Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Homolog rekombinasyon Oluşumlar Recombineering Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Homolog rekombinasyon teknikleri büyük ölçüde ilerletmek

Abstract

Endojen gen loci hızlı, büyük ölçekli manipülasyon teknikleri sürekli gelişimi insan hastalığı ile ilgili araştırmalar için bir genetik model organizma olarak Drosophila melanogaster kullanımını genişletecek. Son yıllarda homolog rekombinasyon ve Recombineering gibi teknik gelişmeler gördük. Ancak, kesin boş mutasyonlar veya etiketleme endojen proteinleri üreten genlerin çoğu için önemli bir çaba olmaya devam etmektedir. Burada, in vivo olarak endojen loci hedef ve işlemek için kullanılabilir vektörler oluşturmak için Recombineering tabanlı klonlama yöntemleri kullanarak teknikleri tarif ve göstermek Özellikle, üç teknolojileri bir arada kurduk:. (1) BAC transgenesis / Recombineering, ( 2) biter-out homolog rekombinasyon ve (3) Ağ Geçidi teknolojisi endojen genomik lokus işlemek için sağlam, verimli ve esnek bir yöntem sağlamaktır. Bu protokol, nasıl (1) tasarım individua hakkında adım adım ayrıntılarıl vektörleri, (2) boşluk tamir, ve (3) nasıl Recombineering bir ikinci tur kullanarak bu vektörlerin içinde ilgi genleri değiştirmek veya etiketlemek için kullanarak homolog rekombinasyon vektörü genomik DNA büyük parçaları klonlamak için nasıl. Son olarak, biz de bir nakavt, veya knock-in üzeri etiketli gen oluşturmak için in vivo olarak bu kasetleri harekete geçirmek için nasıl bir protokol sağlayacaktır. Bu yöntemler kolayca paralel olarak birden çok hedef için kabul edilen ve zamanında ve verimli bir şekilde Drosophila genom işlemek için bir araç sağlamak olabilir.

Introduction

Kendi endojen bölgelerinin tek genlerin moleküler tanımlı manipülasyonlar temizlemek ökaryot biyoloji ile ilgili soru sayısız incelemek için paha biçilmez bir araç sunuyor. Drosophila kaybı fonksiyon-allel üretmek için genetik teknikleri ters Golic ve arkadaşları tanıtıldı kadar zorlu olduğu kanıtlanmış oldu İn vivo gen Drosophila 1-3 ile homolog rekombinasyon kullanılarak hedefleme. Bu, belirli bir genomik lokus entegre bir yapı transgenik DNA doğrusal bir fragmanı kullanılarak hedef olabilir gösterdi. Bu doğrusal "donör DNA" meganuclease I-SCEI ile doğrusal takip FRT-aracılı rekombinasyon (tüketim için dairesel bir molekül olarak kromozom DNA) ile in vivo olarak oluşturulur. Bu yöntem başarılı bir şekilde tanımlanan lezyonların çeşitli oluşturmak için kullanılmış olsa da, bu teknik paralel çok sayıda gen manipülasyonu için kolayca ölçeklenebilir olmamıştır, çünkü her vermemekÇift eleme yapı farklı ve özel tasarım gerektirir. Örneğin, sorunsuz bir şekilde klasik bir kısıtlama enzimi / ligasyon klonlama veya PCR, hem de in vivo transformasyon vektörleri de geleneksel boyut sınırlamaları kullanılarak in vitro olarak DNA (> 5 kb) arasında büyük parçaları manipüle güçlükler çoğu hedefleme homolog rekombinasyon hızla oluşmasına müdahale vektörler. Bu sınırlamaları aşmak için, uçları aşımı geni etkin ve nispeten hızlı bir platform kurmak için metodoloji hedef ile, DNA'nın 100 kb kadar alt klonlama ve transgenesis sağlar Recombineering / transgenesis P [ACMAN] sistemi, kombine Drosophila gen hedef kolaylaştırır.

Rekombinasyon aracılı genetik mühendisliği (Recombineering) 4,5 güçlü bir homolog rekombinasyon bazlı klonlama teknolojidir. Geleneksel sınırlama enzim / ligaz klonlama aksine, Recombineering sırası veya siz ile sınırlı değildirmanipüle DNA e. Recombineering özel E. kullanır kusurlu bir λ profajının 4 tarafından sağlanan rekombinasyon makine barındırır coli. Bu teknik son zamanlarda Drosophila 6,7 kullanılmak üzere kabul edilmiştir. Drosophila Recombineering P [ACMAN] 6,7 adlı değiştirilmiş bir şartlı çoğaltılabilir bakteriyel yapay kromozom (BAC) vektör dayanır. OriV, sekanslama ve embriyo enjeksiyon ve bazal koşullar altında, düşük kopya sayısı, tutar ORIS için gerekli DNA büyük miktarlarda saflaştırılması için kimyasal indüksiyon üzerine yüksek kopya sayısında üretir: Bu vektör, replikasyon kökeni iki taşır. Ayrıca, P [ACMAN] Vektör bakteriyel bir eki (attB) sitesi ile donatılmıştır. AttB Alanı Drosophila 8,9 genomu içinde önceden tespit edilmiş bir iniş yeri içine büyük DNA parçalarının birleşme sağlar ΦC31 integraz aracılı transgenezis için bir alt-tabaka olarak hizmet vermektedir.

Bu sona Çıkış homolog rekombinasyon 10,11 için bir hedefleme vektörü olarak kullanılabilecek bir p [ACMAN] vektörü (p [ACMAN]-KO, 1.0 olarak anılacaktır) üretmiştir. Sisteme hedefleme teknolojisi dahil biter-out gen, iki ÖN ve iki I-SCEI siteleri ekledi. Ayrıca P [ACMAN]-KO 1.0 içine homoloji silah içeren süreci kolaylaştırmak için bu modifiye vektör içinde bir ağ geçidi kaset dahil ettik. Bu hedef vektör içine ilgi hemen hemen her genomik bölge tanıtmak için hızlı ve kolay bir yol sağlar. Bu protokolde P [ACMAN]-KO 1.0, ve nasıl endojen odağı hedef in vivo olarak bu vektör harekete geçirmek için kullanarak bir hedef vektör mühendisi nasıl anlatacağız. Bu protokolün amaçla, ilgili genin yerine RFP / Kan kaseti kullanır, ancak bir antibiyotik seçim işaretleyici içeren kasetlerinin çeşitli Bu protokol kullanılabilir. Bu kaset, bir dizi için tasarlanmış ve başarılı bir şekilde kullanılmışgen değiştirme ve etiketleme 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BAC seçimi ve Hedef Bölge

  1. Ilgi gen (GOI) (burada CG32095 bir örnek olarak kullanılmıştır), de CG32095 için arama ile bir BAC elde etmek www.flybase.org . Bölümü hisse senedi ve reaktifler altında, CG32095 içeren BAC'ler için, "Genomik klonlar" başlıklı bölümüne bakın. BAC en az 10 kb yukarısında ve 5 kb ilgi çekici alt geni içeren emin olun. Alternatif olarak, P [ACMAN] vektör 7 klonlar da bulunabilir http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. BAC klonları DH10B hücrelerini gelir ve P [ACMAN] klonlar EPI300 hücreler gelir. Genomik klonlar Recombineering için müsait SW102 hücreleri, dönüştürülmesi gerekir. "Kirli minipreps" başlangıç ​​(bir sütun kullanarak ve izopropanol kullanarak DNA girmeden bir Qiagen miniprep) yapılmaktadır5 ml'lik bir O / N kültürden BAC içeren bir hücre ile aşılanmıştır. DH 2 O 20 ul taze yapılmış DNA pelet yeniden askıya sonra, dH 2 O 100 ul içine 1 ul sulandırmak ve elektrokompetent SW102 electroporate 1 ul kullanın. Elektrokompetent SW102 aşağıdaki protokol faydalanmak için:
    1. 4 ml LB içine SW102 hücreleri inoküle. 32 kültür büyütün ° CO / N 250 rpm sallayarak Önemli:. Rekombinasyon makine indüksiyon istenen sürece SW102 hücreleri 32 ° C daha yüksek bir sıcaklığa maruz ASLA.
    2. 44 ml LB içine doymuş SW102 kültürünün 1 ml aşılamak ve 0.2-0.3 (genellikle yaklaşık 1-1.5 saat) arasında OD 600 32 ° C çalkalayıcı üzerinde büyümek NOT:. Diğer Recombineering protokoller için daha küçük bir hacimde kültür büyüyen tavsiye OD 600 0.6-0.7, ancak daha büyük bir hacim içinde daha düşük bir yoğunluğa, bakteri gelişimini önemli ölçüde dönüşüm efficie artarNCY 12. Buna ek olarak, bu değişiklik bekleme süresini azaltır.
    3. 5 dakika buz-su karışımları içinde kültür soğutun Önemli:. Aşağıdaki adımları sırasında, hücreler düşük sıcaklıkta tutulmalıdır. Bu iyi kalitede, elektrik hücreleri elde etmek için çok önemlidir.
    4. 10 dakika boyunca 1500 x g'de 4 ° C'de kültüre santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 25 ml soğuk (4 ° C),% 10 gliserol, 13 pelet yıkayın. İlk olarak, buzlu su bulamaç içinde tüp dokunarak ve dönen tarafından 5 ml tekrar süspansiyon hücreleri (pipet ve aşağı yukarı YAPMAYIN) ve kalan% 10 gliserol (20 ml) ekleyin.
    5. 10 dakika boyunca 1500 x g'de 4 ° C sıcaklıkta santrifüj, supernatant ve 25 ml buz gibi soğuk bir% 10 gliserol ile pelet bir kez yıkayın.
    6. 10 dakika boyunca 1500 x g'de 4 ° C sıcaklıkta santrifüj, supernatant ve 25 ml buz gibi soğuk bir% 10 gliserol ile pelet üçüncü kez yıkayın.
    7. 10 dakika 1500 x g'de 4 ° C'de santrifüj ve destek atmakernatant. Hücre pelet bu noktada çok gevşek olabilir ve ne zaman atarak süpernatant dikkat edilmelidir. Soğuk% 10 gliserol, 1 ml pelletini. 1.5 ml tüpüne aktarılır ve 4 ° C de bir masa mikrosantrifüj içinde 12,000 x g'da 30 saniye boyunca santrifüj Gliserol / hücre ≈ 90 ul süpernatan bırakarak en atın. Hücreler artık electroporated hazırdır NOT:. Bu noktada hücreleri ° C daha sonra kullanılmak üzere -80 saklanabilir. Ancak, bu yetki azaltabilir.
    8. 1.800 V, 25 μF, 200 Ω bir 1 mm küvet kullanarak hücrelerin içine DNA electroporate. Elektroporasyon işleminden sonra 300 ul SOC ekleyin ve 32 hücreleri 2 saat boyunca geri sağlar ° C (çalkalama) gerekli değildir. Plaka LB agar hücreleri artı 25 ug / ml kloramfenikol (ya da dönüştürülmüş BAC veya PAC bağlı olarak diğer uygun antibiyotik) ve 24-30 saat boyunca 32 ° C'de inkübe edin.
  4. Hedef gen için homoloji silah seçin tarafından tasarlanmıştıring yukarı genomik DNA 10 kb ve GOI aşağı göre 5 kb. 10 kb'lik ucunda 500 bp ve yükseltilmesi için 5 kb homoloji kollar (Bkz. Bölüm 2) (Şekil 1) seçin. Bu 500 bp parçaları P [ACMAN] KO 1.0 içine GOI çevreleyen genomik bölge rekombinasyona için kullanılan homoloji kolları olarak hizmet vermektedir. Bu fragmanlar homoloji kol 'alt-3 karşılık gelen bölge için homoloji kol ve sağ kol (RA)' yukarı 5 karşılık gelen bölgenin sol kol (LA) olarak adlandırılır Önemli:. Homoloji kollar BamHI içermemelidir kısıtlama bölgeleri, plazmid doğrusallaştırma olarak (adım 3.2) bir BamHI kısıtlama sindirimi ile gerçekleştirilir.

2. P [ACMAN]-KO 1.0 içine Homoloji Arms takın

  1. Iki ayrı PCR reaksiyonları kurmak, bir RA yükseltmek için LA ve başka bir yükseltmek için. LA için, astar attB1-I-SCEI-LA-F ve BamHI-LA-R kullanın ve astar BamHI-RA-F ve attB2-I-SCEI-RA-R kullanınRA (Tablo 1) yerleştirilmektedir. Adım 1.2 ya da bir şablon olarak ilgili BAC içeren bir gece kaynatılmış bakteri kültürü 0.5 ul ikinci BAC DNA 1 ul kullanımı. Redaksiyon yeteneğine sahip bir DNA polimeraz kullandığınızdan emin olun. Bu adımları 2.8 ve 3.13 olarak PCR kontrolü dışında PCR-ile sonraki tüm için geçerlidir NOT:. Bir redaksiyon DNA polimeraz için uzatma süresi üreticisine bağlı olarak düzenli Taq DNA polimeraz farklı olabilir. 15 sn / kb'lik bir oranda polimerize PfuUltra II Füzyon HotStart, şu adımları kullanılabilir.
    LA / RA PCR
    1 ul Bac adım 1.2 'den kirli miniprep DNA
    0.25 ul Her 20 mcM Primer
    2.5 ul 10X PfuUltra II Tampon
    0.75 ul 10mM (her biri) dNTP
    0.5 ul PfuUltra II Füzyon HotStart DNA Polimeraz
    19.75 ul Su
    25 ul Toplam Hacim
    PCR koşulları:
    Step1 Enzim aktif hale getirmek için 95 ° C 2 dk
    Adım 2 95 ° C'de 20 saniye denatüre
    Adım 3 60 ° C'de 20 saniye tavlama
    Adım 4 72 ° C'de 20 saniye uzatma
    Adım 5 2 adım ve 29 döngüleri tekrar Git
    Step6 4 ° C tutun
  2. % 1 agaroz jel üzerinde örnekleri çalıştırın ve bir Zymoclean DNA kurtarma kiti kullanılarak ürünleri ayıklayın. Steril su içinde 10 ul Zymoclean sütundan elute DNA.
  3. (PCR S uzantısı üst üste ile yapıştırma gerçekleştirin2.2 (Şekil 2), saflaştırıldı, her amplifiye edilen ürünün toplam DNA bölgesinin 10-30 ng kullanılarak iki parça ile OE). Bu, genellikle yaklaşık her saflaştırılmış PCR ürünü 1/20 th:
    LA / RA PCR-Soe
    0.5 ul her LA ve RA saflaştırılmış PCR ürünü yaklaşık 10-30 ng
    0.25 ul her 20 mcM Primer
    2.5 ul 10X PfuUltra II Tampon
    0.75 ul 10mM (her biri) dNTP
    0.5 ul PfuUltra II Füzyon HotStart DNA Polimeraz
    19.25 ul Su
    25 ul Toplam Hacim
    PCR koşulları:
    Step1 Enzim aktif hale getirmek için 95 ° C 2 dk
    Adım 2 95 ° C'de 20 saniye denatüre
    Adım 3 55 ° C 20 saniye (tavlama silah sağlamak için alt geçici.) Tavlama
    Adım 4 72 ° C'de 20 saniye uzatma
    Adım 5 2 adım ve 1 döngü tekrar Git
    Step6 95 ° C'de 20 saniye denatüre
    Step7 60 ° C'de 20 saniye tavlama
    Step8 72 ° C'de 20 saniye uzatma
    9. adım 2 adım ve 27 döngüleri tekrar Git
    10. adım 4 ° C tutun
  4. Bir agaroz jeli üzerinde PCR örneği çalıştırmak ve jel ekstraksiyonu ile 1.0 kb bandı iyileşir. Bu attB1-LA-BamHI-RA-attB2 kasetidir.
  5. Üretici tarafından sağlanan protokol sonrasında BP tepki kurmak için Ağ Geçidi BP ClonaseII Enzim kiti kullanın.2.4 'de elde edilen kaset donör DNA ve hedef vektör olarak p [ACMAN]-KO, 1.0 olarak hareket edecektir.
  6. Soğuk% 10 gliserol veya soğuk dH 2 O 30 ul ekleyerek TransforMax EPI300, elektrik hücrelerin 50 ul sulandırmak Üretici tarafından sağlanan protokol izlenerek, elektrik hücrelere BP reaksiyonu 1 ul dönüşümü. Su ilavesi sırasında elektroporasyon elektriksel deşarj (ark) önlemek için BP reaksiyon oldukça yüksek tuz konsantrasyonuna seyreltilir. 1.800 V, 25 μF, 200 Ω bir 1 mm küvet kullanarak hücrelerin içine DNA electroporate.
  7. SOC 300 ul ekleyin ve 37 hücreleri 1 saat geri izin ° C (sallayarak gerekli değildir). Plaka LB-agar hücreleri + Amp (P [ACMAN]-KO 1.0 bir Amp direnç geni içeren) 50 mg / ml. 18-24 saat 37 ° C'de inkübe edin.
  8. PCR P [ACMAN]-KO 1.0 (Şekil Ağ Geçidi kaset aşağı olan T3 (T3 dizisi kullanarak geleneksel koloni PCR ile tek tek koloniler kontrolyerine 1) ve attB1-I-SCEI-LA-F astarlar. Pozitif klonlar 1.2 kb çalışır bir grup gösterecektir.
  9. 50 mg / ml ampisilin ile LB olumlu bir klonu bir gecede kültür büyütün.
  10. 50 mg / üreticinin protokolü (Epicentre) takip kopya koruma çözümü kullanarak ml ampisilin kültürü ile bir 10 ml LB LA ve RA içeren P [ACMAN]-KO 1.0 vektör yükseltmek.
  11. Imalatçının protokolü takip edilerek, bir Qiagen miniprep gerçekleştirin.

3. P [ACMAN]-KO 1.0 içine İlgi Genomik Bölgesi yeniden birleştirilmesini

1. Gün

  1. 4 ml LB artı 25 ug / ml kloramfenikol (Chl) ya da uygun bir antibiyotik seçimi içine ilgi BAC ihtiva eden SW102 hücreleri inoküle. 32 kültür büyütün ° CO / N 250 rpm sallayarak Önemli:. Yüksek sıcaklık rekombinasyon ma aktive ederken yanında adım 3.5 indüksiyon sırasında, SW102 hücreleri, 32 daha yüksek ° C sıcaklığa maruz kalmamalıdırBu hücrelerin chinery.

2. Gün

  1. P [ACMAN] bir Digest 0.4 mg 25 ul reaksiyon BamHI bir ≈ 20 birimleri ile Bölüm 2'de üretilen LA ve RA silah içeren-KO-1.0. En az 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin Önemli:. Uzun sindirim tüm DNA sindirim sağlamak için çok önemlidir. Bu daha sonra yanlış pozitif klonların sayısı azalacaktır.
  2. 44 ml LB-Chl (25 mg / ml) içine doymuş SW102/BAC kültürü 1.0 mL aşılamak ve 0.2-0.3 (genellikle yaklaşık olarak 1-15 saat) arasındaki OD 600, 32 ° C'de çalkalayıcı üzerinde büyür. Olmayan HS kontrolü için ek bir aynı örnek ekleyin. Bu örnek sadece HS dışında her açıdan deney gibi muamele edilecektir. Bu ısıl şok kültür bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Olmayan HS kumanda paneli (adım 3.13) birçok kolonilerin görünümü genellikle sindirilmemiş P [ACMAN] KO 1.0 LA ile dönüşüm gösterirPlazmid / RA.
  3. Kültür giderek artarken, bir jel üzerinde BamHI-kısıtlı P [ACMAN]-KO çalıştırın. Daha sonra jel ayıklamak ve su 10 ul DNA Zehir 55 ısınmış ° C NOT: Herhangi bir tampon DNA Zehir etmeyin. Tampon mevcut tuzları elektroporasyon sırasında elektriksel boşalma neden olabilir.
  4. Su banyosu içinde tam olarak 15 dakika süreyle 42 ° C de ısı-şok kültürü. Bu SW102 hücrelerinin Recombineering makine aktive eder. Şok Kontrol kültür ısıtmayın.
  5. Hemen sonra, ısı-şok, ısı transferi-şok ve non-HS, kontrol kültürleri soğutulmuş 50 mi kanonik tüpler ve 5 dakika için bir buz-su karışımları içinde kültürleri soğuk izin Önemli:. Aşağıdaki adımları sırasında, hücreler düşük sıcaklıkta tutulmalıdır . Bu iyi kalitede, elektrik hücreleri elde etmek için çok önemlidir.
  6. 10 dakika için 1500 xg'de kültür santrifüj. Süpernatant atılır ve 25 ml soğuk (4 ° C),% 10 gliserol, 13 pelet yıkayın. İlk olarak,buz-su bulamaç (pipet ve aşağı yukarı YAPMAYIN) ve sonra da kalan% 10 gliserol (20 ml) ekleyin yılında tüp dokunarak ve dönen tarafından 5 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
  7. 10 dakika boyunca 1500 x g'de 4 ° C sıcaklıkta santrifüj, supernatant ve 25 ml buz gibi soğuk bir% 10 gliserol, ikinci bir kez yıkayın pelet.
  8. 10 dakika boyunca 1500 x g'de 4 ° C sıcaklıkta santrifüj, supernatant ve 25 ml buz gibi soğuk bir% 10 gliserol, üçüncü kez ile pelet yıkayın.
  9. 10 dakika için 1500 xg'de 4 ° C'de santrifüj ve supernatant atın. Hücre pelet bu noktada çok gevşek olabilir ve ne zaman atarak süpernatant dikkat edilmelidir. Soğuk% 10 gliserol, 1 ml pelletini. 1.5 ml tüpüne aktarılır ve 4 ° C de bir masa mikrosantrifüj içinde 12,000 x g'da 30 saniye boyunca santrifüj . Su / hücre NOT ≈ 90 ul bırakarak süpernatant en atmak: Bu noktada hücreler az -80 ° C daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Ancak, bu yetki azaltabilir.
  10. 2 ul ekleyin BamHI-sindirilmiş P [ACMAN] (50 ng için amaç) hücrelere ve bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. 1 mm elektroporasyon küvet içinde hücreleri aktarın ve 1.800 V, 25 μF, 200 Ω de electroporate.
  11. SOC 300 ul ekleyin ve 32 hücreleri 2 saat boyunca geri sağlar ° C (çalkalama) gerekli değildir. Plaka LB agar pil, 24-30 saat 32 ° C'de 50 mg / ml ampisilin ve inkübe.

3. Gün

  1. Uygun boşluk-onarım kullanarak koloni PCR için ekran. RA ve T7 ve LA (Tablo 1) LA kontrol astar için astar kontrol T3 ve RA kullanın. PCR-Check-RA ve hedeflenen bölgeye yönelik PCR-Check-LA astar 100-200 bp (Tablo 1) tasarlayın. . T3 veya T7 ile PCR-Check-LA ile PCR-Check-RA kullanılarak PCR reaksiyonları Olumlu koloniler 800-1,000 bp (Şekil 3) NOT çalışır bir grup gösterecektir: Bu birinin kurulduğundan bu yana her iki kol test etmek için önemlidir kolancak diğer değil bazen görülmektedir.
  2. LB 50 ug / ml ampisilin gece boyunca 4 mL içinde 32 ° C 'de koloni PCR ile doğrulanır büyütün. Daha sonra kullanmak için bu hücrelerin dondurulmuş bir stok yapmak.

4. Hedefleme Kaset ile Genomik Bölge değiştirilmesi

4. Gün

  1. Bir şablon ve 5'HA-RFP / Kan-F ve 3'HA-RFP / Kan-R primerleri (olarak pENTR-RFP/KAN (linearize için Aşçı ve Nhel ile predigested) kullanarak PCR ile RFP / KAN nakavt kaset yükseltmek Tablo 1). RFP / KAN kaset referans 11 talep edilebilir.
  2. Jel, steril su, 20 ul içinde yıkanarak PCR ürünü saflaştırmak. TTT-KAN kaset artı homoloji kolları 3 kb etrafında koşmak gerekir.
  3. 44 ml LB-Amp (50 mg / ml) içine doymuş SW102 / P [ACMAN]-KO kültür (adım 3.13) 1 ml aşılamak ve ° C çalkalayıcı OD 600 0.2-0.3 arasında 32 büyür. Olmayan HS kontrolü için ek bir aynı örnek ekleyin. Bu örnek sadece tedavi olacakHS dışında her açıdan deney gibi.
  4. SW102 / P [ACMAN]-KO kültür istenilen yoğunluğu ulaştıktan sonra, 3,5 3.10 için adımları izleyin.
  5. Elektrokompetent SW102 / P [ACMAN]-KO hücrelerin 90 ul içine kaset hedef yaklaşık 100 ng electroporate. 1 mm elektroporasyon küvet içinde hücreleri aktarın ve 1.800 V, 25 μF, 200 Ω de electroporate. SOC 300 ul ekleyin ve hücreler 32 2 saat kurtarmak için izin ° C (sallayarak gerekli değildir) NOT:. Oldukça kaset saf yeni bir jel kullanılması tavsiye edilir.
  6. LB agar + Amp (50 mg / ml) + Kan (50 mg / ml) ve 32 24-30 saat inkübe ° C plaka hücreleri

Gün 5

  1. 32 ° CO / N. az 5 farklı koloniler kültür 5 ml büyütün

6. Gün

  1. Bir "kirli miniprep" gerçekleştirin ve pr aramak için bir% 1 agaroz jel üzerinde elde edilen DNA yarısı çalıştırmakPlazmid, düşük molekül ağırlıklı aroması. Feryat 12 kb çalışan herhangi bir plazmid olmamalıdır. (Şekil 4)
  2. Olumlu bir klon DNA bir 1:500 seyreltme yapmak ve TransforMax EPI300 50 ul içine electroporate 1 ul kullanın Önemli:. Bir hücre içinde birden fazla plazmid elektroporasyon önlemek için DNA sulandırmak için emin olun. LB agar + amp (50 mg / ml) içinde Plaka hücreleri + Kan (50 ug / ml) ve 37 saat boyunca 18-24 ° C'de inkübe

7. Gün

  1. LB + 10 ml tek bir koloni aşılamak ve O / N büyümeye

8. Gün

  1. Adım 4.10 doymuş kültürü ile LB ortamı Tohum 100 mi. Uygun antibiyotik artı 5-6 saat için 37 ° C'de 1000 X kopyasını kontrol çözümü ve inkübe 100 ul ekleyin.
  2. Bir Maxiprep gerçekleştirin ve sıralama ile doğru sitede kasetin ekleme doğrulayın.
  3. Dizilime ek olarak, bir kısıtlama enzim gerçekleştirmekHerhangi bir düşük molekül ağırlıklı plazmid ve ebeveyn DNA içermeyen bir klon DNA ile e sindirim testi. Seçilen restriksiyon enzimleri her gen için farklı olacaktır ama hedef recombineered vektör karakterize etmek için araştırmacı izin bir grup enzimin bulmaktır. Örnekleme yoluyla, CG32095 hedefleme vektörü seri Paci, ASCI, BamHI ve AatII ile sindirildi. Yanlış bantları tüm tahmin bantları ve yokluğu görünümü hedef vektör doğru (Şekil 5) recombineered onaylar.

5. Sinekler enjekte ve In Vivo Kaset seferber

  1. Seçtiğiniz bir önceden tanımlanmış iniş sitesine, ΦC31 integraz kullanarak kaset enjekte edilir. Bu Rainbow Transgen (gibi dış satıcılar, http://www.rainbowgene.com ), enjeksiyon hizmetleri için kullanılabilir Önemli:. DNA taze p olmalıdırEnjeksiyon öncesi repared. Daha yüksek dönüşüm etkinliği, DNA yerinde hazırlanan olduğunda gözlemlenen ve aynı gün enjekte edilir.
  2. Iniş sitesinden kaset seferber Bloomington, stok numarası 25680 veya 25679 kullanın. Bu hisse senetleri sırasıyla kromozom iki ve üç, bir ısı şok organizatörü Flippase ve I-SCEI aşağı, içerir. Buna ek olarak, bu dengeleyici kromozom ve Y-kromozomu üzerinde HS-saklandı transgen içerir. Seçilen stoktan erkek toplayın ve iniş sitesinde KO kaset taşıyan bakire kadın için çapraz. . Set ~ 30 haçlar ve kadınlarda 2-3 gün yumurtalarını bırakmak için izin NOT: Bu hedeflenen odağı farklı bir kromozom üzerinde stok seçmeniz önerilir.
  3. Kapak 30 şişeleri yeni bir dizi içine anne ve üç gün boyunca 1 saat için 37 ° C'de ısı şok larva, günde iki kez,. Isı şoku enzimlerin üretimini aktive; flippase ve-SCEI ve hücre ölümü gen saklandı
  4. Isı-şok sinek F1 döl gelen bakire kadın toplayın, ve y çapraz - w - erkek. Üç bakireler ve çapraz başına üç erkek; 150-200 haç hedefleyin.
  5. Göz TTT tespiti sağlayan bir floresan kapsamında F2 döl ekran. Beyaz ve sarı genler (- w - y) için mutant olan TTT olumlu gözler için ekran. Bu tarama işlemi olumlu RFP kaset varlığı için seçer ve yabani tip sarı gen NOT ile işaretlenir P [ACMAN] vektör (mini-beyaz) ve iniş, yokluğunda için seçer:. Daha az zaman -conyw sinekler için ilk ekran daha, göz RFP için ekrana onaylar. W - - sinekler seferberlik olaylar y ile karşılaştırıldığında, göz TTT içeren çok daha az sinek sonuçlanan, ısı şokları sırasında çok verimlidir.
  6. Her seferberlik olay farklı olabilir çünkü, TTT + fly - w - her y ile tek bir çift çiftleşme ayarlayın. Doğru kromozom için RFP Harita. Doğru kromozom hedefleme tipik durumda,>% 95 olarak gözlenmiştir.
  7. Stokları oluşturulması ve Southern Blot Analizi için standart teknikler kullanılarak doğru hedefleyen etkinlikler için kontrol edin. 2 kb prob yukarı (sol kol) ve alt (sağ kolu) genin hedef olma ve silinen ORF kapsayan 2 kb (veya gerekirse daha kısa) tasarlayın. İlk iki prob ORF homozigot nakavt bir grup vermez ederken, wild tip mevcut değil, homozigot ve heterozigot tırnakları bir grup verecektir. Hızlı bir PCR fya da ORF da mümkündür, ancak bu bir grup yokluğunda dayanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LA ve RA homoloji silah yükseltme 500 bp ürünler üretmek gerektiğini ve PCR-KİT reaksiyon 1.0 kb ürün (Bölüm 2,1-2,4; Şekil 2) boyun eğmek zorundadır. 2.5 bölümünde gerçekleştirilen BP reaksiyon tipik ürün verimleri ortalama 5-100 kolonilerin çok verimli ve bakteriyel bir dönüşümdür. Yaklaşık PCR ile test bütün sömürgeler beklenen PCR ürün göstermek kontrol edin.

Recombineering ilk turda (Bölüm 3) sırasında sindirilmiş P dönüşüm sonra 20-40 koloniler almak için bekliyoruz [ACMAN] SW102 hücrelere LA ve RA silah içeren-KO-1.0. Bu klonların% 40-60 istenen rekombinasyon ürünü taşıyacak. Herhangi bir koloni olarak ısı-şok hücrelere karşılaştırıldığında ısıl şok kontrolü çok az içermelidir. Numune ve kontrol plakaları hem de koloni aynı sayıda kesilmemiş görünümü genellikle plazmid veya başka kirletici gösterir. Bu durumda, deney siteld atılır ve tekrar edilebilir, P [ACMAN] sindirerek bu kez adım 3.2 'de açıklanan talimat sonrasında tamamlanması için LA ve RA silah taşıma-KO-1.0. ≈ 60 koloni elde edildiği p [ACMAN]-KO, 1.0, ilgi genomik bölge geri alınması için bir PCR onay bir örneği Şekil 3'te gösterilmektedir. Kolonilerin İşte 60% istenen rekombinasyon product.Care anormal PCR bantları genellikle yanlış Recombineering olayları işaret etmesinden dolayı gözlenen PCR ürünleri, tahmin boyutu çalıştırmak dikkat edilmelidir yapılan test edilen.

Arada bir koloni Recombineering ilk turundan sonra büyüyecek. Alt-optimal verim ile hücreler kullanarak başarısız bir Recombineering reaksiyonu için en yaygın nedeni temsil eder. Yıkar sırasında hazırlanması ve yumuşak taşıma (ASLA vorteks) sırasında her zaman soğuk hücreleri tutarak yüksek kaliteli yetkili hücreleri elde etmek için önemlidir. Her zaman kullanmaya çalışın taze sindirilmiş / P [ACMAN]-KO-saflaştırılmış1.0 DNA'nın yüksek verimi elde edildi.

Bazen Recombineering verim koloniler ancak bu kolonilerin ilk tur PCR kontrol testi geçemiyor. Bu genellikle yanlış Recombineering ürünleri gösteren ancak böyle bir sonucu da primer setleri biri ile olası sorunları gösterebilir. PCR-Check-LA astar doğrulamak için, attB1-I-SCEI-LA-F ile birlikte bir PCR reaksiyonu kurmak. PCR-check-RA attB2-I-SCEI-RA-R ile bir PCR reaksiyonu ayarlamak. Doğrulamak için Her iki durumda da, bir şablon olarak orijinal BAC kullanın. Bu PCR reaksiyonları, onay primerlerin sırası bağlı olarak değişecektir beklenen boyut ürünler, verim gerekir. Bu kontrol deneyi olumlu sonuçlar pozitif klonlar tespit etmek için bir yetersizlik astar verimsizlik nedeniyle olma olasılığını ekarte edecek.

Eğer herhangi bir başarı olmadan yukarıdaki protokolü takip birkaç kez Recombineering ilk turda denedim ve tüm gerçekleştirdiysenizkontrolleri önerdi, biz 500 bp homoloji kolları yeni bir çift tercih etmenizi öneririz. Şu anda net değil nedenlerden dolayı, bazı genomik bölgelerde DNA rekombinasyon karşı oldukça dirençlidir. Sadece yeni homoloji silah tasarımı ve ilgi gen doğru veya uzak taşıyarak bazen bu sorunları çözer.

Recombineering yılının ikinci turu (Bölüm 4) genellikle çok daha etkilidir. Normalde 30-50 koloniler istenen yapıyı içeren bu% 90-95 olan, dönüşüm sonra gözlenir. Bu aşamada en yaygın sorun yanlış pozitif koloniler elde edilir. Şekil 4 Recombineering ikinci tur (Bölüm 4) sonra doğru ve yanlış pozitif klonların örneklerini gösterir.

Şekil 1
Şekil 1. P şematikroses bir P [ACMAN] oluşturmak için-KO 1.0 hedef vektör. Chan ve ark Modifiye. (2012). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. PCR (PCR KİT) adım 2.3 üzerinde yapılan üst üste ile yapıştırma şematik. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. İlk Recombineering olayın jel gösteren verimlilik PCR-kontrol Her şeritli tek bir koloni temsil eden:.. Kolonileri sol kol için test. T7 ve LA-kontrol primerler kullanılarak entegrasyon B:. T3 ve RA-kontrol primers.1kb Ayrıca DNA Ladder bir moleküler ağırlık belirteci olarak kullanılmıştır kullanarak NOT sağ kolu entegrasyon için test bir ile aynı koloniler,: T3 kötü astar nedeniyle T7 göre astar, sağ kol çek bantları önemli ölçüde daha koyu idi. Jel inceleyen bu durum göz önüne alınmalıdır.

Şekil 4,
Şekil 4. DNA'nın agaroz jel DNA'nın 4 potansiyel pozitif klon izole edilmiştir. Yüksek molekül ağırlıklı plasmidleri (p [ACMAN]) ve Recombineering ikinci tur sonra potansiyel pozitif klon izole edilmiş düşük moleküler ağırlıklı bir plazmid (sindirilmemiş şablon) olduğu ve bunun, bir% 1 agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı etidyum bromür ile boyandı. Klon 1,3 ve 4 gerçek pozitif klonlar vardır. Clone 2 gibi ap tüm formları tarafından belirtildiği bir yanlış pozitif biridir lasmid bu feryat 12 kb (DNA merdiveni şeritli en büyük boyutu bandı) çalışır. 1 kb DNA merdiven Ayrıca, moleküler ağırlık belirteci olarak kullanıldı.

Şekil 5,
Şekil 5,. Restriksiyon enzim sindirimi tarafından istenen rekombinasyon olayı test edin. Yukarıdaki örnekte gösterilen bir bilgisayar tahmin-KO CG32095 önce ve Recombineering, ikinci turdan sonra P [ACMAN] bir bantlama desen. Dört farklı enzimler kullanılmıştır: Paci, Aşçı, AatII ve BamHI. Doğru yeniden bir araya ürün amaçlanan değişim (ok başları) dışında kendi ebeveyn P [ACMAN]-KO CG32095 aynı bantları olacak. NEBcutter V2.0 grup desen tahmin için kullanılmıştır.

0346/50346fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
In vivo bir hedefleme kaset harekete açıklayan Şekil 6.. Şematik. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Tablo 1
Tablo 1.. Astarlar. daha büyük bir tablo görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biyomedikal araştırmalarda genetik model organizmaların gücü büyük ölçüde genetik manipülasyon için mevcut araçları dayanmaktadır. Küçük modelleri C. Özellikle elegans ve Drosophila çok hücreli geliştirme veya fonksiyon rol tam yollar ve gen ailelerin ucuz ve hızlı moleküler genetik analizler için izin verir. Son yıllarda Drosophila 14,15 genlerin işlemek için araç gelişiminde önemli gelişmeler gördük. Örneğin yaygın olarak kullanılan Bac DNA yapıları işlemek için fare genetik kullanılır Recombineering, son zamanlarda P [ACMAN] vektörü ve ΦC31 aracılı transgenezis 6 aracılığıyla, Drosophila için adapte edilmiştir. Farklı seçim kasetleri rekombinasyon yetkili bakteri 4,13 kullanarak bir yapı içinde herhangi bir yerde özel dizilerinin ekleme veya silme için izin verir. Bu değiştirilmiş asıl p [ACMAN] o oluşturmak için de kullanılabilir, böylece vektör Drosophila endojen hedef lokuslarının in vivo homolog rekombinasyon vektörleri. Bu yeni vektör kolayca kesme ve yapıştırma klonlama yöntemleri kullanılarak yapılabilir ki bu daha büyük homolojiye kollar ile hedef kaset oluşturmak için bir olanak sağlar. Ayrıca, ağ geçidi-klonlama kaseti aynı zamanda bir hızla ve verimli bir şekilde sisteme yeni genomik DNA tanıtmak için izin vererek, bu vektör içine dahil edilmiştir.

Burada açıklanan metodolojinin en basit olmasına rağmen, biz tekniğin başarısı için kritik bulduk birkaç adım vardır. Manipüle DNA (> 15 kb) büyüklüğü nedeniyle, Recombineering reaksiyon ilk turda (Bölüm 3) önemli bir teknik engel teşkil etmektedir. Bu nedenle, Recombineering bu turda çok etkin bir rekombinasyon protokolü gerektirir. , Daha düşük yoğunluk elde etmek için hücrelerin büyüme yerine iki yerine dH 2,% 10 gliserol ile hücreler üç kere yıkama gibi görünen küçük ayarlamalar protokolü, </ Sub> O 13, büyük ölçüde Recombineering yetkili hücrelerinin dönüşüm verimliliği geliştirdik. Buna ek olarak, emin olmak için özen LA / içeren RA P [ACMAN] BamHI (Adım 3.1) birçok yanlış pozitif ortadan kaldırır ile tamamlanması için kesilir.

İstenmeyen rekombinasyonların Recombineering sırasında başka oldukça yaygın bir sorun temsil eder. Örneğin, çeşitli yapıları içinde tekrarları ve translokasyonların durumlarda gözlemledik. Bu olaylar, Drosophila dönüşümü sırasında ve in vivo gen hedefleme birden sorunlara yol açabilir. PCR doğrulama ve dizi analizi bu olayların tüm algılayamaz. Bu nedenle, bir restriksiyon enzim analizi embriyolara DNA'nın klonlanmış önce son ürün üzerinde gerçekleştirilmelidir. Bu son kontrol kritik kanıtlamış ve bize istenmeyen sapmaları içeren yapıları enjekte önlemek için izin verdi.

Sadece inj önce hedef vektör Maxi-hazırlıyorection ve DNA dondurma hiçbir önemli ölçüde Drosophila içine bu büyük yapıları transformasyon etkinliğini artırır. Kısacası, küçük ayrıntılar bu tekniklerin başarısında büyük bir fark yaratabilir. Protokoller özetlenen ve farklı kaynaklardan ve kendi deneyim bir dizi anlayışlar temsil burada gösterdi.

Burada sunulan protokol kendi laboratuarlarında Recombineering yöntemleri benimsemeye diğerleri yardımcı olur umarım, biz metodoloji daha fazla gelişmeler ve iyileştirmeler hala mümkün olduğuna inanıyoruz. Bazen, belirli genomik parçaları tamamen açık değildir nedenlerle Recombineering kullanarak işlemek için zordur. Ayrıca, istenmeyen arka plan ortadan kaldırmak için elimizden geleni çabalarına rağmen, biz hala genomik DNA belirli parçalarını yanlış recombineered son ürünler üretmek eğiliminde olduğunu bulmak. Recombineering sürecinin daha derin bir anlayış geleceği ve açık bir tartışma daha iyi protokolleri verebilirhataları ve başarı öyküleri Recombineering daha geniş araştırma topluluğu tarafından bu güçlü tekniklerin başarılı kullanımı teşvik edecek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar burada özetlenen teknikleri ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması yok.

Acknowledgments

Biz Hugo Bellen ve reaktifler için Bloomington Stok Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Biz daha yararlı tartışmalar için Koen Venken, Hugo Bellen ve Buszczak ve Hiesinger laboratuarları tüm üyeleri teşekkür ederiz. Bu çalışma ACR için Ulusal Sağlık Enstitüsü (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) hibe tarafından ve MB (RO1GM086647), MB ve PRH (RP100516) için Texas Kanser Önleme Araştırma Enstitüsü tarafından hibe ve Welch için desteklenmiştir PRH için Vakfı (I-1657). MB Biyomedikal Araştırma ve PRH bir EE ve Greer Garson Fogelson Akademik olan UT Güneybatı Tıp Merkezi Biyomedikal Araştırma bir Eugene McDermott Akademik olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Genetik Sayı 77 Biyomühendislik Moleküler Biyoloji Biyomedikal Mühendisliği Fizyoloji, Genetik (hayvan ve bitki) Recombineering, Homolog Rekombinasyon Knock-out rekombinasyon genetik mühendisliği gen hedefleme gen gen DNA PCR astarlar sıralama hayvan modeli
Homolog rekombinasyon Oluşumlar Recombineering<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter