Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering Гомологичная рекомбинантные конструкции в Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Гомологичной рекомбинации методы в значительной степени улучшить

Abstract

Продолжение разработки методов для быстрого, крупномасштабные манипуляции эндогенных генных локусов расширит использование дрозофилы как генетическая модель для организма человека заболеваниям соответствующих исследований. В последние годы наблюдается технических достижений, как гомологичной рекомбинации и recombineering. Тем не менее, однозначного генерации мутаций нулевым или эндогенных белков пометки остаются значительные усилия для большинства генов. Здесь описывают и демонстрируют методы использования recombineering методы, основанные на клонирование для генерации векторов, которые можно использовать для выявления и манипулировать эндогенных локусов в естественных В частности, мы установили комбинацию трех технологий: (1). BAC трансгенез / recombineering ( 2) выезда концах гомологичной рекомбинации и (3) Шлюз технологии для обеспечения надежной, эффективной и гибкий метод для манипулирования эндогенных локусов генома. В этом протоколе, мы предоставляем шаг за шагом, подробно о том, как (1) Дизайн индивидовL векторов, (2), как клонировать больших фрагментов геномной ДНК в векторе гомологичной рекомбинации использованием разрыв ремонта, и (3), как заменить или тег интерес гены внутри этих векторов с использованием второго раунда recombineering. Наконец, мы также обеспечим протокол о том, как мобилизовать эти кассеты в естественных условиях для создания нокаут, либо помеченный ген через нок-ин. Эти методы могут быть легко принята для нескольких целей параллельно и обеспечивают средства для работы генома Drosophila своевременным и эффективным образом.

Introduction

Очистите молекулярно определенные манипуляции отдельных генов на их эндогенных локусов служат бесценным инструментом для изучения множество вопросов, связанных с эукариотической биологии. Drosophila обратном генетические методы для генерации потерей функции аллелей оказалось весьма сложным, пока Голик и его коллеги не введены в генного таргетинга естественных условиях с использованием гомологичной рекомбинации Drosophila 1-3. Они продемонстрировали, что специфичные локусы генома могут быть направлены с использованием линейного фрагмента ДНК из интегрированной конструкции трансгенных. Этот линейный "донора" ДНК генерируется в естественных условиях через FRT-опосредованной рекомбинации (акцизными ДНК из хромосомы в виде кольцевой молекулы) с последующей линеаризации с meganuclease I-SceI. Хотя эта методика была успешно использована для получения различных определено поражений, методика не было легко масштабируемым для манипулирования многочисленных генов параллельно, поскольку каждый индивидуальноеДвойная конструкция нокаутом требует четкой и индивидуальный дизайн. Например, трудности с плавно манипулирования крупных фрагментов ДНК (> 5 кб) в пробирке с использованием классических рестриктазы / лигирование клонирования или ПЦР, а также размер ограничения традиционных в естественных векторов преобразования часто мешает быстрого создания нацеливание гомологичной рекомбинации векторов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы объединили recombineering / трансгенез P [Acman] система, которая позволяет суб-клонирования и трансгенез до 100 кб ДНК, концы выезда генного таргетинга методологии для создания эффективной и сравнительно быстрого платформу, которая облегчает Drosophila генного таргетинга.

Рекомбинация-опосредованной генной инженерии (recombineering) является мощным гомологичной рекомбинации на основе технологии клонирования 4,5. В отличие от обычных рестриктазы / лигазы клонирование, recombineering не ограничено последовательностью или СИЗе манипулировать ДНК. Recombineering использует специальный E. Штамм, что таит в рекомбинации механизмов, предусмотренных дефектным λ профаге 4. Этот метод в последнее время были приняты для использования в Drosophila 6,7. Recombineering у дрозофилы опирается на изменение условно амплифицируемым бактериальные искусственные хромосомы (BAC) называется вектором P [Acman] 6,7. Этот вектор несет в себе два начала репликации: Орив, который производит высокого числа копий на химическую индукцию для очистки больших количеств ДНК, необходимыми для секвенирования и эмбрион инъекций и Oris, который поддерживает низким числом копий в базальных условиях. Кроме того, P [Acman] вектор оснащен прикрепление бактерий (ATTB) сайта. Сайт ATTB служит в качестве субстрата для ΦC31 интегразы-опосредованного трансгенеза, который позволяет включение больших фрагментов ДНК в заданном месте посадки в геноме дрозофилы 8,9.

Мы генерируются P [Acman] вектор (называемый P [Acman]-KO 1,0), который может быть использован в качестве вектора направленного на концах выезда гомологичной рекомбинации 10,11. Чтобы включить концы выезда генного таргетинга технологии в системе, мы добавили две FRT и два I-SceI сайтов. Мы также включили кассету шлюза в этом изменение вектора, чтобы упростить процесс включения гомологии оружия в P [Acman]-KO 1.0. Это обеспечивает быстрый и простой способ ввести практически любой геномной области, представляющей интерес в ориентации вектора. В этом протоколе мы опишем, как спроектировать ориентации вектора с использованием P [Acman] 1,0-KO, и как мобилизовать этот вектор в естественных условиях целевой эндогенный локус. Для целей настоящего Протокола мы будем использовать RFP / Кан кассеты заменить интересующего гена, но нескольких кассет, которые содержат антибиотик селективный маркер может быть использован с настоящим Протоколом. Мы разработали и успешно использовали набор кассетзамены гена и пометки 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выбор БАК и области на цель

  1. Для получения BAC с представляющим интерес геном (ПИ) (здесь CG32095 используется в качестве примера), поиск CG32095 в www.flybase.org . В разделе акции и реагенты, проверьте раздел "геномных клонов" для АСУ зданий содержащие CG32095. Убедитесь, что BAC включает по меньшей мере 10 т.п.н. слева и 5 т.п.н. вниз по течению гена. Кроме того, клоны в P [Acman] вектор 7 также могут быть найдены на http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. ВАС-клонов бывают DH10B клетки и P [Acman] аналоги прибывают в EPI300 клеток. Геномные клоны должны быть преобразованы в клетки SW102, которые поддаются на recombineering. "Dirty минипрепараты" выполняются (Qiagen минипрепаративных без использованием колонки и осаждением ДНК с использованием изопропанола), начинаяот 5 мл O / N культуру засевают клетками, содержащими BAC. После повторного приостановления недавно сделанный осадок ДНК в 20 мкл дН 2 O, развести в 1 мкл 100 мкл дН 2 O и использования 1 мкл до электропорации электрокомпетентных SW102. Чтобы электрокомпетентные SW102 использовать следующий протокол:
    1. Привить SW102 клеток в 4 мл LB. Расти культуры при 32 ° CO / N встряхиванием при 250 оборотах в минуту. Важно: Клетки SW102 никогда не должны подвергаться воздействию температуры выше 32 ° С, если индукции рекомбинации машины не требуется.
    2. Инокулируют 1 мл насыщенного SW102 культуры в 44 мл LB и расти на 32 ° C в шейкере OD 600 между 0,2-0,3 (обычно около 1-1,5 ч). Примечание: Другие протоколы recombineering рекомендовать выращивание культуры в меньшем объеме OD 600 0.6-0.7, однако растущих бактерий на более низкую плотность в большем объеме значительно увеличивает превращение efficieNCY 12. Кроме того, это изменение уменьшает время ожидания.
    3. Охладите культуры в ледяной воде суспензии в течение 5 мин. Важно: В следующих шагах клетки должны храниться при низких температурах. Это очень важно для получения хорошего качества электрокомпетентных клеток.
    4. Центрифуга культуры при 4 ° С при 1500 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант и промывают осадок в 25 мл холодного (4 ° C) 10%-ный глицерин 13. Во-первых, ресуспендирования клеток в 5 мл, нажав и закрученной трубки в ледяной воде суспензии (Не Внесите вверх и вниз), а затем добавить оставшиеся 10% глицерина (20 мл).
    5. Центрифугируют при 4 ° С при 1500 х г в течение 10 мин, отбросить супернатант и промывают осадок во второй раз с помощью 25 мл ледяной 10% глицерина.
    6. Центрифуга при 4 ° С при 1500 мкг в течение 10 мин, отбросить супернатант и мыть гранул в третий раз с 25 мл ледяной 10% глицерина.
    7. Центрифуга при 4 ° С при 1500 мкг в течение 10 мин и отбросить вирernatant. Осадок клеток может быть очень свободной в этой точке и следует проявлять осторожность, в которой удаление супернатанта. Ресуспендируют осадок в 1 мл холодного 10% глицерина. Передача клетки 1,5 мл трубки и центрифуги в течение 30 сек при 12 000 мкг в настольный микроцентрифужные при 4 ° C. Отменить большинство надосадочную жидкость, оставив ≈ 90 мкл глицерина / клетками. Клетки готов к электропорации. Примечание: В этой точке клетки можно хранить при -80 ° С для последующего использования. Однако это может снизить компетенции.
    8. Электропорации ДНК в клетки с использованием 1 мм кювете на 1800 В, 25 мкФ, 200 Ω. После электропорации добавляют 300 мкл SOC, и пусть клетки восстановить в течение 2 ч при 32 ° С (дрожание не требуется). Пластина клеток в LB-агар плюс 25 мкг / мл хлорамфеникола (или другие соответствующие антибиотики в зависимости от преобразованного ВАС или РАС) и инкубируют при 32 ° С в течение 24-30 часов.
  4. Плечами гомологии для генного таргетинга разработаны выберитеIng 10 Кб геномной ДНК выше и 5 КБ вниз по отношению к ГОИ. Выбрать 500 п.н. в конце 10 кб и 5 т.п.н. плечами гомологии, чтобы усилить (см. Раздел 2) (рис. 1). Эти 500 п.н. служить гомологии оружия, используемого для рекомбинации геномной области, окружающей ГОИ в P [Acman] KO 1.0. Эти фрагменты называют левой рукой (LA) для области, которая соответствует выше 5 'плечо гомологии и правую руку (RA) для области, которая соответствует по потоку 3' гомологии руки. Важно: плечами гомологии, не должны содержать BamHI сайты рестрикции, а линеаризация плазмиды (в п. 3.2) осуществляется с помощью дайджеста ограничение BamHI.

2. Вставьте плечами гомологии в P [Acman] 1,0-KO

  1. Созданы две отдельные реакции ПЦР, один для усиления Лос-Анджелесе и другое для усиления РА. Для LA, используйте праймеры attB1-I-SceI-LA-F и BamHI-LA-R и с помощью праймеров BamHI-RA-F и attB2-I-SceI-RA-Rдля усиления RA (табл. 1). Используйте 1 мкл ДНК из BAC шагом 1,2 или 0,5 мкл вареной ночной бактериальной культуры, содержащей BAC интерес в качестве шаблона. Убедитесь, что используются ДНК-полимеразы с возможностью корректуры. Это применимо ко всем последующим ПЦР, за исключением проверки ПЦР с шагом 2,8 и 3,13. Примечание: расширение времени для корректуры ДНК-полимераза может отличаться от обычного Taq ДНК-полимеразы в зависимости от производителя. PfuUltra II Fusion HotStart, который полимеризуется со скоростью 15 сек / кб, могут быть использованы в этих шагов.
    LA / RA ПЦР
    1 мкл ДНК из грязной минипрепаративных с шагом 1,2 Бак
    0,25 мкл 20 мкМ праймера
    2,5 мкл 10X PfuUltra II Буфер
    0,75 мкл 10 мМ (каждый) дНТФ
    0,5 мкл PfuUltra II Fusion HotStart ДНК-полимеразы
    19,75 мкл Воды
    25 мкл Общий объем
    Условия ПЦР
    Шаг 1 95 ° С 2 мин, чтобы активировать фермент
    Шаг 2 95 ° C 20 сек денатурации
    Шаг 3 60 ° C 20 сек отжига
    Шаг 4 72 ° С 20 с расширением
    Шаг 5 Перейдите к шагу 2 и повторите 29 циклов
    Шаг 6 4 ° C Удерживайте
  2. Выполнить образцов на 1% агарозном геле и извлекать продукты с использованием комплекта Zymoclean восстановления ДНК. Элюировать ДНК из Zymoclean колонки с помощью 10 мкл стерильной воды.
  3. Выполните сращивание перекрытием расширения (ПЦР SOE) с помощью двух фрагментов с использованием 10-30 нг тотальной ДНК из каждого амплифицированный продукт очищали 2,2 (рис. 2). Обычно это около 1/20-го числа каждого очищенного продукта ПЦР:
    LA / RA ПЦР-Сое
    0,5 мкл каждого LA и RA очищенного продукта ПЦР приблизительно 10-30 нг
    0,25 мкл 20 мкМ праймера
    2,5 мкл 10X PfuUltra II Буфер
    0,75 мкл 10 мМ (каждый) дНТФ
    0,5 мкл PfuUltra II Fusion HotStart ДНК-полимеразы
    19,25 мкл Воды
    25 мкл Общий объем
    Условия ПЦР
    Шаг 1 95 ° С 2 мин, чтобы активировать фермент
    Шаг 2 95 ° C 20 сек денатурации
    Шаг 3 55 ° C 20 сек отжига (Нижняя температура, чтобы обеспечить оружием для отжига)
    Шаг 4 72 ° С 20 с расширением
    Шаг 5 Перейдите к шагу 2 и повторите цикл 1
    Шаг 6 95 ° C 20 сек денатурации
    Шаг 7 60 ° C 20 сек отжига
    Step8 72 ° С 20 с расширением
    Step9 Перейдите к шагу 2 и повторите 27 циклов
    Шаг 10 4 ° C Удерживайте
  4. Запуск ПЦР образца на агарозном геле и восстановить группу 1,0 т.п.н. помощью гель-экстракции. Это attB1-LA-Bam HI-RA-attB2 кассету.
  5. Использование шлюза BP ClonaseII Фермент комплекта создать BP реакции в соответствии с протоколом, предоставляемых производителем.Кассета генерируется в 2,4 будет действовать в качестве ДНК донора и P [Acman]-KO 1.0 в качестве пункта назначения вектор.
  6. Развести 50 мкл TransforMax EPI300 электрокомпетентные клетки добавлением 30 мкл холодной 10% глицерина или холодной дН 2 O. Преобразование 1 мкл реакции BP в электрокомпетентные клетки в соответствии с протоколом, прилагаемым изготовителем. Добавление воды разбавляет достаточно высокую концентрацию соли в реакции BP, чтобы предотвратить электрический разряд (дуга) во время электропорации. Электропорации ДНК в клетки с использованием 1 мм кювете на 1800 В, 25 мкФ, 200 Ω.
  7. Добавить 300 мкл SOC и пусть клетки восстановить в течение 1 ч при 37 ° C (тряска не требуется). Пластина клеток в LB-агар + 50 мкг / мл Amp (P [Acman]-KO 1.0 содержит ген Amp сопротивление). Планшеты инкубируют при 37 ° С в течение 18-24 часов.
  8. ПЦР проверки отдельных колоний обычной колонии ПЦР с использованием Т3 (Т3 последовательность ниже по течению от шлюза кассету в P [Acman]-KO 1,0 (рис.рисунке 1) и attB1-I-SceI-LA-F праймеров. Положительные клоны покажет группа, которая работает на частоте 1,2 кб.
  9. Расти в течение ночи культуры позитивного клона в LB с 50 мкг / мл ампициллина.
  10. Усиление P [Acman] 1,0-KO вектор, содержащий LA и RA в 10 мл LB с 50 мкг / мл ампициллина культуры с использованием решения управления копированием в соответствии с протоколом производителя (Эпицентр).
  11. Выполните Qiagen минипрепаративных в соответствии с протоколом производителя.

3. Комбинирование геномной области интересов в P [Acman] 1,0-KO

День 1

  1. Инокулируйте SW102 клеток, содержащих BAC интереса в 4 мл LB плюс 25 мкг / мл хлорамфеникола (Chl) или соответствующий антибиотик выбора. Расти культуры при 32 ° CO / N встряхиванием при 250 оборотах в минуту. Важно: Кроме того, во время индукционной на шаге 3.5, SW102 клетки не должны подвергаться воздействию температуры выше 32 ° С, как высокая температура приводит в действие рекомбинации манальной этих клеток.

2-й день

  1. Дайджест 0,4 мкг P [Acman]-KO-1.0 содержащие LA и RA оружие генерируется в разделе 2 с ≈ 20 единиц BamHI в 25 мкл реакции. Инкубируют при 37 ° С в течение не менее 3 часов. Важно: долгое переваривание важно обеспечить усвоение всех ДНК. Это позволит сократить количество ложных срабатываний клонов позже.
  2. Инокулируют 1,0 мл насыщенного SW102/BAC культуры в 44 мл LB-Chl (25 мкг / мл) и растут на 32 ° C в шейкере OD 600 между 0,2-0,3 (обычно около 1-1,5 ч). В комплекте дополнительные идентичных образцов для не-HS управления. Этот пример будет рассматриваться как экспериментальная в каждом аспекте, за исключением HS. Это не-тепловому шоку культуры служит в качестве отрицательного контроля. Появление многих колониях на не-HS управления пластины (шаг 3,13) обычно указывает на преобразование с непереваренной P [Acman] KO 1,0 LA/ RA плазмиды.
  3. В то время как культура растет, запустите BamHI ограниченной P [Acman]-KO на геле. Затем гель-экстракции и элюции ДНК в 10 мкл воды нагревается до 55 ° C. ПРИМЕЧАНИЕ: Не элюирования ДНК в любом буфере. Соли в буфере может вызвать электрический разряд в течение электропорации.
  4. Теплового шока культуры при 42 ° С в течение 15 мин точно в ванну с водой. Это активирует recombineering аппарат клетки SW102. Не теплового шока управления культуры.
  5. Сразу после теплового шока, передачи тепловому шоку и не УГ культуры управления 50 мл охлажденной канонической трубы и пусть культур холод в ледяной воде суспензии в течение 5 мин. Важно: В следующих шагах клетки должны храниться при низких температурах . Это очень важно для получения хорошего качества электрокомпетентных клеток.
  6. Центрифуга культуры в 1500 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант и промывают осадок в 25 мл холодного (4 ° C) 10%-ный глицерин 13. Во-первых,Ресуспендируют клеток в 5 мл, нажав и закрученной трубки в ледяной воде суспензии (Не Внесите вверх и вниз), а затем добавить остальные 10% глицерина (20 мл).
  7. Центрифуга при 4 ° С при 1500 мкг в течение 10 мин, отбросить супернатант и мыть гранул с 25 мл ледяной 10% глицерина во второй раз.
  8. Центрифуга при 4 ° С при 1500 мкг в течение 10 мин, отбросить супернатант и мыть гранул с 25 мл ледяной 10% глицерина в третий раз.
  9. Центрифуга при 4 ° С при 1500 мкг в течение 10 минут и отбросить супернатант. Осадок клеток может быть очень свободной в этой точке и следует проявлять осторожность, в которой удаление супернатанта. Ресуспендируют осадок в 1 мл холодного 10% глицерина. Передача клетки 1,5 мл трубки и центрифуги в течение 30 сек при 12 000 мкг в настольный микроцентрифужные при 4 ° C. Отменить большинство надосадочную жидкость, оставив ≈ 90 мкл воды / клетки. Примечание: В этой точке клетки можно хранить при -80 ° С для последующего использования. Однако это может снизить компетенции.
  10. Добавить 2 мкл BamHI-расщепленную P [Acman] (цель на 50 нг) в клетки и осторожно перемешать с помощью пипетки наконечник. Передача клеток в 1 мм кювету для электропорации и электропорации при 1800 В, 25 мкФ, 200 Ω.
  11. Добавить 300 мкл SOC, и пусть клетки восстановить в течение 2 ч при 32 ° С (дрожание не требуется). Пластина клеток в LB-агар плюс 50 мкг / мл ампициллина, и инкубировали при 32 ° С в течение 24-30 часов.

3-й день

  1. Экран для правильного зазора-ремонтной мастерской с использованием ПЦР колоний. Используйте Т3 и РА проверить праймеров для РА и T7 и Луизиана ПРОВЕРИТЬ грунтовка для LA (табл. 1). Дизайн ПЦР-Check-РА и ПЦР-Check-LA праймеров 100-200 б.п. к целевой области (табл. 1). Положительные колонии от ПЦР-реакции с использованием ПЦР-Check-RA с Т3 или ПЦР-Check-LA с T7 покажет группа, которая работает на частоте 800-1000 б.п. (рис. 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы проверить обе руки с включением одного рукано не другие иногда наблюдается.
  2. Расти ПЦР-проверено колоний при 32 ° С в 4 мл LB +50 мкг / мл ампициллина в течение ночи. Сделайте замороженного этих клеток для последующего использования.

4. Замена геномной области с Таргетинг кассеты

4-й день

  1. Усиление RFP / KAN нокаутом кассеты методом ПЦР с использованием pENTR-RFP/KAN (приготовленный к употреблению с AscI и NheI для линеаризации) в качестве матрицы и 5'HA-RFP / Кан-F и 3'HA-RFP / Кан-R праймеров ( таблица 1). RFP / KAN кассета может быть запрошена у ссылкой 11.
  2. Гель для очистки ПЦР-продукт элюируют в 20 мкл стерильной воды. RFP-KAN кассеты плюс гомологии руки должны бегать 3 Kb.
  3. Инокулируют 1 мл насыщенного SW102 / P [Acman]-KO культуры (шаг 3,13) в 44 мл LB-Amp (50 мкг / мл) и растут на 32 ° C в шейкере OD 600 между 0,2-0,3. В комплекте дополнительные идентичных образцов для не-HS управления. Этот пример будет рассматриваться так же,как экспериментальная в каждом аспекте, за исключением HS.
  4. После SW102 / P [Acman]-KO культуры достигнет желаемой плотности, выполните шаги с 3,5 до 3,10.
  5. Электропорации примерно 100 нг ориентации кассеты в 90 мкл электрокомпетентных SW102 / P [Acman]-KO клеток. Передача клеток в 1 мм кювету для электропорации и электропорации при 1800 В, 25 мкФ, 200 Ω. Добавить 300 мкл SOC и позволяют клеткам восстановиться в течение 2 ч при 32 ° С (дрожание не требуется). ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать свежий геле кассету.
  6. Пластина клеток в LB-агар + Amp (50 мкг / мл) + Кана (50 мкг / мл) и инкубировали в течение 24-30 ч при 32 ° С.

День 5

  1. Вырастет на 5 мл культуры из 5 различных колоний при 32 ° CO / N.

День 6

  1. Выполните "грязных минипрепаративных" и запустить половину полученной ДНК в 1% агарозном геле искать PResence с низкой молекулярной массой плазмиды. Там не должно быть никаких плазмиды, которая проходит ниже 12 Кб. (Рис. 4)
  2. Сделать разведении 1:500 ДНК из положительного клона и используют 1 мкл до электропорации в 50 мкл TransforMax EPI300. Важно: Убедитесь, чтобы разбавить ДНК, чтобы предотвратить электропорации несколько плазмид в одной ячейке. Пластина клеток в LB-агар + Amp (50 мкг / мл) + Кана (50 мкг / мл) и инкубировали в течение 18-24 ч при 37 ° C

День 7

  1. Инокулируют одну колонию в 10 мл LB + и расти O / N.

День 8

  1. Семенной 100 мл LB среды с насыщенной культурой, начиная с шага 4,10. Добавить соответствующие антибиотики плюс 100 мкл 1000 X копию контрольного раствора и инкубировать при 37 ° С в течение 5-6 часов.
  2. Выполнение Maxiprep и проверить вставке кассеты в правильном месте секвенированием.
  3. В дополнение к последовательности, выполните ограничение Enzymэлектронной пищеварение тест с ДНК из клона, который не содержал низкомолекулярные плазмиды и его родительский ДНК. Рестриктаз выбран будет различным для каждого гена но цель, чтобы найти группу ферментов, которые позволяют исследователю характеризуют recombineered вектор. В качестве примера, CG32095 нацеливание вектор расщепляли последовательно PacI, AscI, BamHI и AatII. Внешний вид всех предсказанных полос и отсутствие каких-либо неправильных полос подтверждает, что адресный переносчик была правильно recombineered (рис. 5).

5. Потребители инъекционных мух и мобилизация кассеты In Vivo

  1. Введите кассета использованием ΦC31 интегразы, в предопределенных посадочной площадки выбора. Вне поставщики, такие как радуги трансгенных ( http://www.rainbowgene.com ), могут быть использованы для инъекций услуг. Важно: ДНК должна быть свежей рчистили перед инъекцией. Высшая эффективность трансформации наблюдается, когда ДНК получают на месте и вводят в тот же день.
  2. Чтобы мобилизовать кассету с места посадки, используйте Блумингтон инвентарный номер 25680 или 25679. Эти запасы содержат Flippase и I-SceI ниже промотора теплового шока, на хромосоме два и три, соответственно. Кроме того, они содержат HS-HID трансгенов на балансир хромосоме и на Y-хромосоме. Собирать мужчин от выбранной акции и переправиться на Виргинских женщин проведении кассеты нокаутом в месте посадки. . Set ~ 30 крестов и позволяют женщинам откладывать яйца в течение 2-3 дней Примечание: Рекомендуется выбирать акции, которая находится на другой хромосоме от целевого локуса.
  3. Флип родителей в новый набор из 30 флаконов и теплового шока личинки при 37 ° С в течение 1 час, дважды в день, в течение трех дней. Тепло шоков активировать производства ферментов; flippase и I-SceI, и ген гибели клеток скрывала
  4. Сбор Девы самок из F1 потомство тепловому шоку мух, и переправиться на Y - W - мужчины. Стремитесь к 150-200 кресты, три девы и трех мужчин на кресте.
  5. Экран F2 потомства под флуоресцентным сферу, что позволяет обнаруживать RFP в глаза. Экран для RFP положительные глаза, которые мутанта для белого и желтого генов (у - W -). Этот процесс отбора положительно выбирает на наличие кассеты ППП и выбирает отсутствия P [Acman] вектор (мини-белый) и посадки, который отмечен дикого типа гена желтый. Примечание: Это меньше времени -ConСчитая для выявления ППП в глаза, чем на начальный экран для мух уш. Мобилизация события являются очень эффективными во время жары потрясений, в результате чего многие меньше мух содержащие RFP в глаза, по сравнению с Y - W - мухи.
  6. Установить единый вязки паре друг с Y - W - RFP + лету, так как каждый случай мобилизации могут быть различными. Карта RFP к правильной хромосомой. Правильно таргетинг хромосомы, как правило, наблюдается в> 95% случаев.
  7. Создание запасов и проверьте правильность ориентации событий с помощью стандартных методов блот-анализе. Дизайн 2 т.п.н. зонд вверх (левая рука) и вниз (правая рука) гена мишенью и 2 кб (или меньше, если необходимо), охватывающих удален ORF. В первых двух зондов даст группа в гомозиготном и гетерозиготном нокаутов, что нет в дикого типа, в то время как ORF не будет уступать полосу в гомозиготной нокаутом. Быстрый ПЦР Fили ORF Также возможно, однако это зависит от отсутствия группу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Усиление LA и руки РА гомологии должна производить 500 б.п. продуктов и ПЦР-реакции SOE должны дать 1.0 KB продукта (разделы 2.1-2.4; рис. 2). BP реакции, проводимой в разделе 2.5, как правило, очень эффективным и бактериальные преобразований выходы продукта 5-100 колоний в среднем. Почти все колонии протестированы с ПЦР проверки показывают ожидаемого продукта ПЦР.

Во время первого тура recombineering (раздел 3) ожидать, чтобы получить 20-40 колоний после преобразования переваривается P [Acman]-KO-1.0 содержащие LA и RA оружия в клетках SW102. 40-60% из этих клонов будет нести нужного продукта рекомбинации. Не-теплового шока контроль должен содержать очень мало, если вообще колоний по сравнению с тепловому шоку клеток. Появление же количество колоний на обоих образцов и контроль пластин обычно указывает на присутствие плазмиды неразрезанные или другие загрязнения. В этом случае эксперимента шоусть быть отброшен и повторили, на этот раз переваривание P [Acman]-KO-1.0 несущий LA и RA оружие к завершению в соответствии с инструкцией описано в пункте 3.2. Пример проверки ПЦР для извлечения геномной области, представляющей интерес в P [Acman]-KO 1,0, в котором ≈ 60 колоний были получены показано на рисунке 3. Здесь 60% колоний испытании осуществляется нужную рекомбинации product.Care должно быть принято, что наблюдаемые продуктов ПЦР работать на предсказанного размера, так как аберрантными полос ПЦР обычно указывают неправильные события recombineering.

Иногда колонии не будет расти после первого раунда recombineering. Использование клеток с неоптимальной эффективности представляет собой наиболее распространенная причина неудачного recombineering реакции. Ведение клетки холодной в течение всего времени их получения и бережное обращение во время смывки (НИКОГДА вихрь) имеет решающее значение для получения высокого качества компетентных клеток. Старайтесь всегда использовать недавно переваривается / очищенной P [Acman]-Ко-1,0 ДНК, чтобы достичь наивысшей эффективности.

Иногда первый раунд recombineering колонии выход, но те колонии, не проходят проверку ПЦР. Обычно это означает, неправильные продукты recombineering но такой результат может также указывать на потенциальные проблемы с одним из наборов праймеров. Для подтверждения ПЦР-Check-LA грунтовки, создана ПЦР в сочетании с attB1-I-SceI-LA-F. Чтобы убедиться в ПЦР-Check-РА создана реакции ПЦР с помощью attB2-I-SceI-RA-R. В обоих случаях использовать исходный ВАС в качестве шаблона. Эти ПЦР-реакции должны давать продукты ожидаемого размера, который будет варьироваться в зависимости от последовательности проверки праймеров. Положительные результаты этого контрольного эксперимента исключает возможность того, что невозможность обнаружить положительных клонов связано с грунтовкой неэффективности.

Если вы пробовали первый раунд recombineering несколько раз выше после протокола без всякого успеха и выполнили всепредложил контроля, мы рекомендуем выбрать новую пару 500 б.п. гомологии оружия. По причинам, которые не ясно, в настоящее время, некоторые геномные регионы обладают высокой устойчивостью к рекомбинации ДНК. Просто проектировании новых вооружений гомологии и перемещение их к или от интересующего гена иногда решает эти проблемы.

Второй раунд recombineering (раздел 4), как правило, гораздо более эффективным. Обычно 30-50 колоний наблюдали после преобразования, с 90-95% из них, содержащие желаемый конструкции. Наиболее распространенная проблема на этом этапе является получение ложноположительных колоний. Рисунке 4 показаны примеры истинных и ложных положительных клонов после второго тура recombineering (раздел 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема рrocess генерировать P [Acman]-KO 1,0 ориентации вектора. изменениями из Чана и др.. (2012). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема сплайсинга перекрывающихся ПЦР (ПЦР SOE) выполняется на шаге 2.3. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. ПЦР-гель проверить показывающие эффективность первого recombineering событием Каждая дорожка представляет собой одну колонию:.. Колонии проверены на левой руке. интеграции с использованием T7 и LA-проверка праймеров Б: То же колонии, тестировали на правой руке интеграции использованием Т3 и RA-проверка primers.1kb Плюс ДНК маркера использовали как маркер молекулярной массы. ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за плохой грунтовки T3 Грунтовка относительно Т7 полос правой руки проверки были значительно темнее. Это должно быть принято во внимание при просмотре геля.

Рисунок 4
Рисунок 4. ДНК в агарозном геле показывает высокий молекулярный вес плазмид (P [Acman]) и низкой молекулярной массе плазмиды (непереваренные шаблона), выделенного из потенциальных положительных клонов после второго тура recombineering. ДНК была выделена из 4 потенциальных положительных клонов и побежал на 1% агарозном геле окрашивали этидийбромидом. Клоны 1,3 и 4 верны положительных клонов. Клон 2 является ложным срабатыванием одного как отмечают все формы AP lasmid который работает ниже 12 Кб (наибольший размер полосы в полосу ДНК зачет). 1 кб Плюс ДНК маркера использовали как маркер молекулярной массы.

Рисунок 5
Рисунок 5. Тест для желаемого события рекомбинации рестрикционных ферментов дайджеста. В приведенном выше примере показано предсказанных исчерченности Р [Acman]-KO CG32095 до и после второго раунда recombineering. Четыре различных ферментов были использованы: PacI, AscI, AatII и BamHI. Правильно рекомбинированное продукт будет иметь такое же группы, как его родительский P [Acman]-KO CG32095 за исключением предназначенных изменение (стрелки). NEBcutter V2.0 была использована для прогнозирования группа картины.

0346/50346fig6highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Схема описания мобилизации таргетинга кассету в естественных условиях. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Таблица 1
Таблица 1. Праймеров. Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сила генетических модельных организмов в биомедицинских исследованиях в значительной степени основана на инструменты для генетических манипуляций. Маленькие модели C. Элеганс дрозофилы и, в частности, позволяют недорогой и быстрой молекулярно-генетических анализов полной путей и семейств генов вовлечены в развитие многоклеточного или функции. В последние годы наблюдается значительный прогресс в развитии инструментов для манипулирования генами дрозофилы 14,15. Например, recombineering, который широко используется в мышиной генетики манипулировать конструкции Bac ДНК, недавно был адаптирован для Drosophila, посредством использования P [Acman] вектор и ΦC31-опосредованного трансгенез 6. Различные выбор кассет позволяют вставка или удаление специфических последовательностей в любом месте конструктов через компетентные бактерий рекомбинации 4,13. Мы модифицировали исходный P [Acman] вектор так, что он может быть использован для построения у дрозофилы. Это новый вектор позволяет генерировать ориентации кассет с большими плечами гомологии, чем те, которые могут быть легко сделаны использованием вырезать и вставлять методы клонирования. Кроме того, шлюз-клонированием кассеты также были включены в этот вектор, позволяющий быстро и эффективно внедрять новые геномной ДНК в систему.

Хотя большая часть методологии, описанной здесь проста, есть несколько шагов, которые мы нашли решающее значение для успеха этого метода. Из-за размера манипулировать ДНК (> 15 кб), первый раунд recombineering реакции (раздел 3) представляет собой значительное техническое препятствие. Следовательно, этот раунд recombineering требует очень эффективной рекомбинации протокола. Видимо незначительные корректировки протокола, как и выращивания клеток в более низкую плотность, стиральная клетки три раза вместо двух и 10% глицерина вместо дН 2 </ Суб> O 13, значительно улучшилась эффективность трансформации нашего recombineering компетентных клеток. Кроме того, заботясь, чтобы убедиться, что LA / RA содержащих P [Acman] обрезают до завершения с BamHI (шаг 3.1) устраняет много ложных срабатываний.

Нежелательных событий рекомбинации представляют собой еще один довольно распространенная проблема во время recombineering. Например, мы наблюдали случаи дублирования и перемещения в различных конструкциях. Эти события могут привести к нескольким проблемам в процессе трансформации Drosophila и в естественных условиях генного таргетинга. ПЦР проверки и анализа последовательности не может обнаружить все эти события. Таким образом, анализ рестрикционных ферментов должна быть выполнена на конечный продукт клонировали до инъекции ДНК в эмбрионах. Это окончательная проверка оказалось необходимым и позволило нам избежать инъекционного конструкций, которые содержат нежелательную аберраций.

Макси-готовит вектора направленного непосредственно перед инъекциюперегиба и никогда не замораживание ДНК значительно повышает эффективность трансформации этих больших конструкций в дрозофилы. Короче говоря, небольшие детали имеют большое значение в успехе этих методов. Протоколы изложены и продемонстрировали здесь представляют идеи из ряда различных источников и наш собственный опыт.

Хотя мы надеемся, Протокол, представленные здесь помогает другим принять recombineering методы в своих лабораториях, мы считаем, дальнейшего улучшения и усовершенствования методологии по-прежнему возможны. Иногда специфических фрагментов геномной трудно манипулировать использованием recombineering по причинам, которые не являются полностью очевидными. Кроме того, несмотря на все наши усилия по ликвидации нежелательного фона, мы по-прежнему считают, что определенные части геномной ДНК, как правило, производят неправильно recombineered конечных продуктов. Более глубокое понимание recombineering процесса может дать более оптимальный протоколов в будущем и открытое обсуждениеrecombineering неудачи и успехи будут способствовать успешному применению этих мощных методов более широким научным сообществом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующие интересы в отношении методов, изложенных здесь.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Уго Bellen и Центр Блумингтон фондовую реагентов. Мы также благодарим Коэн Venken, Хьюго Bellen и все члены Buszczak и Hiesinger лаборатории за полезные обсуждения. Работа выполнена при поддержке грантов от Национального института здравоохранения ACR (T32GM083831), ВНР (RO1EY018884) и MB (RO1GM086647), грант по профилактике рака научно-исследовательского института в Техасе Мб и ВНР (RP100516) и Welch Foundation (I-1657), чтобы PRH. МБ EE и Грир Гарсон Фогельсона Scholar в биомедицинских исследованиях и PRH является выпускником школы Евгения McDermott в биомедицинских исследованиях в Техасском медицинском центре.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Генетика выпуск 77 биоинженерии молекулярная биология биомедицинская инженерия физиология, Генетика (животных и растений) Recombineering, Гомологичной рекомбинации нокаут рекомбинация генная инженерия генного таргетинга ген гены ДНК ПЦР грунтовки секвенирование животной модели
Recombineering Гомологичная рекомбинантные конструкции в<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter