Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering homologues constructions de recombinaison Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Techniques de recombinaison homologue progresser considérablement

Abstract

La poursuite du développement des techniques de manipulation rapide et à grande échelle des loci des gènes endogènes permettra d'élargir l'utilisation de Drosophila melanogaster comme un organisme modèle génétique pour la recherche liée à la maladie humaine. Ces dernières années ont vu des progrès techniques comme la recombinaison homologue et recombineering. Cependant, générant des mutations nulles équivoques ou des protéines endogènes de marquage reste un effort substantiel pour la plupart des gènes. Ici, nous décrivons et démontrer les techniques pour l'utilisation de méthodes de clonage recombineering basés à générer des vecteurs qui peuvent être utilisés pour cibler et manipuler des loci endogènes in vivo Plus précisément, nous avons mis en place une combinaison de trois technologies:. (1) BAC transgénèse / recombineering, ( 2) extrémités-out recombinaison homologue et (3) la technologie de passerelle de fournir une méthode robuste, efficace et flexible pour manipuler des loci génomiques endogènes. Dans ce protocole, nous fournissons des détails étape par étape sur la façon de (1) la conception individuaL vecteurs, (2) comment cloner de grands fragments d'ADN génomique dans le vecteur de recombinaison homologue en utilisant gap repair, et (3) comment remplacer ou étiqueter les gènes d'intérêt au sein de ces vecteurs à l'aide d'un second tour de recombineering. Enfin, nous allons également fournir un protocole pour savoir comment mobiliser ces cassettes in vivo pour produire un knock-out ou un gène marqué par knock-in. Ces méthodes peuvent facilement être adoptées pour plusieurs cibles en parallèle et fournissent un moyen pour manipuler le génome de la drosophile dans une manière opportune et efficace.

Introduction

Nettoyez manipulations moléculaires définis de gènes uniques à leurs loci endogènes offrent un outil précieux pour étudier une multitude de questions pertinentes à la biologie eucaryote. Drosophila inverser techniques génétiques pour générer des allèles de perte de fonction s'était avéré être difficile jusqu'à ce que Golic et ses collègues ont introduit dans génique in vivo en utilisant le ciblage recombinaison homologue chez la drosophile 1-3. Ils ont démontré que loci génomiques spécifiques pourraient être ciblés en utilisant un fragment linéaire d'ADN à partir d'une construction transgénique intégré. Cet ADN «donneur» linéaire est généré in vivo par recombinaison FRT à médiation (pour exciser l'ADN du chromosome en une molécule circulaire) puis linéarisation avec la méganucléase I-Scel. Bien que cette méthode a été utilisée avec succès pour produire une variété de lésions définies, la technique n'a pas été facilement évolutive pour la manipulation de nombreux gènes en parallèle car chaque indiviconstruction double KO nécessite une conception distincte et personnalisée. Par exemple, des difficultés à manipuler de façon transparente grands fragments d'ADN (> 5 ko) in vitro en utilisant l'enzyme classique de restriction / ligature clonage ou PCR, ainsi que les limitations de taille de traditionnel dans des vecteurs de transformation in vivo interfèrent souvent avec la création rapide d'une recombinaison homologue ciblage vecteurs. Pour surmonter ces limitations, nous avons combiné le système P [ACMAN] de recombineering / de transgénèse, qui permet au sous-clonage et la transgenèse jusqu'à 100 kb d'ADN, avec le gène extrémités-out méthodologie de ciblage d'établir une plate-forme efficace et relativement rapide que facilite le ciblage génique Drosophila.

Recombinaison induite par génie génétique (recombineering) est un puissant recombinaison homologue basé sur la technologie du clonage 4,5. Contrairement aux enzyme / ligase clonage de restriction conventionnelle, recombineering n'est pas limitée par la séquence ou Size de l'ADN manipulée. Recombineering utilise un E. spéciale coli souche qui abrite les machines de recombinaison fourni par un λ défectueux prophage 4. Cette technique a récemment été adopté pour une utilisation chez la drosophile 6,7. Recombineering chez la drosophile repose sur un chromosome modifié conditionnellement amplifiable artificiel bactérien (BAC) de vecteur appelé P [ACMAN] 6,7. Ce vecteur porte deux origines de réplication: oriV, qui produit nombre élevé de copies lors de l'induction chimique pour la purification de grandes quantités d'ADN nécessaires pour le séquençage et l'injection de l'embryon et Oris, qui maintient faible nombre de copies dans des conditions basales. En outre, le P [ACMAN] vecteur est équipé d'un site de fixation des bactéries (attB). Le site attB sert de substrat pour la transgenèse OC31 intégrase à médiation qui permet l'incorporation de grands fragments d'ADN dans un site d'atterrissage prédéterminée à l'intérieur du génome de la drosophile 8,9.

Nous avons généré un P [ACMAN] vecteur (dénommé P [ACMAN] KO 1.0) qui peut être utilisé comme un vecteur de ciblage à des fins départ recombinaison homologue 10,11. Pour intégrer extrémités-out ciblage génique technologie dans le système, nous avons ajouté deux deux sites I-Scel FRT et. Nous avons également inclus une cassette Gateway dans ce vecteur modifié pour simplifier le processus d'incorporation des bras d'homologie en P [ACMAN] KO 1.0. Cela fournit un moyen rapide et simple d'introduire pratiquement n'importe quelle région génomique d'intérêt dans le vecteur de ciblage. Dans ce protocole, nous allons décrire comment concevoir un vecteur de ciblage en utilisant P [ACMAN] KO 1.0, et comment mobiliser ce vecteur in vivo pour cibler le locus endogène. Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser la cassette DDP / Kan pour remplacer un gène d'intérêt, mais une variété de cassettes qui contiennent un marqueur de sélection antibiotique peut être utilisé avec ce protocole. Nous avons conçu et utilisé avec succès une série de cassettes pourremplacement d'un gène et l'étiquetage 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sélection de BAC et de la région à la cible

  1. Pour acquérir un taux d'alcoolémie avec le gène d'intérêt (GOI) (ici CG32095 est utilisé comme un exemple), la recherche de CG32095 à www.flybase.org . Dans le cadre des actions et des réactifs section, consultez la section intitulée «clones génomiques» pour alcoolémie contenant CG32095. Assurez-vous que le BAC comprend au moins 10 kb en amont et 5 kb en aval du gène d'intérêt. Sinon, clones dans le P [ACMAN] vecteur 7 peuvent également être trouvés à http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. Le clones BAC viennent dans des cellules DH10B et les P [ACMAN] clones viennent dans les cellules EPI300. Les clones génomiques doivent être transformées en cellules SW102, qui se prêtent à recombineering. "Minipreps sales" sont effectuées (une Qiagen miniprep sans l'aide d'une colonne et précipiter l'ADN avec de l'isopropanol) à partird'un ml O / N 5 culture inoculés avec des cellules contenant le BAC. Après la remise en suspension de la fraîchement culot d'ADN dans 20 pi de dH 2 O, diluer 1 pl dans 100 pi de dH 2 O et utiliser 1 pl pour l'électroporation SW102 électrocompétentes. Pour faire SW102 électrocompétentes utilisent le protocole suivant:
    1. Inoculer des cellules SW102 dans 4 ml de LB. Cultiver la culture à 32 ° CO / N agitation à 250 rpm. Important: les cellules SW102 devraient jamais être exposé à une température supérieure à 32 ° C, sauf l'induction de machines de recombinaison est souhaitée.
    2. Inoculer 1 ml de la culture SW102 saturé dans 44 ml de LB et se développer sur un 32 ° C shaker à DO600 entre 0,2-0,3 (habituellement environ 1-1,5 heures). NOTE: D'autres protocoles de recombineering recommandent de plus en plus la culture dans un petit volume d' OD 600 0,6-0,7 cependant de plus en plus les bactéries à une densité inférieure à un plus grand volume augmente considérablement transformation véhicunce 12. En outre, cette modification permet de réduire le temps d'attente.
    3. Refroidir la culture en suspension de l'eau glacée pendant 5 min. Important: Pendant les étapes suivantes cellules doivent être conservés à des températures basses. Ceci est crucial pour l'obtention de cellules électro de bonne qualité.
    4. Centrifugeuse culture à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min. Rejeter le surnageant et laver le culot dans 25 ml de froid (4 ° C) 10% de glycérol 13. Tout d'abord, remettre les cellules dans 5 ml en tapant et en agitant le tube coulis de glace et d'eau (Ne pas pipeter haut et bas), puis ajouter les 10% restants du glycérol (20 ml).
    5. Centrifuger à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min, éliminer le surnageant et laver le culot une seconde fois avec 25 ml à 10% glacé glycérol.
    6. Centrifuger à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min, éliminer le surnageant et laver le culot une troisième fois avec 25 ml à 10% glacé glycérol.
    7. Centrifuger à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min et jeter supernatant. Le culot cellulaire peut être très lâche à ce point et des précautions doivent être prises lorsque élimination du surnageant. Reprendre le culot dans 1 ml de froid 10% de glycérol. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 30 sec à 12.000 xg dans une microcentrifugeuse de table à 4 ° C. Jeter la plupart du surnageant laissant ≈ 90 l de glycérol / cellules. Les cellules sont maintenant prêts à être électroporation. NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Toutefois, cela peut diminuer compétence.
    8. Électroporer ADN dans des cellules en utilisant une cuve de 1 mm à 1.800 V, 25 pF, 200 Ω. Après électroporation, ajouter 300 ul de SOC et laisser les cellules récupérer pendant 2 heures à 32 ° C (agitation n'est pas nécessaire). Cellules de la plaque sur gélose LB plus 25 pg / ml de chloramphénicol (ou d'autres antibiotiques appropriés en fonction de la BAC transformé ou PAC) et incuber à 32 ° C pendant 24-30 h.
  4. bras d'homologie pour le ciblage de gènes sont conçus par selectment 10 kb d'ADN génomique en amont et 5 kb en aval par rapport au RBE. Sélectionnez 500 pb à la fin de la 10 ko et 5 ko bras d'homologie à amplifier (voir section 2) (Figure 1). Ces fragments de 500 pb servent les bras d'homologie utilisées pour recombiner la région génomique entourant les pouvoirs publics indiens dans P [ACMAN] KO 1.0. Ces fragments sont appelés bras gauche (LA) pour la région qui correspond à l'amont 5 'bras d'homologie et le bras droit (RA) pour la région qui correspond à la 3 aval »bras d'homologie. Important: bras d'homologie ne doivent pas contenir BamHI des sites de restriction, que la linéarisation du plasmide (à l'étape 3.2) est effectuée par l'intermédiaire d'un produit de digestion de restriction BamHI.

2. Insérez les bras d'homologie en P [ACMAN] KO 1.0

  1. Mettre en place deux réactions PCR individuels, l'un pour amplifier la LA et un autre pour amplifier la RA. Pour la LA, utiliser des amorces attB1-I-Scel-LA-F et BamHI-LA-R et utiliser les amorces BamHI-RA-F et attB2-I-Scel-RA-Rà amplifier la RA (tableau 1). Utilisez 1 pl de l'ADN BAC de l'étape 1.2 ou 0.5 l de culture bactérienne nuit bouillie contenant BAC d'intérêt comme modèle. Assurez-vous d'utiliser une ADN polymérase avec relecture capacité. Ceci s'applique à tous ultérieur PCR, à l'exception du chèque PCR dans les étapes 2.8 et 3.13. REMARQUE: temps de prolongation pour une ADN polymérase relecture peut être différent de l'ADN polymérase Taq régulière selon le fabricant. PfuUltra II Fusion HotStart, qui polymérise à un taux de 15 sec / kb, peut être utilisé dans ces étapes.
    LA / RA PCR
    1 pl ADN de sale miniprep de l'étape 1.2 de Bac
    0,25 pi de chacun 20uM Primer
    2,5 pl 10X PfuUltra II Buffer
    0,75 pi 10mm (chaque) dNTP
    0,5 pl PfuUltra II Fusion HotStart ADN polymérase
    19,75 pi Eau
    25 pl Volume total
    Conditions PCR
    Etape 1 95 ° C 2 min pour activer l'enzyme
    Etape 2 95 ° C 20 sec dénaturent
    Etape 3 60 ° C 20 sec recuit
    Etape 4 72 ° C 20 sec prolongation
    Etape 5 Passez à l'étape 2 et répétez 29 cycles
    Step6 4 ° C Maintenez
  2. Exécuter des échantillons sur un gel d'agarose 1% et extraire les produits utilisant un kit de récupération d'ADN Zymoclean. On élue l'ADN à partir de la colonne Zymoclean avec 10 pl d'eau stérile.
  3. Effectuer épissage par extension de chevauchement (PCR SOE) avec les deux fragments à l'aide de 10 à 30 ng d'ADN total à partir de chaque produit amplifié purifiée dans 2,2 (figure 2). Il s'agit généralement d'environ 1/20 de chaque produit PCR purifié:
    LA / RA PCR-Soe
    0,5 pi de chacun Los Angeles et produit RA PCR purifié environ 10-30 ng
    0,25 pi de chacun 20uM Primer
    2,5 pl 10X PfuUltra II Buffer
    0,75 pi 10mm (chaque) dNTP
    0,5 pl PfuUltra II Fusion HotStart ADN polymérase
    19.25 pi Eau
    25 pl Volume total
    Conditions PCR
    Etape 1 95 ° C 2 min pour activer l'enzyme
    Etape 2 95 ° C 20 sec dénaturent
    Etape 3 55 ° C 20 sec recuit (Basse température. Pour permettre bras de recuire)
    Etape 4 72 ° C 20 sec prolongation
    Etape 5 Passez à l'étape 2 et répétez 1 cycle
    Step6 95 ° C 20 sec dénaturent
    Step7 60 ° C 20 sec recuit
    Step8 72 ° C 20 sec prolongation
    Step9 Passez à l'étape 2 et répétez 27 cycles
    Etape 10 4 ° C Maintenez
  4. Exécutez l'exemple PCR sur un gel d'agarose et récupérer la bande de 1,0 kb par extraction de gel. C'est la cassette attB1-LA-BamHI-RA-attB2.
  5. Utiliser la passerelle kit enzymatique ClonaseII BP à mettre en place une réaction BP en suivant le protocole fourni par le fabricant.La cassette généré en 2.4 agira comme l'ADN du donneur et le P [ACMAN] KO 1.0 comme vecteur de destination.
  6. Diluer 50 pi de TransforMax EPI300 cellules électro en ajoutant 30 pl de froid 10% de glycérol ou froid dH 2 O. Transformer 1 pl de la réaction BP en cellules électro suivant le protocole fourni par le fabricant. L'addition d'eau dilue la concentration en sel assez élevé de la réaction BP pour éviter une décharge électrique (arc) durant l'électroporation. Électroporer ADN dans des cellules en utilisant une cuve de 1 mm à 1.800 V, 25 pF, 200 Ω.
  7. Ajouter 300 ul de SOC et laissez les cellules récupérer pendant 1 heure à 37 ° C (secouant n'est pas nécessaire). Cellules de la plaque sur LB-agar + 50 pg / ml d'Amp (P [ACMAN] KO 1.0 contient un gène de résistance Amp). Incuber les plaques à 37 ° C pendant 18-24 h.
  8. PCR vérifier colonies individuelles par conventionnel colonie PCR utilisant T3 (séquence T3 est en aval de la cassette de la passerelle dans le P [ACMAN] KO 1.0 (Figure 1) et attB1-I-Scel-LA-F amorces. Les clones positifs vont montrer une bande qui tourne à 1,2 kb.
  9. Cultiver une culture de nuit d'un clone positif en LB avec 50 ug / ml d'ampicilline.
  10. Amplifier le [ACMAN] vecteur 1.0-KO P contenant la LA et RA dans un LB de 10 ml avec 50 pg / ml d'ampicilline culture en utilisant une solution de contrôle de copie suivant le protocole du fabricant (Epicentre).
  11. Effectuez une Qiagen miniprep suivant le protocole du fabricant.

3. Recombiner la région génomique d'intérêt dans P [ACMAN] KO 1.0

Jour 1

  1. Inoculer SW102 cellules contenant le taux d'alcoolémie d'intérêt dans 4 ml de LB + 25 pg / ml de chloramphénicol (Chl) ou l'antibiotique de sélection approprié. Cultiver la culture à 32 ° CO / N agitation à 250 rpm. Important: Outre pendant l'induction de l'étape 3.5, les cellules SW102 ne devraient pas être exposés à une température supérieure à 32 ° C, comme à haute température active la recombinaison MAchines de ces cellules.

Jour 2

  1. Digest 0,4 pg de P [ACMAN]-KO-1.0 contenant les armes LA et RA générés dans la section 2 avec ≈ 20 unités de BamHI dans une réaction de 25 ul. Incuber à 37 ° C pendant au moins 3 h. Important: longue digestion est essentielle pour assurer la digestion de tout l'ADN. Cela réduira le nombre de faux positifs clones plus tard.
  2. Inoculer 1,0 ml de la culture SW102/BAC saturé dans 44 ml LB-Chl (25 pg / ml) et de croître sur un 32 ° C shaker à DO600 entre 0,2-0,3 (habituellement environ 1-1,5 heures). Inclure un échantillon identique supplémentaire pour le contrôle non-HS. Cet échantillon sera traité comme l'expérimental dans tous les aspects à l'exception du SH. Cette culture non un choc thermique sert de contrôle négatif. L'apparition de nombreuses colonies sur la plaque de contrôle non-HS (étape 3.13) indique généralement la transformation avec digérées P [ACMAN] KO 1.0 LARA / plasmide.
  3. Alors que la culture se développe, exécutez le BamHI-restricted P [ACMAN] KO sur un gel. Puis gel extraire et éluer l'ADN dans 10 ul d'eau réchauffée à 55 ° C. NOTE: Ne pas éluer l'ADN dans un tampon. Sels présents dans la mémoire tampon peuvent provoquer une décharge électrique lors de l'électroporation.
  4. De choc thermique de la culture à 42 ° C pendant exactement 15 min dans le bain d'eau. Cela permettra d'activer le mécanisme recombineering des cellules SW102. Ne pas chauffer le choc de la culture de contrôle.
  5. Immédiatement après choc thermique, le transfert à un choc thermique et les cultures de contrôle non-SH réfrigérés 50 tubes canoniques ml et laisser le froid des cultures dans une bouillie d'eau glacée pendant 5 min. Important: Pendant les étapes suivantes cellules doivent être conservés à des températures basses . Ceci est crucial pour obtenir des cellules électrocompétentes de bonne qualité.
  6. Centrifugeuse culture à 1500 g pendant 10 min. Rejeter le surnageant et laver le culot dans 25 ml de froid (4 ° C) 10% de glycérol 13. En premier lieu,remettre en suspension les cellules dans 5 ml en appuyant et en agitant le tube coulis de glace et d'eau (Ne pas pipeter haut et bas), puis ajouter le glycérol 10% restant (20 ml).
  7. Centrifuger à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min, éliminer le surnageant et laver le culot avec 25 ml à 10% glacé glycérol une deuxième fois.
  8. Centrifuger à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min, éliminer le surnageant et laver le culot avec 25 ml à 10% glacé glycérol une troisième fois.
  9. Centrifuger à 4 ° C à 1500 g pendant 10 min et éliminer le surnageant. Le culot cellulaire peut être très lâche à ce point et des précautions doivent être prises lorsque élimination du surnageant. Reprendre le culot dans 1 ml de froid 10% de glycérol. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 30 sec à 12.000 xg dans une microcentrifugeuse de table à 4 ° C. Jeter la plupart du surnageant laissant ≈ 90 pi d'eau / cellules. NOTE: A ce point de cellules peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Toutefois, cela peut diminuer compétence.
  10. Ajouter 2 ul de la digéré par BamHI P [ACMAN] (objectif de 50 ng) aux cellules et mélanger délicatement à l'aide d'une pipette. Transfert cellules dans une cuvette d'électroporation 1 mm et l'électroporation à 1800 V, 25 pF, 200 Ω.
  11. Ajouter 300 ul de SOC et laisser les cellules récupérer pendant 2 heures à 32 ° C (secouant n'est pas nécessaire). Cellules de la plaque sur gélose LB plus 50 pg / ml d'ampicilline et incuber à 32 ° C pendant 24-30 h.

Jour 3

  1. Écran pour le bon écart de réparation en utilisant une PCR sur colonie. Utilisez T3 et RA vérifier amorces pour la RA et T7 et LA chèque amorce pour le LA (tableau 1). Concevoir le PCR-Check-RA et PCR-Check-LA amorces 100-200 pb vers la région ciblée (tableau 1). Les colonies positives de réactions PCR en utilisant la PCR-Check-RA avec T3 ou PCR-Check-LA avec T7 montreront un groupe qui fonctionne à 800-1000 pb (figure 3). NOTE: Il est essentiel de tester les deux bras depuis la constitution d'un brasmais pas l'autre est parfois observée.
  2. Cultivez PCR vérifiées colonies à 32 ° C dans 4 ml de LB +50 mg / ml d'ampicilline pour la nuit. Faire un stock congelé de ces cellules pour une utilisation ultérieure.

4. Remplacement de la région génomique avec la cassette de ciblage

Jour 4

  1. Amplifier la DP / KAN cassette KO par PCR en utilisant pENTR-RFP/KAN (prédigéré avec Ascl et Nhel de linéariser) comme un modèle et le 5'HA-DP / Kan-F et 3'HA-DP / Kan-R amorces ( Tableau 1). DP / KAN cassette peut être demandé à la référence 11.
  2. Gel purifier le produit PCR élue dans 20 ul d'eau stérile. La cassette DP-KAN plus les bras d'homologie doivent courir autour de 3 kb.
  3. Inoculer 1 ml du saturée SW102 / P [ACMAN] culture-KO (étape 3.13) dans 44 ml de LB-Amp (50 pg / ml) et de croître sur 32 ° C shaker à DO600 entre 0,2-0,3. Inclure un échantillon identique supplémentaire pour le contrôle non-HS. Cet échantillon sera traité seulementcomme l'expérimental dans tous les aspects à l'exception du SH.
  4. Après le SW102 / P [ACMAN] culture-KO atteint la densité désirée, suivez les étapes de 3,5 à 3,10.
  5. Électroporer environ 100 ng de cibler cassette dans 90 ul de SW102 / P [ACMAN] cellules-KO électrocompétentes. Transfert cellules dans une cuvette d'électroporation 1 mm et l'électroporation à 1800 V, 25 pF, 200 Ω. Ajouter 300 ul de SOC et permettent aux cellules de se rétablir pendant 2 heures à 32 ° C (secouant n'est pas nécessaire). REMARQUE: Il est fortement recommandé d'utiliser un gel frais cassettes purifiée.
  6. Cellules de la plaque de gélose LB + Amp (50 pg / ml) + Kan (50 pg / ml) et incuber pendant 24-30 heures à 32 ° C.

Jour 5

  1. Augmenter de 5 ml de culture à partir de 5 colonies différentes à 32 ° CO / N.

Jour 6

  1. Effectuer un "sale miniprep" et exécuter la moitié de l'ADN obtenu sur un gel à 1% d'agarose à chercher la presence d'un faible poids moléculaire plasmide. Il ne devrait pas y avoir de plasmide qui fonctionne soufflet 12 kb. (Figure 4)
  2. Faire une dilution 1:500 de l'ADN à partir d'un clone positif et utiliser 1 pl pour l'électroporation dans 50 pi de TransforMax EPI300. Important: Assurez-vous de diluer l'ADN pour empêcher l'électroporation de plasmides multiples en une seule cellule. Cellules de la plaque de gélose LB + Amp (50 pg / ml) + Kan (50 pg / ml) et incuber pendant 18-24 heures à 37 ° C

Jour 7

  1. Inoculer une seule colonie dans 10 ml de LB + et croître O / N.

Jour 8

  1. Seed 100 ml de milieu LB avec la culture saturée de l'étape 4.10. Ajouter des antibiotiques appropriés, plus de 100 pi de 1000 solution X de l'exemplaire de contrôle et incuber à 37 ° C pendant 5-6 heures.
  2. Effectuez une maxiprep et vérifier l'insertion de la cassette dans le site correct par séquençage.
  3. En plus de séquençage, effectuer une enzym de restrictione essai de digestion avec l'ADN d'un clone qui ne contenait pas de bas poids moléculaire plasmide et son ADN parental. Les enzymes de restriction sélectionnées seront différentes pour chaque gène, mais le but est de trouver un groupe d'enzymes qui permettent à l'enquêteur de caractériser le vecteur recombineered. A titre d'exemple, le vecteur de ciblage CG32095 a été successivement digéré par Pac, l'ASCI, BamHI et AatII. L'apparition de tous les groupes prévus et l'absence de bandes incorrectes confirme que le vecteur de ciblage a été recombineered correctement (Figure 5).

5. L'injection de mouches et la mobilisation Cassette In Vivo

  1. Injecter la cassette en utilisant l'intégrase OC31, dans un site d'atterrissage prédéfini de votre choix. Fournisseurs externes, tels que les arc-en-transgéniques ( http://www.rainbowgene.com ), peuvent être utilisés pour des services d'injection. Important: L'ADN doit être fraîchement préparée avant l'injection. On observe efficacité de transformation plus élevé lorsque l'ADN est préparé sur place et injecté le même jour.
  2. Pour mobiliser la cassette du site d'atterrissage, utilisez Bloomington stock number 25680 ou 25679. Ces stocks comprennent flippase et I-Scel aval d'un promoteur de choc thermique, sur le chromosome deux et trois, respectivement. En outre, ils contiennent une hs-hid transgène sur le chromosome d'équilibrage et le Y-chromosome. Recueillir les mâles dans le stock choisie et traverser de femelles vierges portant la cassette KO dans le site d'atterrissage. . Set ~ 30 croix et permettent aux femelles pondent des œufs pendant 2-3 jours NOTE: Il est recommandé de choisir le stock qui se trouve sur un chromosome différent du locus ciblé.
  3. Les parents basculer dans un nouvel ensemble de 30 flacons et les larves de choc thermique à 37 ° C pendant 1 heure, deux fois par jour, pendant trois jours consécutifs. Les chocs thermiques activent la production des enzymes; flippase et I-Scel, et le gène de la mort cellulaire caché
  4. Recueillir femelles vierges de la descendance F1 des mouches à un choc thermique, et traverser pour y - w - mâles. Visez 150-200 croix, trois vierges et trois mâles par croix.
  5. Écran la progéniture F2 sous un microscope fluorescent qui permet la détection de la DP dans les yeux. Écran pour DP yeux positifs qui sont mutant pour les gènes jaunes et blanches (y - w -). Ce processus de sélection sélectionne positivement à la présence de la cassette DP et sélectionne pour l'absence de l'[ACMAN] vecteur (mini-blanc) et des sites d'atterrissages P, qui est marquée par le gène jaune de type sauvage. NOTE: Il ya moins de temps -consupposant pour le dépistage de DP dans les yeux, que au premier écran pour yw mouches. Les activités de mobilisation sont très efficaces lors des chocs thermiques, ce qui entraîne beaucoup de mouches contenant moins de DP dans les yeux, par rapport à y - w - mouches.
  6. Mettre en place des croisements de paires simples avec chacun y - w - DP + mouche, puisque chaque événement de mobilisation peut être différente. Carte de la DP à la bonne chromosome. Correct ciblage des chromosomes est généralement observé dans> 95% des cas.
  7. Constituer des stocks et vérifier les événements ciblant correctes en utilisant des techniques standard pour l'analyse par transfert de Southern. Concevoir une sonde 2 kb en amont (bras gauche) et en aval (bras droit) du gène ciblé, et 2 kb (ou moins si nécessaire) couvrant l'ORF supprimés. Les deux premières sondes donnent une bande dans les trous les homozygotes et hétérozygotes, qui n'est pas présent dans le type sauvage, tandis que l'ORF ne cédera pas un groupe dans le knock-out homozygotes. A f PCR rapideou l'ORF est également possible, mais cela repose sur l'absence d'une bande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Amplification de la LA et bras d'homologie RA devrait produire 500 produits BP et la réaction de PCR-SOE devrait donner une kb produit 1.0 (Sections 2.1-2.4; figure 2). La réaction BP effectué dans la section 2.5 est généralement très efficace et transformation bactérienne des rendements des produits 5-100 des colonies en moyenne. Presque toutes les colonies testées par PCR cochez la case Afficher le produit de PCR attendu.

Lors du premier tour de recombineering (Section 3) s'attendre à obtenir colonies 20-40 après transformation de la P digéré [ACMAN]-KO-1.0 contenant le LA et les bras RA dans les cellules SW102. 40-60% de ces clones portera le produit de recombinaison désirée. Le contrôle de choc non-chaleur doit contenir très peu ou pas de colonies par rapport aux cellules à un choc thermique. L'apparition du même nombre de colonies sur l'échantillon et plaques de contrôle indique généralement la présence de uncut plasmide ou un autre contaminant. Dans ce cas, l'expérience should être jeté et répété, cette fois digérer le P [ACMAN]-KO-1.0 portant le LA et RA bras à l'achèvement suivant les instructions décrites dans l'étape 3.2. Un exemple d'un chèque PCR pour la récupération de région génomique d'intérêt dans P [ACMAN] KO 1.0 dans lequel ≈ 60 colonies ont été obtenus est illustré à la figure 3. Ici, 60% des colonies testées effectué le product.Care de recombinaison souhaitée doit être prise que les produits de PCR observés fonctionnent à la taille prévue, puisque les bandes PCR aberrantes indiquent généralement des événements de recombineering incorrectes.

Parfois pas de colonies se développeront après le premier tour de recombineering. En utilisant des cellules avec efficacité sous-optimale représente la cause la plus fréquente d'une réaction recombineering échoué. Garder les cellules froides à tout moment au cours de leur préparation et leur manipulation en douceur pendant les lavages (JAMAIS vortex) est essentiel pour l'obtention de cellules compétentes de haute qualité. Essayez de toujours utiliser fraîchement digérée / purifiée P [ACMAN]-KO-1.0 ADN pour obtenir la plus grande efficacité.

Parfois, le premier tour des rendements colonies recombineering mais ces colonies ne passent pas le test de vérification PCR. Cela indique généralement produits recombineering incorrectes mais un tel résultat peut aussi indiquer des problèmes potentiels avec l'un des jeux d'amorces. Pour valider l'amorce PCR-Check-LA, mis en place une réaction de PCR en combinaison avec le attB1-I-Scel-LA-F. Pour vérifier PCR-check-RA a mis en place une réaction PCR avec le attB2-I-Scel-RA-R. Dans les deux cas utiliser le BAC origine comme un modèle. Ces réactions PCR devraient donner des produits de la taille attendue, qui varient en fonction de la séquence du chèque amorces. Les résultats positifs de cette expérience de contrôle seront exclure la possibilité que l'incapacité à détecter les clones positifs est due à l'inefficacité de l'amorce.

Si vous avez essayé la première ronde de recombineering plusieurs fois suivant le protocole ci-dessus sans succès et que vous avez effectué toutes lescontrôles suggéré, nous vous recommandons de choisir une nouvelle paire de bras d'homologie 500 pb. Pour des raisons qui ne sont pas clair à l'heure actuelle, certaines régions génomiques sont très résistantes à la recombinaison de l'ADN. Simplement la conception de nouveaux bras d'homologie et en les déplaçant vers ou depuis le gène d'intérêt résout parfois ces problèmes.

Le second tour de recombineering (section 4) est généralement beaucoup plus efficace. Normalement 30-50 colonies sont observées après transformation, avec 90-95% d'entre eux contenant la construction désirée. Le problème le plus courant à cette étape est l'obtention de colonies de faux positifs. Figure 4 montre des exemples du vrai et du faux clones positifs après la deuxième ronde de recombineering (section 4).

Figure 1
Figure 1. Schéma du process pour générer un P [ACMAN] KO 1,0 vecteur de ciblage. modification de Chan et al. (2012). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Schéma de l'épissage par PCR de chevauchement (SOE PCR) réalisée sur l'étape 2.3. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. PCR vérifier l'efficacité montrant de gel de premier événement recombineering Chaque voie représente une seule colonie A:.. Colonies testées pour le bras gauche. intégration à l'aide T7 et LA-chèques amorces B: Les mêmes colonies comme A, testés pour l'intégration du bras droit à l'aide T3 et RA-chèque primers.1kb plus Ladder d'ADN a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire. Remarque: En raison de la mauvaise amorçage du T3 apprêt par rapport au T7, les bandes de la vérification de bras droit était beaucoup plus sombre. Ceci doit être pris en compte lors de l'affichage du gel.

Figure 4
Figure 4. Gel agarose ADN montre plasmides de poids moléculaire élevé (P [ACMAN]) et de faible poids moléculaire plasmide (modèle non digérés) isolés à partir de clones positifs potentiels après la deuxième ronde de recombineering. L'ADN a été isolé à partir de 4 clones positifs potentiels et a couru sur un gel d'agarose à 1% colorées avec du bromure d'éthidium. Clones 1,3 et 4 sont de véritables clones positifs. Clone 2 est positif faux comme indiqué par les toutes les formes d'ap que lasmid courses soufflet 12 kb (le plus grand groupe de taille dans la voie de l'échelle de l'ADN). 1 kb plus DNA Ladder a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire.

Figure 5
Figure 5. Essai pour l'événement de recombinaison souhaitée par l'enzyme de restriction digest. Dans l'exemple ci-dessus reçoit un ordinateur prédit profil de bandes de la P [ACMAN] KO CG32095 avant et après le second tour de recombineering. Quatre enzymes différentes ont été utilisées: PacI, l'ASCI, AatII et BamHI. Correctement produit recombiné aura les mêmes bandes que ses parents P [ACMAN] KO CG32095 à l'exception de la modification prévue (pointes de flèches). NEBcutter V2.0 a été utilisé pour prédire le modèle de bande.

0346/50346fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
Figure 6. Schéma décrivant la mobilisation d'une cassette cibler in vivo. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Tableau 1
Tableau 1. Primaires. Cliquez ici pour agrandir le tableau .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La puissance des organismes modèles génétiques dans la recherche biomédicale repose en grande partie sur les outils disponibles pour la manipulation génétique. Les petits modèles C. elegans et Drosophila en particulier permettre des analyses génétiques moléculaires peu coûteux et rapide des parcours complets et des familles de gènes impliqués dans le développement ou la fonction multicellulaire. Ces dernières années ont vu des avancées significatives dans le développement d'outils pour la manipulation de gènes chez la drosophile 14,15. Par exemple, recombineering, qui est largement utilisé dans la génétique de la souris pour manipuler les constructions d'ADN Bac, a été récemment adapté pour la drosophile, grâce à l'utilisation de la P [ACMAN] vecteur et transgénèse OC31 médiée 6. Différentes cassettes de sélection permettent l'insertion ou suppression de séquences spécifiques n'importe où dans une construction utilisant des bactéries compétentes de recombinaison 4,13. Nous avons modifié l'original P [ACMAN] vecteur de sorte qu'il peut être utilisé pour la construction chez la drosophile. Ce nouveau vecteur permet de générer des cassettes ciblant les bras d'homologie plus importantes que celles qui peuvent être facilement effectuées à l'aide coupe et des procédés de clonage pâte. En outre, une cassette Gateway clonage a également été intégrée dans ce vecteur, permettant de mettre rapidement et efficacement de nouveaux ADN génomique dans le système.

Bien que la plupart de la méthodologie décrite ici est simple, il ya plusieurs étapes que nous avons trouvés critique pour le succès de la technique. En raison de la taille de l'ADN manipulé (> 15 kb), le premier tour de réaction recombineering (section 3) constitue un obstacle technique important. Par conséquent, la présente ronde de recombineering nécessite un protocole de recombinaison très efficace. Ajustements de protocole apparemment mineures, comme la croissance des cellules à faible densité, le lavage des cellules trois fois au lieu de deux et avec 10% de glycérol DH au lieu de 2 </ Sub> O 13, ont grandement amélioré l'efficacité de la transformation de nos cellules compétentes recombineering. En outre, en prenant soin de s'assurer que le LA / RA contenant P [ACMAN] est coupé à la réalisation avec BamHI (étape 3.1) élimine de nombreux faux positifs.

Événements de recombinaison indésirables représentent un autre problème assez courant durant recombineering. Par exemple, nous avons observé des cas de duplications et de translocations dans les différentes constructions. Ces événements peuvent conduire à de multiples problèmes lors de la transformation drosophile et dans le gène ciblage in vivo. Vérification et l'analyse PCR de séquençage ne peuvent pas détecter tous ces événements. Par conséquent, une analyse des enzymes de restriction doit être effectuée sur le produit final cloné avant l'injection d'ADN dans des embryons. Ce dernier contrôle a montré critique et a permis d'éviter d'injecter des constructions qui contiennent des aberrations indésirables.

Maxi-apprêter le vecteur de ciblage juste avant injection et de ne jamais geler l'ADN améliore considérablement l'efficacité de la transformation de ces grandes constructions dans la drosophile. En bref, les petits détails qui font une grande différence dans le succès de ces techniques. Les protocoles présentés et démontrés ici représentent un aperçu d'un certain nombre de sources différentes et notre propre expérience.

Bien que nous espérons que le protocole présenté ici aide les autres à adopter des méthodes recombineering dans leurs propres laboratoires, nous croyons que des améliorations et des raffinements de la méthodologie sont encore possibles. De temps en temps, des fragments génomiques spécifiques sont difficiles à manipuler en utilisant recombineering pour des raisons qui ne sont pas tout à fait évident. En outre, en dépit de nos meilleurs efforts pour éliminer fond indésirable, on trouve encore que certains fragments d'ADN génomique ont tendance à produire des produits finis mal recombineered. Une meilleure compréhension du processus recombineering peut donner des protocoles plus optimales à l'avenir et ouvert la discussion desrecombineering échecs et les réussites encouragera l'utilisation efficace de ces techniques puissantes de la communauté de recherche plus large.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont pas des intérêts divergents en ce qui concerne les techniques décrites ici.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Hugo Bellen et l'Bloomington Stock Center for réactifs. Nous remercions encore Koen Venken, Hugo Bellen et tous les membres du laboratoire Buszczak et Hiesinger pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national de la santé de l'ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) et Mo (RO1GM086647), une subvention de l'Institut de recherche sur la prévention du cancer du Texas à Mo et PRH (RP100516), et le Welch Foundation (I-1657) à PRH. MB est un EE et Greer Garson Fogelson Scholar dans la recherche biomédicale et PRH est un McDermott Scholar Eugene dans la recherche biomédicale à l'UT Southwestern Medical Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Genetics numéro 77 bio-ingénierie biologie moléculaire génie biomédical Physiologie, La génétique (animal et végétal) recombineering, La recombinaison homologue knock-out modèle animale
Recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter