Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering homolog rekombination konstruktioner i Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Homolog rekombinationsteknikker høj grad fremme

Abstract

Den fortsatte udvikling af teknikker til hurtig, storstilet manipulation af endogene gen loci vil udvide brugen af Drosophila melanogaster som en genetisk model organisme til menneske-sygdom relateret forskning. De seneste år har set tekniske fremskridt som homolog rekombination og recombineering. Imidlertid genererer utvetydige null mutationer eller kodning endogene proteiner fortsat en betydelig indsats for de fleste gener. Her beskriver vi og demonstrere teknikker til at bruge recombineering-baseret kloning metoder til at generere vektorer, der kan bruges til at målrette og manipulere endogene loci in vivo Konkret har vi etableret en kombination af tre teknologier:. (1) BAC transgenese / recombineering, ( 2) ender ud homolog rekombination og (3) Gateway teknologi til at give en robust, effektiv og fleksibel metode til at manipulere endogene genomiske loci. I denne protokol, giver vi trin-for-trin oplysninger om, hvordan (1) design individual vektorer, (2) hvordan man klone store fragmenter af genomisk DNA i homolog rekombination vektor hjælp hul reparation, og (3) hvordan man udskifter eller tagge gener af interesse inden for disse vektorer ved hjælp af en anden runde af recombineering. Endelig vil vi også give en protokol for, hvordan at mobilisere disse kassetter in vivo til at generere en knockout, eller et kodet gen via knock-in. Disse metoder kan nemt blive vedtaget for flere mål parallelt og give et middel til at manipulere Drosophila genomet på en rettidig og effektiv måde.

Introduction

Rengør molekylært definerede manipulationer af enkelte gener på deres endogene loci tilbyde et uvurderligt værktøj til at studere et utal af spørgsmål vedrørende eukaryot biologi. Drosophila vende genetiske teknikker til at generere tab af funktions alleler havde vist sig at være udfordrende, indtil Golic og kolleger indført i vivo gen-targeting hjælp homolog rekombination til Drosophila 1-3. De viste, at specifikke genomiske loci kan målrettes ved hjælp af en lineær DNA-fragment fra en integreret transgene konstrukt. Denne lineære "donor" DNA genereres in vivo gennem FRT-medieret rekombination (at udskære DNA'et fra kromosomet som en cirkulær molekyle) efterfulgt af linearisering med meganuclease I-Scel. Selv om denne metode er blevet anvendt til at generere en række definerede læsioner, har teknikken ikke været let skalerbar til manipulation af adskillige gener parallelt fordi hver individueldual knockout konstruktion kræver tydelig og custom design. For eksempel, ofte vanskeligheder med problemfrit manipulere store fragmenter af DNA (> 5 kb) in vitro under anvendelse af klassisk restriktionsenzym / ligering kloning eller PCR, samt størrelsen begrænsningerne ved traditionel in vivo transformationsvektorer interferere med hurtig etablering af homolog rekombination målretning vektorer. For at overvinde disse begrænsninger, kombineret vi recombineering / transgenese P [acman], der giver mulighed sub-kloning og transgenese på op til 100 kb DNA, med enderne-out gene targeting metode til at etablere en effektiv og relativt hurtige platform, letter Drosophila gene targeting.

Rekombination-medieret genteknologi (recombineering) er en kraftfuld homolog rekombination-baseret kloning teknologi 4,5. I modsætning til konventionel restriktionsenzym / ligase kloning recombineering ikke begrænset af den sekvens eller size af manipulerede DNA. Recombineering bruger en speciel E. coli-stamme, som huser rekombination maskiner leveret af en defekt λ profag 4.. Denne teknik er for nylig blevet godkendt til brug i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila bygger på en modificeret betinget opformerbart bakteriel kunstigt kromosom (BAC), vektor kaldet P [acman] 6,7. Denne vektor bærer to replikationsoriginer: oriV, som producerer høj-kopiantal ved kemisk induktion til oprensning af store mængder DNA, der kræves til sekventering og embryo injektion og oris, som opretholder lave kopiantal under basale betingelser. Derudover P [acman] vektor er udstyret med en bakteriel fastgørelse (attB) site. Den attB stedet tjener som et substrat for ΦC31 integrase-medieret transgenese der tillader inkorporering af store DNA-fragmenter ind i en forudbestemt landing site inden Drosophila genomet 8,9.

Vi har genereret en P [acman] vektor (benævnt P [acman]-KO 1.0), der kan bruges som et targeting vektor for ender ud homolog rekombination 10,11. At inkorporere ender ud gentargeting teknologi i systemet, tilføjede vi to FRT og to I-SCEI sites. Vi har også inkluderet en Gateway kassette inden for denne ændrede vektor til at strømline processen med at indarbejde homologiarmene til P [acman]-KO 1.0. Dette giver en hurtig og enkel måde at introducere næsten enhver genomisk region af interesse i målvektoren. I denne protokol vil vi beskrive, hvordan man konstruere en målvektor hjælp af P [acman]-KO 1.0 og hvordan man mobiliserer denne vektor in vivo at målrette endogene locus. Med henblik på denne protokol vil vi anvende RFP / Kan kassette at erstatte et gen af ​​interesse, men en række kassetter, der indeholder en antibiotisk selektionsmarkør kan bruges med denne protokol. Vi har designet og med held anvendt en række kassettergenudskiftning og tagging 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udvælgelse af BAC og region til Target

  1. At erhverve en AKB med genet af interesse (GOI) (her CG32095 bruges som et eksempel), søge efter CG32095 på www.flybase.org . Under afsnittet lagre og reagenser, tjek afsnittet "genomkloner" for AKB indeholder CG32095. Sørg for, at BAC omfatter mindst 10 kb opstrøms og 5 kb nedstrøms genet af interesse. Alternativt kan kloner i P [acman] vector 7 også findes på http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. BAC kloner kommer i DH10B celler og P [acman] kloner kommer i EPI300 celler. De genomiske kloner skal omdannes til SW102-celler, som er modtagelig for recombineering. "Dirty minipreps" udføres (a Qiagen miniprep uden anvendelse af en søjle og udfældning af DNA'et under anvendelse af isopropanol) startfra en 5 ml O / N-kulturen inokuleret med celler indeholdende BAC. Efter re-suspension af frisklavet DNA pellet i 20 ul dH 2 O, fortyndes 1 ml i 100 ul dH 2 O og bruge 1 ml til at elektroporere elektrokompetente SW102. For at gøre elektrokompetente SW102 bruge følgende protokol:
    1. Pode SW102-celler i 4 ml LB. Grow kulturen ved 32 ° CO / N ryster ved 250 rpm Vigtigt:. SW102 celler må ALDRIG udsættes for en temperatur højere end 32 ° C, medmindre induktion af rekombination maskiner ønskes.
    2. Pode 1 ml af den mættede SW102 kultur i 44 ml LB og vokse på en 32 ° C-rysteapparat til OD600 mellem 0,2-0,3 (normalt omkring 1-1,5 timer) BEMÆRK:. Andre recombineering protokoller anbefaler voksende kultur i et mindre volumen til OD600 0,6-0,7 dog voksende bakterier til en lavere densitet et større volumen øger transformation efficieNCY 12.. Desuden reducerer denne modifikation ventetiden.
    3. Afkøl kultur isvand gylle i 5 min Vigtigt:. I de følgende trin celler skal opbevares ved lave temperaturer. Dette er afgørende for at opnå en god kvalitet elektrokompetente celler.
    4. Centrifugér kulturen ved 4 ° C ved 1.500 xg i 10 min. Supernatanten kasseres og vask pellet i 25 ml kold (4 ° C) 10% glycerol 13. Først resuspender celler i 5 ml ved at trykke og hvirvlende røret isvand gylle (Bør ikke opsuges op og ned) og derefter tilføje de resterende 10% glycerol (20 ml).
    5. Centrifugeres ved 4 ° C ved 1.500 xg i 10 minutter, kasseres supernatanten og vaske pelleten endnu en gang med 25 ml iskold 10% glycerol.
    6. Centrifugeres ved 4 ° C ved 1.500 xg i 10 minutter, kasseres supernatanten og vaske pelleten en tredje gang med 25 ml iskold 10% glycerol.
    7. Centrifugeres ved 4 ° C ved 1500 xg i 10 minutter og kassér supernatant. Cellepelleten kan være meget løs på dette punkt, og der bør udvises forsigtighed, når bortkastning af supernatanten. Pellet resuspenderes i 1 ml kold 10% glycerol. Overfør cellerne til et 1,5 ml rør og centrifugeres i 30 sekunder ved 12.000 xg i en bordplade mikrocentrifuge ved 4 ° C. Kassér det meste af supernatanten forlader ≈ 90 pi glycerol / celler. Cellerne er nu klar til at blive elektroporeret BEMÆRK:. På dette punkt celler kan opbevares ved -80 ° C til senere brug. Dette kan dog nedsætte kompetence.
    8. Elektroporere DNA i celler under anvendelse af en 1 mm kuvette ved 1.800 V, 25 uF, 200 Ω. Efter elektroporation, 300 pi SOC tilføje og lade cellerne restituere i 2 timer ved 32 ° C (omrystning er ikke påkrævet). Plate celler på LB-agar plus 25 ug / ml chloramphenicol (eller andre egnede antibiotika afhængig af transformerede BAC eller PAC) og inkuber ved 32 ° C i 24-30 timer.
  4. Homologiarmene for gentargeting er designet af selectING 10 kb genomisk DNA opstrøms og 5 kb nedstrøms i forhold til den indiske regering. Vælg 500 bp i slutningen af de 10 kb og 5 kb homologiarmene at forstærke (se afsnit 2) (Figur 1). Disse 500 bp fragmenter tjene som homologiarmene bruges til at rekombinere den genomiske området omkring den indiske regering til P [acman] KO 1.0. Disse fragmenter omtales som venstre arm (LA) for den region, der svarer til den opstrøms 5'homologiarm og højre arm (RA) for den region, der svarer til den nedstrøms 3'homologiarm Vigtigt:. Homologiarme bør ikke indeholde BamHI restriktionssteder, som linearisering af plasmidet (i trin 3.2) opnås via et BamHI restriktionsfordøjelse.

2.. Sæt homologiarmene til P [acman]-KO 1.0

  1. Opsæt to individuelle PCR-reaktioner, en til at forstærke LA og en anden for at forstærke RA. For LA, bruge primere attB1-I-Scel-LA-F og BamHI-LA-R og bruge primerne BamHI-RA-F og attB2-I-Scel-RA-Rat forstærke RA (tabel 1). Brug 1 pi BAC DNA fra trin 1.2 eller 0.5 pi kogt natten over bakteriekultur indeholdende BAC af interesse som en skabelon. Sørg for at bruge en DNA-polymerase med korrekturlæsning evne. Dette gælder for al efterfølgende PCR'er-med undtagelse af PCR check i trin 2.8 og 3.13 BEMÆRK:. Forlængelse tid til en korrekturlæsning DNA-polymerase kan være forskellig fra regelmæssige Taq DNA-polymerase afhængig af producenten. PfuUltra II Fusion hotstart, som polymeriserer med en hastighed på 15 sek / kb, kan bruges i disse trin.
    LA / RA PCR
    1 pi DNA fra snavset miniprep fra trin 1.2 af Bac
    0.25 ul Hver 20 uM Primer
    2,5 pi 10X PfuUltra II Buffer
    0.75 pi 10 mM (hver) dNTP
    0,5 gl PfuUltra II Fusion hotstart DNA Polymerase
    19.75 pi Vand
    25 ul Totalvolumen
    PCR-betingelser
    Step1 95 ° C 2 min at aktivere enzymet
    Trin 2 95 ° C 20 sek denaturere
    Step3 60 ° C 20 sek annealing
    Step4 72 ° C 20 sek udvidelse
    Step5 Gå til trin 2 og gentag 29 cyklusser
    Step6 4 ° C Hold
  2. Køre prøver på en 1% agarosegel og udtrække produkter ved hjælp en Zymoclean DNA recovery kit. Eluere DNA fra Zymoclean kolonne med 10 ul sterilt vand.
  3. Udfør splejsning af overlappende forlængelse (PCR SOE) med de to fragmenter under anvendelse af 10-30 ng totalt DNA fra hver amplificeret produkt oprenset i 2,2 (figur 2). Dette er normalt omkring 1/20 th af hvert oprensede PCR-produkt:
    LA / RA PCR-Soe
    0,5 pi hver LA og RA oprensede PCR-produkt cirka 10-30 ng
    0,25 pi hver 20 uM Primer
    2,5 pi 10X PfuUltra II Buffer
    0.75 pi 10 mM (hver) dNTP
    0,5 gl PfuUltra II Fusion hotstart DNA Polymerase
    19,25 pi Vand
    25 ul Totalvolumen
    PCR-betingelser
    Step1 95 ° C 2 min at aktivere enzymet
    Trin 2 95 ° C 20 sek denaturere
    Step3 55 ° C 20 sek annealing (Lower temp. At tillade våben til annealere)
    Step4 72 ° C 20 sek udvidelse
    Step5 Gå til trin 2 og gentag 1 cyklus
    Step6 95 ° C 20 sek denaturere
    Step7 60 ° C 20 sek annealing
    Step8 72 ° C 20 sek udvidelse
    Step9 Gå til trin 2 og gentag 27 cyklusser
    Step10 4 ° C Hold
  4. Kør PCR prøven på en agarose gel og inddrive 1,0 kb båndet ved gel ekstraktion. Dette er attB1-LA-BamHI-RA-attB2 kassette.
  5. Brug Gateway BP ClonaseII Enzyme kit til at oprette en BP reaktion efter protokollen fra producenten.Kassetten genereret på 2.4 vil fungere som donor DNA og P [acman]-KO 1.0 som destination vektor.
  6. Fortynd 50 pi TransforMax EPI300 elektrokompetente celler ved tilsætning 30 pi kold 10% glycerol eller kold dH 2 O. Omdanne 1 ul af BP reaktion i elektrokompetente celler ifølge protokollen leveret af producenten. Tilsætningen af ​​vand udvander temmelig høj saltkoncentration BP reaktion for at forhindre elektrisk udladning (buedannelse) under elektroporation. Elektroporere DNA i celler under anvendelse af en 1 mm kuvette ved 1.800 V, 25 uF, 200 Ω.
  7. Tilsæt 300 pi SOC og lad celler restituere i 1 time ved 37 ° C (omrystning er ikke påkrævet). Plate celler på LB-agar + 50 ug / ml Amp (P [acman]-KO 1.0 indeholder en Amp resistensgen). Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 18-24 timer.
  8. PCR kontrollere individuelle kolonier ved traditionel koloni-PCR med T3 (T3 sekvens er nedstrøms for gateway kassetten i P [acman]-KO 1.0 (Figure 1) og attB1-I-Scel-LA-F-primere. Positive kloner vil vise et bånd, der kører på 1,2 kb.
  9. Grow en overnatning kultur af en positiv klon i LB med 50 ug / ml ampicillin.
  10. Forstærk P [acman]-KO 1.0 vektoren indeholdende LA og RA i en 10 ml LB med 50 ug / ml ampicillin kultur hjælp kopikontrolsignal opløsning efter fabrikantens protokol (Epicentre).
  11. Udfør en Qiagen miniprep efter fabrikantens protokol.

3.. Rekombination af Genomisk interesseområdet til P [acman]-KO 1.0

Dag 1

  1. Pode SW102 celler indeholdende BAC af interesse i 4 ml LB plus 25 ug / ml chloramphenicol (Chl) eller passende udvælgelse antibiotikum. Grow kulturen ved 32 ° CO / N ryster ved 250 rpm Vigtigt:. Udover under induktion i trin 3.5, bør SW102 cellerne ikke udsættes for en temperatur højere end 32 ° C, da høj temperatur aktiverer rekombination machinery af disse celler.

Dag 2

  1. Digest 0,4 ug af P [acman]-KO-1.0 indeholder LA og RA arme genereret i afsnit 2 med ≈ 20 enheder BamHI i et 25 ul reaktion. Inkuber ved 37 ° C i mindst 3 timer Vigtigt:. Lang fordøjelse er afgørende for at sikre fordøjelse af alle DNA. Dette vil reducere antallet af falske positiver kloner senere.
  2. Inokuler 1,0 ml af den mættede SW102/BAC kultur i 44 ml LB-Chl (25 ug / ml) og vokse på en 32 ° C-rysteapparat til OD600 mellem 0,2-0,3 (normalt omkring 1-1,5 timer). Medtag en ekstra identisk prøve for ikke-HS kontrol. Denne prøve vil blive behandlet ligesom den eksperimenterende én i hvert enkelt aspekt med undtagelse af HS. Denne ikke-varme-shocked kultur tjener som en negativ kontrol. Fremkomsten af ​​mange kolonier på den ikke-HS kontrol plade (trin 3.13) normalt indikerer transformation med ufordøjet P [acman] KO 1.0 LA/ RA plasmid.
  3. Mens kultur vokser, skal du køre BamHI-begrænset P [acman]-KO på en gel. Så gel-ekstrakt og elueres DNA i 10 ul vand varmes op til 55 ° C. BEMÆRK: Må ikke elueres DNA i enhver buffer. Salte stede i bufferen kan forårsage elektrisk udladning under elektroporation.
  4. Varmechok kulturen ved 42 ° C i præcis 15 minutter i vandbadet. Dette vil aktivere recombineering maskineri SW102-celler. Må ikke opvarmes chok kontrol kulturen.
  5. Umiddelbart efter varme-shock, overførsel varme chokeret og ikke-HS kontrolkulturer til kølet 50 ml kanoniske rør og lad kulturer chill i et is-vand gylle i 5 min Vigtigt:. I de følgende trin celler skal opbevares ved lave temperaturer . Dette er afgørende for at opnå god kvalitet elektrokompetente celler.
  6. Centrifugér kultur ved 1.500 xg i 10 min. Supernatanten kasseres og vask pellet i 25 ml kold (4 ° C) 10% glycerol 13. Først,resuspenderes cellerne i 5 ml ved at trykke og hvirvlende røret isvand gylle (Bør ikke opsuges op og ned) og derefter tilføje de resterende 10% glycerol (20 ml).
  7. Centrifugeres ved 4 ° C ved 1.500 xg i 10 minutter, kasseres supernatanten og vaske pelleten med 25 ml iskold 10% glycerol en anden gang.
  8. Centrifugeres ved 4 ° C ved 1.500 xg i 10 minutter, kasseres supernatanten og vaske pelleten med 25 ml iskold 10% glycerol en tredje gang.
  9. Centrifugeres ved 4 ° C ved 1.500 xg i 10 minutter og kassér supernatanten. Cellepelleten kan være meget løs på dette punkt, og der bør udvises forsigtighed, når bortkastning af supernatanten. Pellet resuspenderes i 1 ml kold 10% glycerol. Overfør cellerne til et 1,5 ml rør og centrifugeres i 30 sekunder ved 12.000 xg i en bordplade mikrocentrifuge ved 4 ° C. Kassér det meste af supernatanten forlader ≈ 90 ul vand / celler BEMÆRK:. På dette punkt celler kan opbevares ved -80 ° C til senere brug. Dette kan dog nedsætte kompetence.
  10. Tilsæt 2 pi af BamHI-fordøjet P [acman] (mål for 50 ng) til cellerne og blandes forsigtigt med en pipettespids. Overfør celler i en 1 mm elektroporeringskuvette og elektroporere ved 1.800 V, 25 uF, 200 Ω.
  11. Tilsæt 300 pi SOC og lade cellerne restituere i 2 timer ved 32 ° C (omrystning er ikke påkrævet). Plate celler på LB-agar plus 50 ug / ml ampicillin og inkuberes ved 32 ° C i 24-30 timer.

Dag 3

  1. Screen for korrekt gap-reparation hjælp koloni PCR. Brug T3 og RA kontrollere primere for RA og T7 og LA kontrol primer for LA (tabel 1). Designe PCR-Check-RA og PCR-Check-LA primere 100-200 bp mod målrettet regionen (tabel 1). Positive kolonier fra PCR-reaktioner ved hjælp af PCR-Check-RA med T3 eller PCR-Check-LA med T7 vil vise et band, der kører på 800-1.000 bp (figur 3) NB:. Det er afgørende at teste begge arme, da inkorporering af én armmen ikke den anden er undertiden observeres.
  2. Grow PCR-verificerede kolonier ved 32 ° C i 4 ml LB +50 pg / ml ampicillin natten over. Lav en frossen bestand af disse celler til senere brug.

4.. Udskiftning af Genomisk regionen med Targeting Cassette

Dag 4

  1. Forstærk RFP / KAN knockout kassette ved PCR ved anvendelse pENTR-RFP/KAN (predigested med Ascl og Nhel at linearisere) som en skabelon og 5'HA-RFP / Kan-F og 3'HA-RFP / Kan-R-primere ( Tabel 1). RFP / KAN kassette kan rekvireres fra henvisningen 11..
  2. Gel oprense PCR-produktet eluering i 20 ul sterilt vand. RFP-KAN kassette plus homologiarmene skal køre omkring 3 kb.
  3. Pode 1 ml af den mættede SW102 / P [acman]-KO kultur (trin 3.13) i 44 ml LB-Amp (50 ug / ml) og vokse på 32 ° C rysteapparat til OD600 mellem 0,2-0,3. Medtag en ekstra identisk prøve for ikke-HS kontrol. Denne prøve vil blive behandlet ligeligesom den eksperimentelle én i hvert enkelt aspekt med undtagelse af HS.
  4. Efter SW102 / P [acman]-KO kulturen når den ønskede tæthed, følg trin 3,5-3,10.
  5. Elektroporere cirka 100 ng målrette kassette i 90 pi elektrokompetente SW102 / P [acman] KO celler. Overfør celler i en 1 mm elektroporeringskuvette og elektroporere ved 1.800 V, 25 uF, 200 Ω. Tilsæt 300 ul SOC og tillade celler til at komme sig i 2 timer ved 32 ° C (ryster er ikke påkrævet) BEMÆRK:. Det anbefales stærkt at bruge en frisk gelrensede kassetten.
  6. Plate celler i LB-agar + Amp (50 ug / ml) + Kan (50 ug / ml) og inkuberes i 24-30 timer ved 32 ° C.

Dag 5

  1. Grow 5 ml kultur fra 5 forskellige kolonier ved 32 ° CO / N.

Dag 6

  1. Udfør en "dirty miniprep" og køre halvdelen af ​​den opnåede dna på en 1% agarose gel for at lede efter PResence af en lav-molekylvægt plasmid. Der bør ikke være nogen plasmid der kører bellow 12 kb. (Figur 4)
  2. Lav en 1:500 fortynding af DNA fra en positiv klon og bruge 1 ml til at elektroporere i 50 pi TransforMax EPI300 Vigtigt:. Sørg for at fortynde DNA for at forhindre elektroporation af multiple plasmider i én celle. Plate celler i LB-agar + Amp (50 ug / ml) + Kan (50 ug / ml) og inkuberes i 18-24 timer ved 37 ° C

Dag 7

  1. Pode en enkelt koloni i 10 ml LB + og vokse O / N.

Dag 8

  1. Frø 100 ml LB-medier med mættet kultur fra trin 4.10. Tilføj passende antibiotika plus 100 ul 1.000 X kopikontrolsignal opløsning og inkuber ved 37 ° C i 5-6 timer.
  2. Udfør en maxiprep og verificere insertion af kassetten i den korrekte sted ved sekventering.
  3. Ud over sekventering, udføre en restriktion enzyme fordøjelse test med DNA fra en klon, der ikke indeholdt nogen lav molekylvægt plasmid og dets forældrenes DNA. Restriktionsenzymerne udvalgte enzymer vil være forskelligt for hvert gen, men målet er at finde en gruppe af enzymer, der gør det muligt for undersøgeren at karakterisere den recombineered vektor. Som eksempel blev CG32095 målretning vektor serielt fordøjet med Pacl, Ascl, BamHI og AatII. Udseendet af alle de forudsatte bånd og fravær af eventuelle ukorrekte bands bekræfter, at targeting vektoren er blevet korrekt recombineered (figur 5).

5.. Injektion Fluer og mobilisering kassette i Vivo

  1. Sprøjt kassetten ved hjælp ΦC31 integrase, ind i en foruddefineret landing site af valg. Eksterne leverandører, såsom Rainbow transgene ( http://www.rainbowgene.com ), kan bruges til injektion services Vigtigt:. DNA skal være frisk prepared før injektion. Højere transformation effektivitet er observeret, når DNA er forberedt på stedet og injiceres samme dag.
  2. At mobilisere kassetten fra landingsstedet, brug Bloomington stock number 25680 eller 25.679. Disse lagre indeholder Flippase og I-Scel nedstrøms en varmechokpromotor, på kromosom to og tre, hhv. Desuden indeholder de en hs-hid transgen på udligningsanordningen kromosomet og på Y-kromosomet. Saml hanner fra den valgte materiel og krydse til jomfruelige hunner bærer KO kassette i landingsstedet. . Set ~ 30 kors og tillader kvinder at lægge æg i 2-3 dage BEMÆRK: Det anbefales at vælge den bestand, der er på et andet kromosom fra den målrettede locus.
  3. Flip forældre til et nyt sæt af 30 hætteglas, og varmechok larver ved 37 ° C i 1 time, to gange om dagen i tre på hinanden følgende dage. De varme chok aktivere produktionen af enzymer, flippase og I-Scel, og celledød genet gemte
  4. Saml jomfruelige hunner fra F1 afkom af varme chokerede fluer, og krydse til y - w - mænd. Sigt efter 150-200 kors, tre jomfruer og tre hanner pr cross.
  5. Screene F2 afkom under en fluorescerende rækkevidde, der tillader detektion af RFP i øjet. Screen for RFP positive øjne, der er mutant for de hvide og gule gener (y - w -). Denne screening proces positivt vælger for tilstedeværelsen af RFP kassette og vælger for fravær af P [acman] vektor (mini-hvid) og landing site, som er præget af vildtype gul gen BEMÆRK:. Det er mindre tid -consuming at screene for RFP i øjet, end til første screening for YW fluer. Tilvejebringelsesforordningerne begivenheder er meget effektive under varme chok, hvilket resulterer i mange færre fluer indeholdende RFP i øjet i forhold til y - w - fluer.
  6. Opsæt enkelt par parringer med hvert y - w - RFP + flue, da hver mobilisering begivenhed kan være anderledes. Kortlægge RFP til den korrekte kromosom. Korrekt kromosom målretning er typisk observeret i> 95% af tilfældene.
  7. Oprette lagre og tjek for korrekt målretning begivenheder ved hjælp af standardteknikker for Southern blot-analyse. Design en 2 kb probe opstrøms (venstre arm) og nedstrøms (højre arm) af genet bliver målrettet og 2 kb (eller kortere, hvis det er nødvendigt) spænder over slettede ORF. De første to sonder vil give et bånd i homozygotiske og heterozygotiske knockouts, der ikke er til stede i vildtypen, mens ORF ikke vil give et bånd i homozygot knockout. En hurtig PCR feller ORF er også muligt, men dette er afhængig af fraværet af et band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Amplifikation af LA og RA homologiarme skal producere 500 bp produkter og PCR-SOE reaktion bør give et 1,0 kb produkt (afsnit 2.1-2.4, figur 2). BP reaktion udføres i afsnit 2.5, er typisk meget effektiv og bakteriel transformation af produktudbytterne 5-100 kolonier i gennemsnit. Næsten alle kolonier testet med PCR tjek viser det forventede PCR-produkt.

Under den første runde af recombineering (afsnit 3) forventer at få 20-40 kolonier efter transformation af fordøjet P [acman]-KO-1.0 indeholder LA og RA arme ind SW102-celler. 40-60% af disse kloner vil bære den ønskede rekombination produkt. Den ikke-heat shock kontrol bør indeholde meget få, hvis nogen kolonier i forhold til de varme chokerede celler. Udseendet af det samme antal kolonier på både prøve og kontrol pladerne normalt indikerer tilstedeværelsen af ​​uslebne plasmid eller anden forurening. I dette tilfælde, Shou eksperimentetld kasseres og gentages, denne gang fordøje P [acman]-KO-1.0 bærer LA og RA våben til afslutning efter instruktion beskrevet i trin 3.2. Et eksempel på en PCR-kontrol til hentning af genomisk region af interesse i P [acman]-KO 1.0 hvori ≈ 60 kolonier blev opnået, er vist i figur 3.. Her 60% af kolonierne testede foretaget den ønskede rekombination product.Care skal tages, at de observerede PCR-produkter køre på den forudsagte størrelse, eftersom afvigende PCR bånd angiver normalt forkerte recombineering begivenheder.

Lejlighedsvis ingen kolonier vil vokse efter den første runde af recombineering. Brug celler med sub-optimal effektivitet repræsenterer den mest almindelige årsag til en mislykket recombineering reaktion. Holde cellerne koldt på alle tidspunkter under deres udarbejdelse og skånsom håndtering under vaskene (ALDRIG vortex) er afgørende for at opnå en høj kvalitet kompetente celler. Prøv altid at bruge frisk fordøjet / renset P [acman]-KO-1,0-DNA for at opnå den højeste effektivitet.

Undertiden den første runde af de recombineering udbytter kolonierne, men disse kolonier ikke kan passere PCR afkrydsningsfeltet analysen. Denne regel angiver forkerte recombineering produkter, men et sådant resultat kan også indikere potentielle problemer med en af ​​primer sæt. At validere PCR-Check-LA primer oprettet en PCR-reaktion i kombination med attB1-I-Scel-LA-F. For at verificere PCR-check-RA nedsat en PCR reaktion med attB2-I-Scel-RA-R. I begge tilfælde anvender det originale BAC som en skabelon. Disse PCR-reaktioner bør give produkter af den forventede størrelse, som vil variere afhængigt af rækkefølgen af ​​kontrol primere. Positive resultater af denne kontrol eksperiment vil udelukke muligheden for, at en manglende evne til at opdage positive kloner skyldes primer ineffektivitet.

Hvis du har prøvet den første runde af recombineering adskillige gange som følge af ovenstående protokol uden nogen succes, og har udført alleforeslog kontroller, anbefaler vi at vælge et nyt par på 500 bp homologiarmene. Af grunde, som ikke klart på nuværende tidspunkt, er nogle genomiske regioner er stærkt modstandsdygtige over for DNA-rekombination. Simpelthen at designe nye homologiarme og flytte dem mod eller fra genet af interesse undertiden løser disse problemer.

Den anden runde af recombineering (afsnit 4) er typisk meget mere effektiv. Normalt 30-50 kolonier observeret efter transformation med 90-95% af disse indeholder den ønskede konstruktion. Det mest almindelige problem på dette trin er at få falsk-positive kolonier. Figur 4 viser eksempler på sande og falske positive kloner efter anden runde af recombineering (afsnit 4).

Figur 1
Figur 1. Skematisk af pprocesmodeller at generere en P [acman]-KO 1.0 targeting vektor. Modificeret fra Chan et al. (2012). Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skematisk af splejsning af overlappende PCR (PCR SOE) udført på trin 2.3. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. PCR-check gel, der viser effektiviteten af første recombineering begivenhed Hver bane repræsenterer en enkelt koloni A:.. Kolonier testet for venstre arm. integration ved hjælp T7 og LA-check primere B: De samme kolonier som A, testet for højre arm integration bruger T3 og RA-check primers.1kb Plus DNA Ladder blev brugt som en molekylvægtsmarkør BEMÆRK:. på grund af dårlige grunding af T3 primer i forhold til T7, båndene af højre arm checken var betydeligt mørkere. Dette bør tages i betragtning, når du ser gelen.

Figur 4
Figur 4.. DNA agarosegel viser højmolekylære plasmider (P [acman]) og lav molekylvægt plasmid (ufordøjet skabelon) isoleret fra potentielle positive kloner efter anden runde af recombineering. DNA blev isoleret fra 4 potentielle positive kloner og kørte på en 1% agarosegel farvet med ethidiumbromid. Kloner 1,3 og 4 er sande positive kloner. Klon 2 er en falsk positiv som påpeget af alle de former for ap lasmid der kører Bellow 12 kb (den største størrelse bandet i DNA ladder lane). 1 kb Plus DNA Ladder blev anvendt som en molekylvægtmarkør.

Figur 5
Figur 5. Test for ønsket rekombination begivenhed ved restriktionsenzym fordøjelse. I eksemplet ovenfor er vist en computer-forudsagt båndmønster af P [acman]-KO CG32095 før og efter den anden runde af recombineering. Fire forskellige enzymer blev anvendt: Pacl, Ascl, AatII og BamHI. Korrekt rekombineret produkt vil have de samme bands som sin forældre P [acman]-KO CG32095 undtagelse til den påtænkte ændring (pilespidser). NEBcutter V2.0 blev anvendt til at forudsige båndmønsteret.

0346/50346fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
Figur 6.. Skematisk beskriver mobiliseringen af en målrettet kassette in vivo. Klik her for at se større figur .

Tabel 1
Tabel 1.. Primere. Klik her for at se større tabel .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Styrken af ​​genetiske modelorganismer inden for biomedicinsk forskning er i høj grad baseret på de tilgængelige værktøjer til genetisk manipulation. De små modeller C. elegans og Drosophila især muliggøre billig og hurtig molekylærgenetiske analyser af komplette veje og genfamilier impliceret i flercellede udvikling eller funktion. De seneste år har set betydelige fremskridt i værktøj udvikling for at manipulere gener i Drosophila 14,15. For eksempel blev recombineering, som er meget udbredt i muse genetik at manipulere Bac DNA-konstruktioner, som for nylig tilpasset til Drosophila, gennem brug af P [acman] vektor og ΦC31-medieret transgenese 6.. Forskellige udvælgelse kassetter tillader indsættelse eller sletning af specifikke sekvenser overalt inden for en konstruktion ved hjælp rekombination kompetente bakterier 4,13. Vi har ændret det originale P [acman] vektor, så det kan bruges til at konstruere Drosophila. Denne nye vektor gør det muligt at generere målrettet kassetter med større homologiarmene end dem, der let kan foretages ved hjælp klippe og indsætte, kloning metoder. Endvidere har en gateway-kloningskassette også blevet indarbejdet i denne vektor, så en til hurtigt og effektivt at introducere ny genomisk DNA i systemet.

Selv om de fleste af metoden beskrevet her, er ligetil, der er flere trin, vi har fundet afgørende for succes af teknikken. På grund af størrelsen af ​​det manipulerede DNA (> 15 kb), den første runde af recombineering reaktion (afsnit 3) udgør et betydeligt teknisk forhindring. Derfor denne runde af recombineering kræver en meget effektiv rekombination protokol. Tilsyneladende mindre protokol justeringer, ligesom dyrkning af cellerne til lavere densitet, vask af cellerne tre gange i stedet for to og med 10% glycerol i stedet for dH 2 </ Sub> O 13, har forbedret transformation effektiviteten af vores recombineering kompetente celler. Desuden tager sig for at sikre LA / RA indeholder P [acman] er skåret til afslutning med BamHI (Trin 3.1) fjerner mange falske positiver.

Uønskede rekombinationsbegivenheder repræsentere en anden ret almindeligt problem under recombineering. For eksempel har vi observeret tilfælde af gentagelser og omplantning inden for forskellige konstruktioner. Disse begivenheder kan føre til flere problemer under Drosophila transformation og in vivo genmålretning. PCR verifikation og sekventering analyse kan ikke registrere alle disse begivenheder. Derfor skal en restriktionsenzymanalyse udføres på den endelige klonede produkt før injektion af DNA i embryoner. Denne endelige kontrol har vist sig kritisk og har givet os mulighed for at undgå at injicere konstruktioner, der indeholder uønskede aberration.

Maxi-prepping målvektoren lige før injfdeling og aldrig fryse DNA'et i høj grad forbedrer omdannelsen effektiviteten af disse store konstruktioner i Drosophila. Kort sagt, gør små detaljer en stor forskel for succesen med disse teknikker. De protokoller, skitseret og demonstreret her, repræsenterer indsigter fra en række forskellige kilder og vores egen erfaring.

Mens vi håber den protokol, der præsenteres her hjælper andre til at vedtage recombineering metoder i deres egne laboratorier, mener vi yderligere forbedringer og justeringer til metoden er stadig muligt. Lejlighedsvis, specifikke genomiske fragmenter er vanskelige at manipulere med recombineering af årsager, der ikke er helt indlysende. Desuden trods vores bedste bestræbelser på at fjerne uønsket baggrundsstøj, vi fortsat, at visse dele af genomisk DNA tendens til at producere forkert recombineered slutprodukter. En dybere forståelse af den recombineering proces kan give mere optimale protokoller i fremtiden og åben diskussion afrecombineering fiaskoer og succeshistorier vil fremme den vellykkede brug af disse kraftfulde teknikker af den bredere forskningsverden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke nogen konkurrerende interesser i forhold til de teknikker, der er beskrevet her.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Hugo Bellen og Bloomington Stock Center for reagenser. Vi yderligere takker Koen Venken, Hugo Bellen og alle medlemmer af Buszczak og Hiesinger labs for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) samt MB (RO1GM086647), et tilskud af Cancer Prevention Research Institute of Texas til MB og PRH (RP100516) og Welch Foundation (I-1657) til PRH. MB er en EE og Greer Garson Fogelson Scholar i biomedicinsk forskning og PRH er en Eugene McDermott Scholar i biomedicinsk forskning på UT Southwestern Medical Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Genetik Bioengineering Molekylærbiologisk Institut Biomedical Engineering fysiologi, Genetik (dyr og planter) Recombineering, Homolog rekombination Knock-out rekombination genteknologi gen målretning gen gener DNA PCR primere sekventering dyremodel
Recombineering homolog rekombination konstruktioner i<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter