TruTip هو بسيط الحمض النووي تكنولوجيا استخراج بموجبها يتم إدراج مسامية، مصفوفة ملزمة متجانسة في تلميح ماصة. وبالتالي، فإن تنسيق إعداد عينة متوافقا مع الصكوك التعامل مع معظم السائل، ويمكن استخدامها لكثير من متوسطة إلى التطبيقات السريرية عالية الإنتاجية وأنواع العينة.
TruTip هو بسيط الحمض النووي تكنولوجيا استخراج بموجبها يتم إدراج مسامية، مصفوفة ملزمة متجانسة في تلميح ماصة. الشكل الهندسي للمتراصة يمكن تكييفها للحصول على نصائح ماصة محددة تتراوح في الحجم 1،0-5،0 مل. المسامية كبيرة من متراصة تمكن العينات لزج أو معقدة لتمرير بسهولة من خلال ذلك مع الحد الأدنى من احداهما فلويديك. تدفق ثنائي الاتجاه يزيد من وقت الإقامة بين متراصة والعينة، وتمكن أحجام عينة كبيرة لتتم معالجتها ضمن TruTip واحد. الخطوات الأساسية، بغض النظر عن حجم العينة أو الهندسة TruTip، وتشمل تحلل الخلية، الحمض النووي ملزمة لالمسام الداخلية للTruTip متراصة، تجرف عينة مكونات غير منضم ومخازن تحلل، ويبلغ حجمه تنقية الأحماض النووية وتتركز في وجود مخزن مؤقت المناسبة. وأظهرت سمات والقدرة على التكيف من TruTip في ثلاثة بروتوكولات تجهيز العينات السريرية الآلي باستخدام epMotion إيبندورف 5070، هاميلتون نجم وSTARplus الروبوتات مناولة السائل، بما في ذلك عزل الحمض النووي الريبي من نضح البلعوم، والعزلة الحمض النووي الجيني من الدم الكامل، واستخراج الحمض النووي الجنيني والإثراء من كميات كبيرة من البلازما الأمهات (على التوالي).
تنقية الحمض النووي أمر ضروري لتشخيص معظم الجزيئية، واستخدام البحوث فقط، وتطبيقات علوم الحياة. ظهرت مناهج مختلفة منذ وقت الفينول / كلوروفورم الاستخراج، وتستند كثير منها على مبدأ أساسي من الحمض النووي ملزمة لالسيليكا في وجود الأملاح chaotropic 1. وقد كانت عملية استخراج المبسطة والآلية من خلال استخدام مختلف الأشكال وحبة التي تعتمد على الأغشية، مع مرشحات تدور، حبات مغناطيسية والمناهج ذات الصلة تهيمن على صناعة علوم الحياة (انظر الأمثلة في 2-13). في حين فعالة، والجسيمات والأغشية ويعرف القيود عندما واجه مع المصفوفات السريرية الصعبة. على سبيل المثال، الأغشية والأعمدة المستندة إلى حبة متوافقة، ذات أحجام مسام صغيرة (وبالتالي، والضغوط مرة أخرى عالية)، وتتطلب بعض نوع من الدعم من أجل أن تكون معالجتها بواسطة نظام الطرد المركزي أو فراغ. الخصائص الفيزيائية للأغشية والأعمدة حبة نتيجة فيالمقاومة فلويديك كبيرة، الأمر الذي يحد من نوع من العينات التي يمكن معالجتها بكفاءة دون انسداد الاستهلاكية، و / أو مجموع (المدخلات) حجم العينة التي يمكن معالجتها من خلال مسار تدفق أحادي إتجاهي. على العكس، يجب أن توزع جزيئات مغناطيسية في جميع أنحاء عينة من الانفعالات. الحاجة إلى توزيع متجانس الجزيئات المغناطيسية ضمن حل يحد من إجمالي حجم العينة المدخلات التي يمكن معالجتها مع معظم المواد الاستهلاكية حبة المغناطيسي. سمات عينة سريرية (مثل اللزوجة أو تعقيد) يمكن أن يؤدي إلى عدم كفاءة تركيز الجسيمات المغناطيسية على جانب أنبوب أو قضيب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الجسيمات الدقيقة السيليكا بقطع من الخرز أثناء عملية الاستخراج، وفقدان مغنطة وتلويث العينة النهائية.
وقد تم تطوير هذه التكنولوجيا TruTip للتغلب على بعض هذه عينة الحمض النووي المعوقات والقيود تجهيز 14. عن طريق دمج متراصة مسامية داخلماصة، وخفضت فلويديك احداهما، والتي تمكن التحكم في التدفق من فراغ (أي ماصة الطموح). تمكن هذه الميزة عملية الاستخراج والأجهزة اللازمة لتنقية الأحماض النووية من أنواع عينة يصعب تبسيطها إلى حد كبير (الشكل 1). تم تصميم وهندسة والمسامية للمتراصة للحد من انسداد، في حين أن سمك متراصة توفر القدرة الكافية الحمض النووي ملزمة لحجم العينة تتراوح 1،0-5،0 مل. تدفق ثنائي الاتجاه خلال عينة الطموح والاستغناء يسمح لمرات الإقامة لفترات طويلة بين عينة استخراج ومتراصة ملزمة لكفاءة الانتعاش الحمض النووي وشطف، وتمكن أحجام عينة كبيرة نسبيا بحيث تتم معالجتها التي تتجاوز سعة وحدة التخزين من طرف ماصة نفسها. نحن ذكرت سابقا وضع وتطبيق إجراء TruTip دليل لتنقية الحمض النووي الريبي من عينات إنفلونزا البلعوم باستخدام راي واحد أو متعدد القنواتنين pipettor 15. تم الحصول على الكفاءات استخراج ما يعادل بين QIAcube الآلي وطرق TruTip دليل في 10 6 نسخ الجين إنفلونزا A لكل مل نضح البلعوم. وكان الهدف من هذه الدراسة إلى إثبات، الآلي النووي إجراءات متوسطة وعالية الإنتاجية TruTip حمض تنقية لنضح البلعوم (NPA) وغيرها من أنواع عينة ذات الصلة سريريا، وذلك باستخدام الروبوتات التعامل مع السائل التي توجد عادة في المختبرات السريرية المرجعية.
بساطة مفهوم TruTip وسير العمل (الشكل 1) جعلها تتكيف بسهولة، الآلي، وكفاءة وفعالية بالنسبة لعدد من المصفوفات السريرية العينة، حجم العينة المدخلات، ونظم مناولة السائل. وينبغي الاعتراف، مع ذلك، أن كل عينة سريرية هي فريدة من نوعها، وسوف تختلف واحدة إلى أخرى في اللزوجة، والجسيمات، والمخاط، والملوثات السطحية، الميكروبية، و / أو الخلفيات الوراثية البشرية. نظرا الاختلافات المتوقعة في تكوين العينة السريرية والاستخدامات المقصودة من بروتوكول إعداد عينة TruTip الآلي، وبالتالي قد يكون من الضروري تعديل بعض الخطوات في إجراء TruTip من أجل تحقيق النتائج المرجوة لنوع عينة محددة. بغض النظر عن نوع العينة، ومع ذلك، المعلمات TruTip التي عادة ما يكون لها الأثر الأكبر على نقاء الحمض النووي و / أو استرداد ما يلي:
لأن الهندسة، المواد ماصة الحافة، وطريقة التعلق أحضان قناة الروبوتية هي فريدة من نوعها لكل مصنع صك، مطلوب بناء TruTip مختلفة لكل نظام مناولة السائل. أبعاد متراصة TruTip (قطر، سمك، وحجم المسام) لا ترتبط مع القدرة النووية ملزمة حمض (والكفاءة شطف)، كما هو متوقع لأي تقنية استخراج المرحلة الصلبة. بينما سميكة (> 4 مم) المصفوفات قد تكون جزءا لا يتجزأ في TruTip 1 مل إلى زيادة قدرة الحمض النووي ملزم للحصول على عينات كبيرة الحجم و / أو تحقيق المساواة في قدرة ملزم عبر صيغ TruTip محددة، وهناك علاقة تبادلية بين سماكة TruTip ومعدلات التدفق خلال الخطوة الأولي ملزم (في وجود لست] الخام). وهكذا، فإنه في بعض الأحيان من المفيد تضمين كتل أكبر قطرها إلى أكبر حجم ونصائح ماصة للخطوات الأولية لبروتوكول الآلي، (على سبيل المثال </ EM> في 5 مل هاميلتون / Akonni TruTips لقلع كبيرة الحجم). ونظرا للتكوينات TruTip محددة تمليها الشركات المصنعة من الروبوتات مناولة السائل، ومع ذلك، فإننا لا نتوقع بالضرورة TruTip غلة الحمض النووي لتكون مماثلة عبر منصات التعامل مع السائل من مصنعين مختلفين، أو عبر أحجام مختلفة TruTip.
سوف العينات السريرية (حسب التعريف) تحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الجيني الإنسان ما لم يتم الحصول عليها من مواقع العقيمة عادة (مثل السائل الشوكي الدماغي). أحيانا هو المطلوب الحمض النووي الجيني البشري (كما في الشكل 6)، في حين أنه في تطبيقات أخرى في الحمض النووي البشري يمثل خلفية الجيني غير المرغوب فيها (أما بالنسبة الشكل 5). وجود الحمض النووي الخلفية هي عادة ليست مشكلة طالما أن المبلغ الإجمالي للحامض النووي في العينة لا تتجاوز قدرة ملزم للمتراصة، والحمض النووي الخلفية يمكن أن تكون بمثابة الناقل إذا كان الهدف المنشود النوويحمض موجود في كميات ضئيلة. الهدف من ارتفاع حجم استخراج بروتوكول البلازما (الشكل 7) هو عزل (مجزأة) DNA الجنين في وجود فائض 10-20 أضعاف من الحمض النووي الأمهات، والذي يشبه إلى الهدف إعداد عينة من اختبارات الأمراض المعدية إلا أن تسلسل متطابقة للغاية ولا يمكن تمييزها عن طريق اختبار الجزيئي محددة للغاية و / أو التمييز الحجم. في هذه الحالة، يتم عزل الحمض النووي مجموع تعميم باستخدام 5 مل TruTip، والجزيئية العالية وانخفاض الوزن الجزيئي DNA الجنين اللاحقة يتم فصل من خلال اللاحقة ملزمة وشطف إلى مل TruTip 1 عن طريق تغيير الظروف العازلة ملزمة. انتقائية فصل حجم وإثراء الأحماض النووية المستهدفة على أساس ملزم وممتلكاتهم شطف إلى متراصة السيليكا هو وضع يختلف كثيرا من العمل من تحقيقه عن طريق الأغشية أو حجم الأعمدة تدور الاستبعاد. فصل حجم وإثراء الحمض النووي الميكروبي من الحمض النووي الجيني الإنسان قد يكونccomplished في التطبيقات المستقبلية عن طريق تخصيص ملزمة TruTip ومخازن شطف.
أظهرت البروتوكولات الآلي هنا التأكيد على فائدة متراصة TruTip نفسها لتجهيز العينات السريرية متنوعة، وكيف يمكن تكييفها لكميات كبيرة ومحددة الروبوتات التعامل مع السائل. يؤدي أساليب مبسطة عادة في البروتوكولات استخراج أسرع مقارنة مع النظم الآلية الأخرى. بساطة التكنولوجيا TruTip، ومع ذلك، يتيح أيضا بعض المزايا من حيث التكلفة للراغبين في شراء، مؤتمتة نظام لتنقية حمض النووي الجديد، وذلك لأن الأجهزة الأساسية اللازمة لأتمتة إجراءات TruTip هي الذراع ماصة قناة نفسها بدلا من قضبان المغناطيسي، وأنظمة فراغ ، أو على متن جهاز طرد مركزي. يمكن استخدام لوحات كاشف معبأة سلفا أيضا تقليل مساحة والمواد الاستهلاكية المطلوبة، وضعف الإنتاجية في المدى. التقليل من مساحة سطح السفينة مع بروتوكولات TruTip يتيح أيضا للمستخدمين متقدمة لدمج المنبع أو دالعمليات المؤتمتة ownstream مع TruTip. على سبيل المثال حل easyBlood هاملتون إلى الدم الكامل يجزئ يمكن إدراجها مع طريقة استخراج الآلي TruTip، التي من شأنها تبسيط العمليات الحيوية بشكل كبير المصرفي. عمليات ما بعد الاستخراج مثل الكميات الحمض النووي، تطبيع، PCR انشاء، أو تسلسل الحمض النووي يتم أيضا دمجها بسهولة مع TruTip على منصات أكبر مناولة السائل.
The authors have nothing to disclose.
وقدم الدعم لأجزاء من هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت منحة R 44 AI072784. نشكر الدكتور كيرستن سانت جورج، سارة B. Griesemer، داريل امسون وايمي عميد مختبر للأمراض الفيروسية، مركز وادز ورث، جديد قسم الصحة لولاية نيويورك لvirions إنفلونزا كميا والوصول إلى التحقق من صحة سريريا الأنفلونزا في الوقت الحقيقي المقايسات PCR.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |