Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Recombineering homolog rekombinasjon konstruerer i Published: July 13, 2013 doi: 10.3791/50346
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

Summary

Homolog rekombinasjon teknikker sterkt fremme

Abstract

Den videre utviklingen av teknikker for rask, storskala manipulering av endogene genloci vil utvide bruken av Drosophila melanogaster som en genetisk modell organisme for human-sykdom forskning. De siste årene har tekniske fremskritt som homolog rekombinasjon og recombineering. Men generere entydige null mutasjoner eller tagging endogene proteiner fortsatt en betydelig innsats for de fleste gener. Her beskriver vi og demonstrerer teknikker for bruk av recombineering-baserte metoder for kloning for å generere vektorer som kan brukes for å målrette og manipulere endogene loci in vivo Konkret er det etablert en kombinasjon av tre forhold: (1). BAC transgenesis / recombineering, ( 2) ender ut homolog rekombinasjon og (3) Gateway teknologi for å gi en robust, effektiv og fleksibel metode for å manipulere endogene genomisk loci. I denne protokollen, gir vi trinn-for-trinn detaljer om hvordan du (1) utforming individual vektorer, (2) hvordan å klone store fragmenter av genomisk DNA inn i homolog rekombinasjon vektor ved hjelp av gap reparasjon, og (3) hvordan å erstatte eller merke gener av interesse innenfor disse vektorer ved hjelp av en ny runde med recombineering. Til slutt vil vi også gi en protokoll for hvordan å mobilisere disse kassetter in vivo for å generere en knockout, eller en merket genet via knock-in. Disse metodene kan lett bli vedtatt for flere mål i parallell og gi et middel for å manipulere Drosophila genomet på en riktig og effektiv måte.

Introduction

Rengjør molekylært-definerte manipulasjoner av single gener på deres endogene loci tilby et uvurderlig verktøy for å studere et mylder av spørsmål som er relevante for eukaryote biologi. Reversere Drosophila genetiske teknikker for å generere tap-av-funksjon alleler hadde vist seg å være utfordrende til Golić og kolleger introdusert i vivo gene targeting bruke homolog rekombinasjon til Drosophila 1-3. De viste at bestemte genomiske loci kan man ved å bruke et lineært fragment av DNA fra et integrert transgen konstrukt. Denne lineære "donor" DNA er generert in vivo ved FRT-mediert rekombinasjon (å skjære DNA fra kromosomet som et sirkulært molekyl) etterfulgt av linearisering med meganuclease I-SCEI. Selv om denne metoden har blitt brukt til å generere et antall definerte lesjoner, har teknikken ikke vært lett skalerbar for manipulering av mange gener i parallell fordi hvert enkeltdual knockout konstruere krever tydelig og tilpasset design. For eksempel, vanskeligheter sømløst manipulere store fragmenter av DNA (> 5 kb) in vitro ved bruk av klassisk restriksjonsenzym / ligering kloning eller PCR, samt størrelse begrensninger på tradisjonell in vivo transformasjon vektorer ofte i konflikt med rask etablering av homolog rekombinasjon målretting vektorer. For å overvinne disse begrensninger kombinerte vi den recombineering / transgenesis P [ACMAN]-system, som tillater den sub-kloning og transgenesis på opptil 100 kb av DNA, med endene ut-genet targeting metode for å etablere en effektiv og relativ rask plattformen forenkler Drosophila gene targeting.

Rekombinasjon-mediert genteknologi (recombineering) er en kraftig homolog rekombinasjon-baserte kloning teknologi 4,5. I motsetning til konvensjonelle restriksjonsenzym / ligase kloning, er recombineering ikke begrenset av sekvensen eller size av den manipulerte DNA. Recombineering bruker en spesiell E. coli stamme som havner rekombinasjon maskiner levert av en defekt λ prophage fire. Denne teknikken har nylig blitt tatt i bruk i Drosophila 6,7. Recombineering i Drosophila er avhengig av en modifisert betinget amplifibart bakteriell kunstig kromosom (BAC) vektor kalt P [ACMAN] 6,7. Dette vektor bærer to opprinnelsen til replikering: OriV, som produserer high-kopi nummer etter kjemisk induksjon for rensing av store mengder DNA som kreves for sekvensering og embryo injeksjon og åpninger, som opprettholder lav-kopi nummer under basale forhold. I tillegg, P [ACMAN] vektor er utstyrt med en bakteriell tilknytningssted (attB) område. Den attB området fungerer som et substrat for ΦC31 integrase-mediert transgenesis som gjør at inkorporering av store DNA-fragmenter til en forhåndsbestemt landingssted i Drosophila genom 8,9.

Vi har generert en P [ACMAN] vektor (referert til som P [ACMAN]-KO 1,0) som kan bli brukt som en målsøkende vektor for-ender ut homolog rekombinasjon 10,11. Å innlemme ender ut gene targeting teknologi inn i systemet, la vi to FRT og to I-SCEI nettsteder. Vi har også inkludert en Gateway kassett innenfor denne modifiserte vektor for å effektivisere prosessen med å innlemme de homologidomene armene i P [ACMAN]-KO 1.0. Dette gir en hurtig og enkel måte å innføre praktisk talt en hvilken som helst genomisk region av interesse i målrettingsverdien vektor. I denne protokollen vil vi beskrive hvordan du ingeniør en målretting vektor ved hjelp av P [ACMAN]-KO 1.0, og hvordan å mobilisere denne vektor in vivo å målrette den endogene locus. For formålet med denne protokollen vil vi bruke RFP / Kan kassett som erstatter et gen av interesse, men en rekke kassetter som inneholder et antibiotikum seleksjonsmarkør kan brukes med denne protokoll. Vi har designet og hell brukt et sett med kassetter forgenet utskifting og tagging 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Valg av BAC og regionen til Target

  1. Å skaffe seg en BAC med genet av interesse (GOI) (her CG32095 brukes som et eksempel), søk etter CG32095 på www.flybase.org . Under avsnittet aksjer og reagenser, sjekk avsnittet, "Genomiske Clones" for BACS inneholder CG32095. Kontroller at BAC inkluderer minst 10 kb oppstrøms og 5 kb nedstrøms genet av interesse. Alternativt kan kloner i P [ACMAN] vektor 7 også bli funnet på http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
  2. BAC kloner kommer i DH10B celler og P [ACMAN] kloner kommer i EPI300 celler. De genomisk kloner trenger å bli forvandlet til SW102 celler, som er mottagelig for recombineering. "Dirty minipreps" utføres (en Qiagen minipreparering uten å bruke en kolonne og utfelling av DNA ved hjelp av isopropanol) starterfra en 5 ml O / N-kultur inokuleres med celler som inneholder BAC. Etter re-suspensjon av den ferske DNA pellet i 20 mL av dH 2 O, fortynne en ul i 100 mL av dH 2 O og bruke en ul å electroporate electrocompetent SW102. For å gjøre electrocompetent SW102 bruke følgende protokoll:
    1. Inokuler SW102 celler til 4 ml av LB. Grow kultur ved 32 ° CO / N rist ved 250 rpm. Viktig: SW102 celler bør aldri utsettes for en temperatur høyere enn 32 ° C, med mindre induksjon av rekombinasjon maskiner er ønsket.
    2. Inokuler 1 ml av den mettede SW102 kulturen inn i 44 ml LB og vokse på en 32 ° C rister til OD 600 mellom 0,2-0,3 (vanligvis omtrent 1-1,5 timer). MERK: Andre recombineering protokoller anbefalt voksende kulturen i et mindre volum for å OD 600 0,6-0,7, men vokser bakteriene til en lavere tetthet i et større volum øker betydelig transformasjon efficieNCY 12. I tillegg reduserer denne modifikasjon ventetiden.
    3. Avkjøl kultur i is-vann oppslemming i 5 min. Viktig: I løpet av de følgende trinn celler må holdes på lave temperaturer. Dette er avgjørende for å oppnå god kvalitet electrocompetent celler.
    4. Sentrifuger kultur ved 4 ° C ved 1500 x g i 10 min. Kast supernatanten og vaske pelleten i 25 ml kald (4 ° C) 10% glycerol 13. Først resuspender celler i 5 ml ved å banke og virvlende røret i isvann slurry (Ikke pipetter opp og ned) og deretter legge de resterende 10% glyserol (20 ml).
    5. Sentrifuger ved 4 ° C ved 1500 xg i 10 min, kast supernatanten og pelleten vaskes en gang med 25 ml iskald 10% glyserol.
    6. Sentrifuger ved 4 ° C ved 1500 xg i 10 min, kast supernatanten og pelleten vaskes en tredje gang med 25 ml iskald 10% glyserol.
    7. Sentrifuger ved 4 ° C ved 1500 x g i 10 min og kast supernatant. Cellen pellet kan være veldig løs på dette punktet og omsorg bør tas når du kaster supernatanten. Resuspender pellet i 1 ml kald 10% glyserol. Overfør cellene til et 1,5 ml rør og sentrifugeres i 30 sekunder ved 12 000 xg i en bordplate mikrosentrifuge ved 4 ° C. Kast det meste av supernatanten forlater ≈ 90 pl av glycerol / celler. Cellene er nå klar til å bli elektroporert NB. På dette tidspunkt cellene kan bli lagret ved -80 ° C for senere bruk. Dette kan imidlertid redusere kompetanse.
    8. Electroporate DNA inn i celler ved hjelp av en 1 mm skål på 1800 V, 25 mF, 200 Ω. Etter elektroporering, tilsett 300 mL av SOC og la cellene gjenopprette for to timer ved 32 ° C (risting er ikke nødvendig). Plate celler på LB-agar pluss 25 ug / ml kloramfenicol (eller andre egnede antibiotika avhengig av den transformerte BAC eller PAC) og inkuber ved 32 ° C i 24-30 timer.
  4. Homologidomene armene for gene targeting er designet av selecting 10 kb genomisk DNA oppstrøms og fem kb nedstrøms i forhold til GOI. Velg 500 bp på slutten av 10 kb og 5 kb homologidomene armene til å forsterke (Se del 2) (figur 1). Disse 500 bp fragmenter tjene som homologidomene armene brukes til å rekombinerer genomisk regionen rundt GOI inn P [ACMAN] KO 1.0. Disse fragmentene blir referert til som venstre arm (LA) for den regionen som tilsvarer den oppstrøms 5 'homologi arm og høyre arm (RA) for den regionen som tilsvarer den nedstrøms 3' homologi arm Viktig:. Homologi armene skal ikke inneholde BamHI restriksjonsseter, som linearisering av plasmidet (i trinn 3.2) oppnås via et BamHI begrensning digest.

2. Sett inn homologi Arms i P [ACMAN]-KO 1.0

  1. Sett opp to individuelle PCR reaksjoner, en å forsterke LA og en annen til å forsterke RA. For LA, bruker primere attB1-I-SCEI-LA-F og BamHI-LA-R og bruke primere BamHI-RA-F og attB2-I-SCEI-RA-Rfor å forsterke RA (tabell 1). Bruk en ul av BAC DNA fra trinn 1.2 eller 0.5 ul av kokt over natten bakteriekultur som inneholder BAC av interesse som en mal. Sørg for å bruke en DNA polymerase med korrekturlesing evne. Dette gjelder alle etterfølgende PCRs-med unntak av PCR sjekk i trinn 2.8 og 3.13. MERK: Extension tid for en korrekturlesing DNA polymerase kan være forskjellig fra vanlig Taq DNA polymerase avhengig av produsenten. PfuUltra II Fusion Hotstart, som polymeriserer med en hastighet på 15 sek / kb, kan brukes i disse trinnene.
    LA / RA PCR
    1 ul DNA fra skitne minipreparering fra trinn 1.2 av Bac
    0,25 ul Hver 20 mikrometer Primer
    2,5 pl 10X PfuUltra II Buffer
    0.75 ul 10mm (hver) dNTP
    0.5 ul PfuUltra II Fusion Hotstart DNA Polymerase
    19.75 ul Vann
    25 ul Total Volume
    PCR-betingelser
    Trinn 1 95 ° C 2 min for å aktivere enzymet
    Trinn 2 95 ° C 20 sek denaturerer
    Trinn 3 60 ° C 20 sek annealing
    Step4 72 ° C 20 sek forlengelse
    Step5 Gå til trinn 2 og gjenta 29 sykluser
    Step6 4 ° C Hold
  2. Kjøre prøver på en 1% agarose gel og pakke produkter ved hjelp av en Zymoclean DNA recovery kit. Eluere DNA fra Zymoclean kolonne med 10 pl sterilt vann.
  3. Utfør skjøting av overlappende forlengelse (PCR SOE) med de to fragmenter ved anvendelse av 10-30 ng av totalt DNA fra hvert amplifisert produkt renset på 2.2 (Fig. 2). Dette er vanligvis rundt 1/20 th av hvert renset PCR produkt:
    LA / RA PCR-Soe
    0.5 ul hver LA og RA renset PCR produkt ca 10-30 ng
    0,25 ul hver 20 mikrometer Primer
    2,5 pl 10X PfuUltra II Buffer
    0.75 ul 10mm (hver) dNTP
    0.5 ul PfuUltra II Fusion Hotstart DNA Polymerase
    19.25 ul Vann
    25 ul Total Volume
    PCR-betingelser
    Trinn 1 95 ° C 2 min for å aktivere enzymet
    Trinn 2 95 ° C 20 sek denaturerer
    Trinn 3 55 ° C 20 sek gløding (Lower temp. For å tillate våpen til anneal)
    Step4 72 ° C 20 sek forlengelse
    Step5 Gå til trinn 2 og gjentar en syklus
    Step6 95 ° C 20 sek denaturerer
    Step7 60 ° C 20 sek annealing
    Step8 72 ° C 20 sek forlengelse
    Step9 Gå til trinn 2 og gjenta 27 sykluser
    Step10 4 ° C Hold
  4. Kjør PCR prøven på en agarose gel og gjenopprette 1,0 kb bandet av gel utvinning. Dette er attB1-LA-BamHI-RA-attB2 kassett.
  5. Bruk Gateway BP ClonaseII enzym kit for å sette opp en BP reaksjon etter protokollen gitt av produsenten.Kassetten ble generert på 2.4 vil fungere som donor DNA og P [ACMAN]-KO 1.0 som destinasjon vektor.
  6. Fortynn 50 pl TransforMax EPI300 electrocompetent celler ved å tilsette 30 ul kald 10% glyserol eller kald dH 2 O. Forvandle en ul av BP reaksjon i electrocompetent celler følge protokollen gitt av produsenten. Tilsetningen av vann fortynner ganske høy saltkonsentrasjon av BP reaksjonen for å forhindre elektrisk utladning (lysbuedannelse) i løpet av elektroporering. Electroporate DNA inn i celler ved hjelp av en 1 mm skål på 1800 V, 25 mF, 200 Ω.
  7. Tilsett 300 pl av SOC og la cellene komme i 1 time ved 37 ° C (risting er ikke nødvendig). Plate celler på LB-agar + 50 mg / ml Amp (P [ACMAN]-KO 1.0 inneholder en Amp motstand genet). Inkuber platene ved 37 ° C i 18-24 timer.
  8. PCR kontrollere individuelle kolonier av konvensjonell koloni PCR bruker T3 (T3 sekvensen er nedstrøms av Gateway kassett i P [ACMAN]-KO 1,0 (Figure 1) og attB1-I-SCEI-LA-F primere. Positive kloner vil vise et band som kjører på 1,2 kb.
  9. Dyrk en overnatting kultur på en positiv klone i LB med 50 mikrogram / ml ampicillin.
  10. Forsterke P [ACMAN]-KO 1,0 vektor inneholdende LA og RA i en 10 ml LB med 50 mg / ml ampicillin kultur ved å kopiere kontroll løsning følge produsentens protokoll (Epicentre).
  11. Utfør en Qiagen minipreparering følge produsentens protokoll.

3. Recombining den Genomic Region of Interest inn P [ACMAN]-KO 1.0

Dag 1

  1. Inokuler SW102 celler som inneholder BAC av interesse inn i 4 ml LB pluss 25 ug / ml kloramfenikol (Chl) eller den passende valg antibiotikum. Dyrk kulturen ved 32 ° CO / N rysting ved 250 rpm. Viktig: I tillegg under induksjon i trinn 3.5, bør SW102 celler ikke eksponeres for en temperatur som er høyere enn 32 ° C, i så høy temperatur aktiverer rekombinasjon maChinery av disse cellene.

Dag 2

  1. Digest 0,4 mikrogram av P [ACMAN]-KO-1.0 inneholder LA og RA armene genereres i § 2 med ≈ 20 enheter av BamHI i en 25 mL reaksjon. Inkuber ved 37 ° C i minst 3 timer. Viktig: Long fordøyelse er kritisk for å sikre fordøyelse av hele DNA. Dette vil redusere antallet av falske positiver kloner senere.
  2. Inokulere 1,0 ml av den mettede SW102/BAC kulturen inn i 44 ml LB-Chl (25 ug / ml) og vokse på en 32 ° C rister til OD 600 mellom 0,2-0,3 (vanligvis omtrent 1-1,5 time). Omfatte en ytterligere identisk prøve for ikke-HS kontroll. Denne prøven blir behandlet på samme måte som den eksperimentelle en i hver enkelt aspekt med unntak av HS. Denne ikke-varme-rystet kultur tjener som en negativ kontroll. Utseendet til mange kolonier på ikke-HS kontroll plate (trinn 3.13) indikerer vanligvis transformasjon med ufordøyd P [ACMAN] KO 1,0 LA/ RA plasmid.
  3. Mens kultur er økende, kjører BamHI-restricted P [ACMAN]-KO på en gel. Deretter gel-ekstrakt og Eluer DNA i 10 mL av vann varmet opp til 55 ° C. MERK: Ikke Eluer DNA i noen buffer. Salter som finnes i bufferen kan forårsake elektrisk utladning i løpet av elektroporering.
  4. Varmesjokk-kulturen ved 42 ° C i nøyaktig 15 minutter i vannbad. Dette vil aktivere recombineering maskiner SW102 celler. Ikke varme sjokk kontroll kultur.
  5. Umiddelbart etter varme-sjokk, overfører varme-sjokkert og uten HS kontroll kulturer å kjølte 50 ml kanoniske rør og la kulturer chill i et is-slurry i 5 min. Viktig: I løpet av de neste trinnene cellene må holdes på lave temperaturer . Dette er avgjørende for å oppnå god kvalitet electrocompetent celler.
  6. Sentrifuger kultur ved 1500 xg i 10 min. Kast supernatanten og vaske pelleten i 25 ml kald (4 ° C) 10% glycerol 13. Førstresuspender celler i 5 ml ved å trykke og virvlende røret i isvann slurry (Ikke pipetter opp og ned) og deretter legge de resterende 10% glyserol (20 ml).
  7. Sentrifuger ved 4 ° C ved 1500 xg i 10 min, kast supernatanten og pelleten vaskes med 25 ml iskald 10% glyserol for annen gang.
  8. Sentrifuger ved 4 ° C ved 1500 xg i 10 min, kast supernatanten og pelleten vaskes med 25 ml iskald 10% glyserol for tredje gang.
  9. Sentrifuger ved 4 ° C ved 1500 xg i 10 min, og supernatanten kastes. Cellen pellet kan være veldig løs på dette punktet og omsorg bør tas når du kaster supernatanten. Resuspender pellet i 1 ml kald 10% glyserol. Overfør cellene til et 1,5 ml rør og sentrifugeres i 30 sekunder ved 12 000 xg i en bordplate mikrosentrifuge ved 4 ° C. Kast det meste av supernatanten forlater ≈ 90 pl av vann /-celler. MERK: på dette punktet cellene kan bli lagret ved -80 ° C for senere bruk. Dette kan imidlertid redusere kompetanse.
  10. Tilsett 2 pl av BamHI-digerert P [ACMAN] (mål for 50 ng) til cellene, og bland forsiktig ved anvendelse av en pipette. Overfør cellene inn i en 1 mm electroporation kyvetten og electroporate på 1800 V, 25 mF, 200 Ω.
  11. Tilsett 300 pl av SOC og la cellene komme i 2 timer ved 32 ° C (risting er ikke nødvendig). Plate celler på LB agar pluss 50 pg / ml ampicillin og inkuberes ved 32 ° C i 24-30 timer.

Dag 3

  1. Skjermen for riktig gap-reparasjon ved hjelp koloni PCR. Bruk T3 og RA sjekk primere for RA og T7 og LA sjekk primer for LA (tabell 1). Designe PCR-Check-RA og PCR-Check-LA primere 100-200 bp mot målrettede regionen (tabell 1). Positive kolonier fra PCR reaksjoner med PCR-Check-RA med T3 eller PCR-Check-LA med T7 viser et band som kjører på 800-1000 bp (figur 3). MERK: Det er viktig å teste begge armene siden etableringen av en armmen ikke den andre er noen ganger observeres.
  2. Dyrk PCR-verifisert kolonier ved 32 ° C i 4 ml LB 50 ug / ml ampicillin for over natten. Gjør en frosset lager av disse cellene for senere bruk.

4. Skifte Genomic Region med Targeting Cassette

Dag 4

  1. Forsterke RFP / KAN knockout kassetten ved PCR ved hjelp pENTR-RFP/KAN (predigested med ASCI og NheI å linearize) som en mal og 5'HA-RFP / Kan-F og 3'HA-RFP / Kan-R primere ( tabell 1). RFP / KAN kassett kan bestilles fra referanse 11.
  2. Gel rense PCR-produktet eluert i 20 ul sterilt vann. RFP-KAN kassett pluss homologidomene armene skal løpe rundt 3 kb.
  3. Inokuler 1 ml av den mettede SW102 / P [ACMAN]-KO kultur (trinn 3.13) inn i 44 ml LB-Amp (50 ug / ml) og vokse på 32 ° C shaker til OD 600 mellom 0,2-0,3. Omfatte en ytterligere identisk prøve for ikke-HS kontroll. Denne prøven vil bli behandlet akkuratsom den eksperimentelle en i hver enkelt aspekt med unntak av HS.
  4. Etter SW102 / P [ACMAN]-KO kultur når ønsket tetthet, følger du trinn 3,5 til 3,10.
  5. Electroporate ca 100 ng av målretting kassetten inn 90 mL av electrocompetent SW102 / P [ACMAN]-KO celler. Overfør cellene inn i en 1 mm electroporation kyvetten og electroporate på 1800 V, 25 mF, 200 Ω. Tilsett 300 ul av SOC og la cellene til å gjenopprette for to timer ved 32 ° C (risting er ikke nødvendig). MERK: Det anbefales sterkt å bruke en ny gelrenset kassett.
  6. Plate-celler i LB-agar + Amp (50 ug / ml) + Kan (50 ug / ml) og inkuberes i 24-30 timer ved 32 ° C.

Dag 5

  1. Grow 5 ml av kultur fra fem ulike kolonier ved 32 ° CO / N.

Dag 6

  1. Utføre en "skitten minipreparering" og kjøre halvparten av det oppnådde DNA i en 1% agarosegel for å lete etter den presence av en lav-molekylvekt-plasmid. Det bør ikke være noen plasmid som går Bellow 12 kb. (Figur 4)
  2. Gjør en 1:500 fortynning av DNA fra en positiv klon og bruke en ul å electroporate inn 50 pl TransforMax EPI300. Viktig: Sørg for å fortynne DNA for å hindre electroporation av flere plasmider til én celle. Plate-celler i LB-agar + Amp (50 ug / ml) + Kan (50 ug / ml) og inkuberes i 18-24 timer ved 37 ° C

Dag 7

  1. Inokuler en enkelt koloni i 10 ml LB + og vokse O / N.

Dag 8

  1. Seed 100 ml LB-medium med mettet kultur fra trinn 4.10. Legg passende antibiotika pluss 100 ul av 1,000 X kopikontrollinformasjon løsning og inkuberes ved 37 ° C i 5-6 timer.
  2. Utfør en maxiprep og kontrollere innføring av kassetten i riktig område ved sekvensering.
  3. I tillegg til sekvensering, utføre en begrensning enzyme fordøyelse test med DNA fra en klon som inneholdt ikke noen lav molekylvekt og dets parentale plasmid DNA. De restriksjonsenzymer valgt vil være forskjellig for hvert gen, men målet er å finne en gruppe enzymer som gjør det mulig å etterforskeren å karakterisere recombineered vektor. Som eksempel ble CG32095 målretting vektor serielt fordøyd med Paci, ASCI, BamHI og AatII. Utseendet til alle de anslåtte band og fravær av uriktige band bekrefter at targeting vektor er riktig recombineered (figur 5).

5. Injisering Fluer og Mobilisering Cassette In Vivo

  1. Injisere kassetten ved hjelp ΦC31 integrase, inn i en forhåndsdefinert landingsplass av valget. Eksterne leverandører, for eksempel Rainbow Transgenics ( http://www.rainbowgene.com ), kan brukes til injeksjon tjenester. Viktig: DNA må være fersk prepared før injeksjon. Høyere transformasjon effektivitet er observert når DNA er forberedt på stedet og injisert samme dag.
  2. Å mobilisere kassetten fra landingsplassen, bruker Bloomington lager nummer 25680 eller 25679. Disse bestandene inneholder Flippase og I-SCEI nedstrøms et varmesjokk promoter, på kromosom to og tre, henholdsvis. I tillegg inneholder de et hs-hid transgenet på balansearmen kromosom og på Y-kromosomet. Samle menn fra den valgte lager og kryss til jomfruelige kvinner bærer KO kassett i landingsstedet. . Set ~ 30 kors og tillater kvinner å legge egg i 2-3 dager MERK: Det anbefales å velge aksjen som er på en annen kromosom fra målrettede locus.
  3. Flip foreldre til et nytt sett av 30 ampuller, og varmesjokk-larver ved 37 ° C i 1 time, to ganger om dagen i tre påfølgende dager. Varmen sjokk aktivere produksjon av enzymer; flippase og I-SCEI, og celledød genet gjemte
  4. Samle jomfruelige kvinner fra F1 avkom av varme-sjokkerte fluer, og kryss til y - w - hanner. Målet for 150-200 kors, tre jomfruer og tre hanner pr kryss.
  5. Skjerme F2 avkom i fluorescerende omfang som gjør at påvisning av RFP i øyet. Skjermen for RFP positive øyne som er mutant for de hvite og gule gener (y - w -). Denne prosessen velger positivt for tilstedeværelsen av RFP kassett og velger for fraværet av P [ACMAN] vektor (mini-hvitt) og ilandføring, som er preget av vill-type gul genet. MERK: Det er mindre tid -conSuming til skjermen for RFP i øyet, enn til første skjermbilde for YW fluer. For mobilisering hendelser er meget effektive under heten sjokk, som resulterer i mange færre fluer inneholdende RFP i øyet, i forhold til y - w - fluer.
  6. Sett opp enkelt par parringer med hver y - w - RFP + fly, siden hver mobilisering hendelse kan være annerledes. Merk RFP til riktig kromosom. Riktig kromosom målretting er vanligvis observert hos> 95% av tilfellene.
  7. Etablere aksjer og sjekke for riktig målgruppe hendelser ved hjelp av standard teknikker for Southern Blot Analysis. Designe en 2 kb probe oppstrøms (venstre arm) og nedstrøms (høyre arm) av genet blir målrettet, og to kb (eller kortere hvis nødvendig) spenner over slettet ORF. De to første sondene vil gi et band i homozygot og heterozygot knockouts, som ikke er til stede i hvete, mens ORF ikke vil gi et band i homozygot knockout. En rask PCR feller ORF er også mulig, men dette er avhengig av fravær av et band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forsterkning av LA og RA homologidomene armene skal produsere 500 bp produkter og PCR-SOE reaksjon bør gi en 1,0 kb produkt (§ § 2.1 til 2.4, figur 2). BP reaksjon utført i avsnitt 2.5 er vanligvis svært effektiv og bakteriell transformasjon av produktet gir 5-100 kolonier i gjennomsnitt. Nesten alle koloniene testet med PCR sjekk viser det forventede PCR produktet.

I løpet av den første runden av recombineering (§ 3) forventer å få 20-40 kolonier etter transformasjon av fordøyd P [ACMAN]-KO-1.0 inneholder LA og RA armene inn SW102 celler. 40-60% av disse kloner vil bære det ønskede produkt rekombinasjon. Den ikke-varmesjokk-kontroll bør inneholde meget få, om noen kolonier sammenlignet til de varme-sjokkert celler. Utseendet av det samme antall kolonier på både prøven og kontrollplater vanligvis indikerer tilstedeværelsen av uslipte plasmid eller en annen kontaminant. I dette tilfellet forsøket Should kasseres og gjentatt, denne gangen fordøye P [ACMAN]-KO-1.0 bærer LA og RA armene til ferdigstillelse i henhold til instruksjonene beskrevet i trinn 3.2. Et eksempel på en PCR sjekk for gjenfinning av genomisk region av interesse inn P [ACMAN]-KO 1.0 hvori ≈ 60 kolonier ble erholdt er vist i figur 3.. Her 60% av koloniene testet gjennomført ønsket rekombinasjon product.Care må sørges for at de observerte PCR-produkter kjøre på den anslåtte størrelsen, siden avvikende PCR band vanligvis indikerer feil recombineering hendelser.

Tidvis ingen kolonier vil vokse etter den første runden av recombineering. Ved hjelp av celler med sub-optimal effektivitet representerer den vanligste årsaken til en mislykket recombineering reaksjon. Holde cellene kalde hele tiden under forberedelse og skånsom håndtering under de vasker (ALDRI vortex) er kritisk for å oppnå høy kvalitet kompetente celler. Prøv å alltid bruke fersk fordøyd / renset P [ACMAN]-KO-1,0-DNA for å oppnå den høyeste effektivitet.

Noen ganger den første runden av recombineering avkastning kolonier, men disse koloniene ikke bestått PCR sjekk analysen. Dette betyr vanligvis feil recombineering produkter, men et slikt resultat kan også indikere potensielle problemer med en av primer settene. Å validere PCR-Check-LA primer, sette opp en PCR reaksjon i kombinasjon med attB1-I-SCEI-LA-F. Å verifisere PCR-check-RA sette opp en PCR reaksjon med attB2-I-SCEI-RA-R. I begge tilfeller bruke den opprinnelige BAC som en mal. Disse PCR reaksjoner bør gi produkter av forventet størrelse, som vil variere avhengig av rekkefølgen på sjekk primere. Positive resultater fra denne kontrollen eksperimentet vil utelukke muligheten for at en manglende evne til å oppdage positive kloner skyldes primer ineffektivitet.

Hvis du har prøvd den første runden av recombineering flere ganger å følge de ovennevnte protokollen uten å lykkes og har utført alleforeslått kontroller, anbefaler vi å velge et nytt par 500 bp homologi armer. Av grunner som ikke er klart på det nåværende tidspunkt, noen genomisk regioner er svært motstandsdyktig mot DNA rekombinasjon. Bare designe nye homologi armene og beveger dem mot eller bort fra genet av interesse løser noen ganger er disse problemene.

Den andre runden av recombineering (seksjon 4) er vanligvis mye mer effektiv. Normalt 30-50 kolonier er observert etter transformasjon, med 90-95% av disse inneholdende den ønskede konstruksjon. Det vanligste problemet på dette trinnet er å skaffe falske positive kolonier. Figur 4 viser eksempler på sanne og falske positive kloner etter andre runde av recombineering (§ 4).

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av process å generere en P [ACMAN]-KO 1,0 målretting vektor. Modifisert fra Chan et al. (2012). Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skjematisk av skjøting av overlappende PCR (PCR SOE) utføres på trinn 2.3. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. PCR-sjekk gel viser effektiviteten av første recombineering arrangement Hvert kjørefelt representerer en enkelt koloni A:.. Koloniene testet for venstre arm. integrasjon med T7 og LA-sjekk primere B: De samme kolonier som A, testet for høyre arm integrasjon ved hjelp av T3 og RA-sjekk primers.1kb Plus DNA Ladder ble brukt som en molekylvekt markør MERK:. Grunnet dårlig grunning av T3 primer forhold til T7, var band av høyre arm sjekk betydelig mørkere. Dette bør tas i betraktning når du ser på gel.

Figur 4
Figur 4. DNA agarosegel som viser høy molekylvekt plasmider (P [ACMAN]) og lav molekylvekt plasmid (ufordøyd mal) isolert fra potensielle positive kloner etter andre runde av recombineering. DNA ble isolert fra fire potensielle positive kloner og ble kjørt på en 1% agarosegel farget med etidiumbromid. Kloner 1,3 og 4 er sanne positive kloner. Clone 2 er en falsk positiv som nevnt av alle former for ap lasmid som går Bellow 12 kb (den største størrelsen bandet i DNA stigen kjørefelt). 1 kb stige Plus DNA ble anvendt som en molekylvekt markør.

Figur 5
Figur 5. Test for ønsket rekombinasjon hendelse ved begrensning enzym fordøye. I eksempelet ovenfor er vist en datamaskin-spådd banding mønster av P [ACMAN]-KO CG32095 før og etter den andre runden av recombineering. Fire forskjellige enzymer ble brukt: Paci, ASCI, AatII og BamHI. Riktig rekombinert produktet vil ha de samme bandene som sin foreldrenes P [ACMAN]-KO CG32095 bortsett beregnet endring (pilspisser). NEBcutter V2.0 ble brukt til å forutsi bandet mønster.

0346/50346fig6highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50346/50346fig6.jpg "/>
Figur 6. Skjematisk beskriver mobilisering av en målretting kassett in vivo. Klikk her for å se større figur .

Tabell 1
Tabell 1.. Primere. Klikk her for å se større tabell .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kraften av genetiske modellorganismer i biomedisinsk forskning er i stor grad basert på de verktøyene som er tilgjengelige for genetisk manipulasjon. De små modeller C. elegans og Drosophila spesielt tillate for billig og rask molekylærgenetiske analyser av komplette stier og genet familier innblandet i flercellede utvikling eller funksjon. Siste årene har sett betydelige fremskritt innen verktøy utvikling for å manipulere gener i Drosophila 14,15. For eksempel ble recombineering, som er mye brukt i mus genetikk for å manipulere DNA-konstruksjoner Bac, nylig tilpasset for Drosophila, gjennom bruk av P [ACMAN] vektor og ΦC31-mediert transgenesis 6.. Ulike valg kassetter tillate innsetting eller sletting av bestemte sekvenser hvor som helst innenfor en konstruksjon ved hjelp av rekombinasjon kompetente bakterier 4,13. Vi har modifisert den opprinnelige P [ACMAN] vektoren slik at den kan brukes for å konstruere Drosophila. Denne nye vektor gjør det mulig å generere målretting kassetter med større homologidomene armer enn de som lett kan gjøres ved hjelp av klipp og lim kloning metoder. Videre er en gateway-kloning kassett også innarbeidet i denne vektoren, slik at man raskt og effektivt innføre ny genomisk DNA inn i systemet.

Selv om de fleste av metoden beskrevet her er grei, er det flere tiltak vi har funnet kritisk for suksessen av teknikken. På grunn av størrelsen på manipulert DNA (> 15 kb), utgjør den første runden av recombineering reaksjon (§ 3) en betydelig teknisk hinder. Derfor krever denne runden av recombineering en svært effektiv rekombinasjon protokollen. Tilsynelatende mindre protokoll justeringer, som tiltagende cellene til lavere tetthet, vaske cellene tre ganger i stedet for to og med 10% glyserol i stedet for dH 2 </ Sub> O 13, har kraftig forbedret transformasjonen effektiviteten av våre recombineering kompetente celler. I tillegg, ta vare å sørge for at LA / RA inneholder P [ACMAN] er kuttet til ferdigstillelse med BamHI (trinn 3.1) eliminerer mange falske positiver.

Uønskede rekombinasjon hendelser representerer en annen ganske vanlig problem under recombineering. For eksempel har vi sett tilfeller av duplikasjoner og translokasjoner innenfor ulike konstruksjoner. Disse hendelsene kan føre til flere problemer under Drosophila transformasjon og in vivo gene targeting. PCR verifikasjon og sekvensering analyse kan ikke oppdage alle disse hendelsene. Derfor må et restriksjonsenzym-analyse utføres på den endelige klonet produkt før injeksjon av DNA inn i embryoer. Denne siste sjekk har vist seg kritisk og har tillatt oss å unngå å injisere konstruksjoner som inneholder uønskede avvik.

Maxi-prepping målretting vektor like før injEL og aldri fryse DNA forbedrer transformasjon effektiviteten av disse store konstruksjoner i Drosophila. Kort sagt, små detaljer gjør en stor forskjell i suksessen av disse teknikkene. Protokollene skissert og demonstrert her representerer innsikt fra en rekke ulike kilder og vår egen erfaring.

Mens vi håper protokollen presenteres her hjelper andre til å vedta recombineering metoder i sine egne laboratorier, tror vi er ytterligere forbedringer og forbedringer til metodikken fortsatt mulig. Av og til bestemte genomiske fragmenter er vanskelig å manipulere med recombineering av grunner som ikke er helt innlysende. Videre tross for våre beste innsats for å fjerne uønsket bakgrunn, finner vi fremdeles at visse deler av genomisk DNA tendens til å produsere feil recombineered sluttprodukter. En dypere forståelse av recombineering prosessen kan gi mer optimale protokoller i fremtiden og åpen diskusjon omrecombineering feil og suksesshistorier vil fremme vellykket bruk av disse kraftige teknikker ved den bredere forskningsmiljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noen konkurrerende interesser i forhold til de teknikkene som er beskrevet her.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Hugo Bellen og Bloomington Stock Center for reagenser. Vi videre takke Koen Venken, Hugo Bellen og alle medlemmer av Buszczak og Hiesinger laboratorier for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institute of Health i ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) og MB (RO1GM086647), et stipend ved Cancer Prevention Research Institute of Texas til MB og PRH (RP100516), og Welch Foundation (I-1657) til PRH. MB er en EE og Greer Garson Fogelson Scholar i biomedisinsk forskning og PRH er en Eugene McDermott Scholar i biomedisinsk forskning ved UT Southwestern Medical Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SW102 Recombination competent bacteria NCI-Frederick Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106) http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx
TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli Epicentre EC300110 Includes CopyControl induction solution
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aligent Technology Inc. 600670
BamHI-HF New England Biolabs R3136S
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4001
Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit Invitrogen 11789-020
P[acman]KO1.010 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
pENTR RFP-Kan11 Buszczak and Hiesinger Labs Upon request
Flystocks Bloomington stock center Stock numbers: 25680, 25679 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4
y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1
Electroporation machine Biorad GenePulser Xcell with PC module 165-2662
Cuvettes Fisher Brand #FB101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
  2. Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
  3. Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
  4. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
  5. Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
  6. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
  7. Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
  8. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
  9. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
  10. Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
  11. Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).
  12. Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
  13. Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
  14. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134, 3571-3584 (2007).
  15. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).

Tags

Genetikk bioteknologi molekylærbiologi Biomedical Engineering fysiologi, Genetikk (dyr og planter) Recombineering, Homolog rekombinasjon Knock-out rekombinasjon genteknologi gene targeting gen gener DNA PCR Grunning sekvensering dyremodell
Recombineering homolog rekombinasjon konstruerer i<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S.,… More

Carreira-Rosario, A., Scoggin, S., Shalaby, N. A., Williams, N. D., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila. J. Vis. Exp. (77), e50346, doi:10.3791/50346 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter