl를 추가하고 세포가 32에서 2 시간 동안 복구 할 수 있습니다 ° C (흔들림이 필요하지 않습니다). 주 : 그것은 매우 카세트를 정화 신선한 젤을 사용하는 것이 좋습니다.
- LB 한천 + 앰프 (50 ㎍ / ㎖) + 칸 (50 ㎍ / ㎖) 및 32에서 24-30 시간 동안 품어 ° C.에 플레이트 세포
5 일
- 32 ° CO / N.에서 5 개의 다른 식민지에서 문화 5 mL를 성장
6 일
- "더러운 miniprep"를 수행하고 홍보를 찾기 위해 1 % 아가로 오스 겔에서 얻은 DNA의 절반을 실행플라스미드 저 분자량 esence. 우는 소리 12킬로바이트를 실행하는 모든 플라스미드이 없어야합니다. (그림 4)
- 긍정적 인 클론에서 DNA의 1:500 희석을 확인하고 TransforMax EPI300 50 μL로 electroporate을 1 μL를 사용합니다. 중요 : 하나의 셀에 여러 플라스미드의 일렉트로을 방지하기 위해 DNA를 희석해야합니다. LB 한천 + 앰프 (50 ㎍ / ml)에 플레이트 세포 + 칸 (50 ㎍ / ㎖) 37시 18 ~ 24 시간 동안 품어 ° C
7 일
- LB의 + 10ml에 단일 콜로니를 접종하고 O / N. 성장
8 일
- 단계 4.10에서 포화 문화 LB 미디어의 씨앗 100 ML. 적절한 항생제 플러스 5-6 시간 동안 37 ° C에서 1,000 X 복사 제어 솔루션과 부화의 100 μl를 추가합니다.
- maxiprep를 수행하고 시퀀싱하여 올바른 사이트에있는 카세트의 삽입을 확인합니다.
- 순서뿐만 아니라, 제한 enzym을 수행모든 저 분자량의 플라스미드와 그 부모의 DNA가 포함되어 있지 않습니다 복제에서 DNA와 전자 소화 시험. 선택한 제한 효소는 각각의 유전자 다를 수 있지만 목표는 recombineered 벡터의 특성을 조사를 허용 효소의 그룹을 찾을 수 있습니다. 예 방식으로, CG32095 타겟팅 벡터는 연속적 PACI, ASCI, BamHI 및 AatII로 소화했다. 잘못된 밴드의 예측 밴드 부재의 외관은 대상 벡터가 제대로 (그림 5) recombineered되었음을 확인합니다.
5. 파리를 주입하고 생체 내에서 카세트 테이프를 동원
- 선택의 미리 정의 된 방문 사이트에, ΦC31 integrase를 사용하여 카세트를 삽입. 같은 무지개 트렌스 제닉 (같은 외부 공급 업체, http://www.rainbowgene.com가 ) 주입 서비스를 사용할 수 있습니다. 중요 : DNA 갓 P 있어야합니다주입 전에 안고쳐. 높은 변환 효율은 DNA가 현장에서 준비 될 때 관찰하고 같은 날에 주입된다.
- 방문 사이트에서 카세트를 동원, 블루밍턴 재고 수 25680 또는 25679을 사용합니다. 이 주식은 각각 염색체, 둘, 셋,에 열 충격 프로모터의 Flippase 및 I-SCEI 하류가 포함되어 있습니다. 또한, 그들은 균형 염색체와 Y 염색체에 HS-HID 유전자를 포함합니다. 선택한 주식에서 남성을 수집하고 착륙에 KO 카세트를 들고 처녀 암컷을 교차. . 세트 ~ 30 십자가 여성 2 ~ 3 일 동안 알을 낳기 위해 수 주 : 대상 현장에서 다른 염색체에 주식을 선택하는 것이 좋습니다.
- 플립 30 병의 새로운 집합으로 부모, 3 일 연속 1 시간 37 ° C에서 열 충격 유충, 하루에 두 번. 열 충격 효소의 생산을 활성화, flippase 및 I-SCEI, 및 세포 사멸 유전자는 숨겨
- 열 충격 파리의 F1 자손의 처녀 암컷을 수집하고, y로 교차 - w - 남성. 세 처녀와 크로스에 세 남성, 150-200 십자가에 대한 목표로하고 있습니다.
- 눈에 RFP를 감지 할 수있는 형광 범위에 F2 자손을 화면. 흰색과 노란색 유전자 (- w - y)에 돌연변이 있습니다 RFP 긍정적 인 눈을 화면. 이 심사 과정에 긍정적 RFP 카세트의 존재를 선택하고 야생형 노란색 유전자를 참고로 표시되어 P [acman] 벡터 (미니 화이트) 및 방문 사이트의 부재에 대한 선택 :. 그것은 더 적은 시간입니다 사기꾼YW 파리에 대한 첫 번째 화면보다 눈에 RFP에 대한 화면 suming. W - - 파리 동원 이벤트는 Y에 비해, 눈에 RFP를 포함한 많은 적은 파리의 결과로, 열 충격시 매우 효율적입니다.
- 각 동원 이벤트가 다를 수 있기 때문에, RFP + 비행 - w - 각 Y와 한 쌍의 교배를 설정합니다. 정확한 염색체에 RFP를 매핑합니다. 정확한 염색체 타겟팅은 일반적으로 케이스의> 95 %에서 관찰된다.
- 주식을 수립하고 남부 오점 분석을위한 표준 기술을 사용하여 올바른 대상 이벤트를 확인합니다. 2킬로바이트 프로브 상류 (왼쪽 팔)와 하류 (오른쪽 팔) 유전자가 타겟이되고, 그리고 삭제 된 ORF에 걸쳐 2킬로바이트 (또는 필요한 경우 더 짧은) 디자인. 처음 두 프로브는 ORF가 동형 접합 녹아웃에 밴드를 양보하지 않을 때 즉, 야생형에 존재하지 않는, 동형 접합과 이형 녹아웃에 밴드를 얻을 것입니다. 빠른 PCR F또는 ORF도 가능하지만이 밴드의 부재에 의존합니다.
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Representative Results
LA와 RA 상동 팔의 증폭은 500 bp의 제품을 생산해야하며, PCR-SOE 반응은 1.0 KB 제품 (섹션 2.1-2.4; 그림 2) 산출해야한다. 2.5 절에서 수행 BP 반응은 일반적으로 제품의 수율 평균 5-100 식민지의 매우 효율적이고 세균의 변형이다. 거의 PCR로 테스트 한 모든 식민지는 예상 PCR 제품 표시를 선택하십시오.
recombineering의 첫 번째 라운드 (3 절) 동안 소화 P의 변환 후 20-40 식민지를 얻을 것으로 예상 [acman] SW102 세포로 LA와 RA 팔을 포함하는-KO-1.0. 이러한 클론 40-60 %가 원하는 재조합 제품을 수행한다. 모든 식민지가 같은 열 충격 세포에 비해 경우 비 열 충격 컨트롤은 거의 포함해야합니다. 샘플 및 제어 플레이트 모두 식민지의 같은 번호의 모양은 일반적으로 포경 플라스미드의 존재 또는 다른 오염 물질을 나타냅니다. 이 경우, 실험 수오LD는 삭제 및 반복, P [acman]을 소화 이번 단계 3.2에서 설명한 지시에 따라 완료 LA와 RA 팔을 들고-KO-1.0. ≈ 60 식민지을 얻은 P [acman]-KO 1.0에 관심 게놈 영역 검색을위한 PCR 검사의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 식민지 여기에 60 %가 원하는 재조합 product.Care가 탈선 PCR 밴드는 일반적으로 잘못된 recombineering 이벤트를 나타 내기 때문에 관찰 된 PCR 제품은, 예상 크기에서 실행되는주의해야 실행 테스트했습니다.
때때로 아무 식민지 recombineering의 첫 번째 라운드에서 성장하지 않습니다. 하위 최적의 효율성과 세포를 사용하여 실패한 recombineering 반응에 대한 가장 일반적인 원인을 나타냅니다. 세척하는 동안 자신의 준비와 부드러운 핸들링 (NEVER 소용돌이) 동안 항상 감기 세포를 유지하는 고품질의 유능한 세포를 얻기 위해 중요합니다. 항상 사용하려고 갓 소화 / P [acman]-KO-정제1.0 DNA 가장 높은 효율을 얻을 수 있습니다.
때때로 recombineering 수익률 식민지 그러나 그 식민지의 첫 번째 라운드 PCR 검사 시험을 통과하지 않습니다. 이것은 일반적으로 잘못된 recombineering 제품을 의미하지만, 이러한 결과는 프라이머 세트 중 하나에 잠재적 인 문제를 나타낼 수 있습니다. PCR-체크 LA 프라이머를 확인하려면, attB1-I-SCEI-LA-F와 함께 PCR 반응을 설정합니다. PCR-체크 RA는 attB2-I-SCEI-RA-R과 PCR 반응을 설정합니다. 확인하려면 두 경우 모두 템플릿으로 원래의 BAC를 사용합니다. 이러한 PCR 반응은 체크 프라이머의 순서에 따라 달라집니다 예상 크기의 제품을 얻을 것이다. 이 컨트롤 실험에서 긍정적 인 결과가 긍정적 인 클론을 감지하는 무능력 프라이머 비 효율성에 의한 가능성을 배제 할 것이다.
당신은 어떤 성공을하지 않고 위의 프로토콜에 따라 여러 번 recombineering의 첫 라운드를 시도하고 모두를 수행 한 경우컨트롤을 제안, 우리는 500 BP의 상동 팔의 새로운 쌍을 선택하는 것이 좋습니다. 현 시점에서 명확하지 않은 이유로 일부 게놈 지역은 DNA 재조합이 뛰어납니다. 단순히 새로운 동성 팔을 설계하고 그 유전자를 향해 또는 멀리에서 그들을 이동 때로는 이러한 문제를 해결합니다.
recombineering의 두 번째 라운드 (4 절)는 일반적으로 훨씬 더 효율적입니다. 일반적으로 30-50 식민지가 원하는 구조를 포함하는이 90 ~ 95 %를, 변환 후 관찰된다. 이 단계에서 가장 일반적인 문제는 양성 식민지를 획득합니다. 그림 4는 recombineering의 두 번째 라운드 (4 절) 후, 참과 거짓 긍정적 인 클론의 예를 보여줍니다.
그림 1. P의 도식로웠는 P [acman]를 생성하는-KO 1.0 대상 벡터입니다. 장 등의 수정. (2012). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. PCR (PCR SOE)는 2.3 단계에서 수행 겹쳐서 접합의 회로도. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 첫 번째 recombineering 이벤트 겔 보여주는 효율성을 PCR-체크 각 차선이 하나의 식민지를 나타냅니다 :.. 식민지 왼쪽 팔을 테스트. T7과 LA-체크 프라이머를 사용하여 통합 B :. T3 및 RA 점검 primers.1kb 플러스 DNA 사다리는 분자량 마커로 사용되었다를 사용하여 주 오른팔 통합 테스트와 동일 식민지 : T3 가난한 프라이밍로 인해 T7에 비해 프라이머, 오른쪽 팔 검사의 대역이 상당히 어둡게했다. 젤을 볼 때이 고려되어야한다.
그림 4. DNA 아가 로스 젤 DNA는 4 잠재적 인 긍정적 인 클론입니다. 고 분자량 플라스미드 (P [acman])와 recombineering의 두 번째 라운드 후 잠재적 인 긍정적 인 클론에서 분리 된 저 분자량 플라스미드를 (소화되지 않은 템플릿) 하였다 보여주는 1 % 아가 로스 젤에서 실행 ethidium의 브로마이드로 염색. 클론 1,3과 4는 참 긍정적 인 클론입니다. 클론 2는 AP의 모든 형태에 주목 거짓 긍정적이다 lasmid 그 우는 소리 12킬로바이트을 (DNA 사다리 차선에서 가장 큰 사이즈 밴드) 실행됩니다. 1킬로바이트 플러스 DNA 사다리는 분자량 마커로 사용되었다.
그림 5. 제한 효소 소화가 원하는 재조합 이벤트에 대한 테스트합니다. 위의 예에서는이 표시됩니다 컴퓨터 예측-KO CG32095 전에 recombineering의 두 번째 라운드 후 P [acman]의 줄무늬 패턴입니다. 네 가지 효소가 사용되었다 : PACI, ASCI, AatII 및 BamHI합니다. 제대로 재결합 제품은 의도 된 변화 (화살촉)를 제외하고는 부모의 P [acman]-KO CG32095와 같은 밴드를해야합니다. NEBcutter V2.0은 밴드 패턴을 예측하는 데 사용되었다.
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생체 내 표적 카세트의 동원을 설명하는 그림 6. 회로도. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
표 1. 프라이머. 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
생물 의학 연구에서 유전자 모델 생물의 힘은 크게 유전 조작을 위해 사용할 수있는 도구를 기반으로합니다. 작은 모델 C. 특히 엘레과 초파리는 다세포 개발이나 기능에 연루 전체 경로와 유전자 가족의 저렴하고 빠른 분자 유전 학적 분석을 허용합니다. 최근 몇 년 동안 초파리 14,15의 유전자를 조작하기위한 도구 개발에 상당한 진전을 보았다. 예를 들어, 널리 혈중 알코올 농도의 DNA 구조를 조작하는 마우스 유전학에서 사용되는 recombineering은 최근 P [acman] 벡터와 ΦC31 매개 transgenesis 6의 사용을 통해, 초파리에 맞게되었다. 다른 선택의 카세트 재조합 능력이 박테리아 4,13를 사용하여 구조 내의 아무 곳이나 특정 서열의 삽입 또는 삭제 할 수 있습니다. 우리가 수정 한 원래 P [acman]가 구성을 위해 사용할 수 있도록 벡터
여기에 설명 된 방법 중 가장 간단하지만, 우리는이 기술의 성공을 위해 중요한 발견 몇 가지 단계가 있습니다. 조작 된 DNA (> 15킬로바이트)의 크기로 인해, recombineering 반응의 첫 번째 라운드 (3 절)은 중요한 기술적 장애물을 포즈. 따라서, recombineering이 라운드는 매우 효율적인 재조합 프로토콜을 필요로합니다. 낮은 밀도로 세포를 성장 대신 두 대신 dH보다 2의 10 % 글리세롤을 가진 세포를 세 번 세척과 같은 겉보기에 사소한 프로토콜 조정 </ 서브> O 13, 크게 우리의 recombineering 유능한 셀의 변환 효율을 개선했습니다. 또한, 확인을 돌보는 LA / 포함 RA P [acman] BamHI은 (단계 3.1) 많은 잘못된 반응을 제거와 함께 완료로 절단됩니다.
바람직하지 않은 재조합 이벤트 recombineering 동안 또 다른 매우 일반적인 문제를 나타냅니다. 예를 들어, 우리는 다양한 구조 내에서 중복 및 전좌의 사례를 관찰했다. 이러한 이벤트는 초파리 변환하는 동안 및 대상 생체 내 유전자에 여러 문제가 발생할 수 있습니다. PCR 검증 및 염기 서열 분석은 이러한 모든 이벤트를 감지 할 수 없습니다. 따라서 제한 효소 분석은 배아에 DNA를 주입하기 전에 최종 복제 제품에서 수행해야합니다. 이 최종 점검이 중요 입증하고 우리가 원하지 않는 수차를 포함하는 구조를 주입 방지 할 수있다.
그냥 주사하기 전에 대상 벡터 맥시 준비하고ection 및 DNA를 동결 결코 크게 초파리에 이러한 대형 구조의 변환 효율을 향상시킵니다. 즉, 작은 세부 사항이 기술의 성공에 큰 차이를 만든다. 프로토콜은 설명 다른 소스와 우리 자신의 경험들로부터 통찰력을 나타냅니다 여기에서 보여 주었다.
우리가 여기에 제시 프로토콜은 자신의 실험실에서 recombineering 방법을 채택하는 다른 사람을 도움이되기를 바랍니다 동안, 우리는 방법을 추가로 개선 및 분류가 가능하다 생각합니다. 때때로, 특정 게놈 조각이 완전히 명확하지 않은 이유로 recombineering을 사용하여 조작하기가 어렵습니다. 또한, 원치 않는 배경을 제거하기 위해 최선의 노력에도 불구하고, 우리는 여전히 게놈 DNA의 특정 조각이 잘못 recombineered 최종 제품을 생산하는 경향이 찾을 수 있습니다. recombineering 프로세스의 깊은 이해의 미래 공개 토론에 더 많은 최적의 프로토콜을 얻을 수 있습니다실패와 성공 스토리를 recombineering하는 폭 넓은 연구 공동체하여 이러한 강력한 기술의 성공적인 사용을 촉진 할 것이다.
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Disclosures
저자는 여기에 설명 된 기술에 관해서 어떤 경쟁 이익을 가지고 있지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 휴고 Bellen 및 시약 블루밍턴 증권 센터 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 더 도움이 토론 공원 Venken, 휴고 Bellen 및 Buszczak 및 Hiesinger 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 ACR에 건강의 국립 연구소 (T32GM083831), PRH (RO1EY018884)에서 교부금에 의해와 MB (RO1GM086647), MB와 PRH (RP100516)에 텍사스의 암 예방 연구소 부여, 그리고 웰치에 대한 지원 PRH에 기초 (I-1657). MB는 생물 의학 연구 및 PRH에서 전자와 그리어 GARSON Fogelson 학술 것은 UT 남서 의료 센터에 생물 의학 연구에 유진 맥 더못 학자이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SW102 Recombination competent bacteria | NCI-Frederick | Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | Includes CopyControl induction solution |
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4001 | |
| Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak and Hiesinger Labs | Upon request | |
| Flystocks | Bloomington stock center | Stock numbers: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| Electroporation machine | Biorad GenePulser Xcell with PC module | 165-2662 | |
| Cuvettes | Fisher Brand | #FB101 |
References
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