TruTip är en enkel nukleinsyra extraktion teknik varigenom en porös, monolitisk bindande matris är införd i en pipettspets. Följaktligen är provberedning format som är kompatibelt med de flesta vätskehantering instrument, och kan användas för många medium till hög kapacitet kliniska tillämpningar och provtyper.
TruTip är en enkel nukleinsyra extraktion teknik varigenom en porös, monolitisk bindande matris är införd i en pipettspets. Geometrin av monoliten kan anpassas för specifika pipettspetsar varierar i volym från 1,0 till 5,0 ml. Den stora porositet monoliten möjliggör viskösa eller komplexa prover för att lätt passera igenom det med minimal fluidisk mottryck. Dubbelriktat flöde maximerar uppehållstid mellan monoliten och prov, och möjliggör stora provvolymer som ska behandlas inom en enda TruTip. De grundläggande stegen, oberoende av provvolymen eller TruTip geometri, inkluderar cellys, nukleinsyrabindning till de inre porerna i TruTip monolit, borttvättning komponenter obundet prov och buffertar lys, och eluering renades och koncentrerades nukleinsyror i en lämplig buffert. Attributen och anpassningsförmåga TruTip demonstreras i tre automatiserade kliniska protokoll sampelbehandlingen med en Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR och STARplus flytande robotar hantering, däribland RNA isolering från nasofarynxaspirat, genomisk DNA-isolering från helblod, och fetalt DNA extraktion och anrikning av stora volymer av moderns plasma (respektive).
Nukleinsyrarening är nödvändigt för de flesta molekylär diagnostik, forskning bruk, och livet applikationer vetenskap. Olika metoder har dykt upp sedan tiden för fenol / kloroform extraktioner, många av vilka bygger på den grundläggande principen om nukleinsyrabindning till kiseldioxid i närvaro av kaotropa salter 1. Utvinning processen har varit rationaliseras och automatiseras med hjälp av olika pärla-och membran-baserade format, med spinn filter, magnetiska pärlor och metoder för detta dominerar biovetenskap industrin (se exempel i 2-13). Medan effektiva, har partiklar och membran kända begränsningar när de konfronteras med utmanande kliniska matriser. Till exempel, membran och kulbaserade kolumner är godkända, har små porstorlekar (sålunda, höga mottryck), och kräver någon typ av stöd för att behandlas av en centrifug eller vakuumsystem. De fysikaliska egenskaperna hos membran och pärla kolumner resulterar ibetydande fluidic motstånd, vilket begränsar den typ av prover som effektivt kan behandlas utan att täppa till förbrukningsvara, och / eller den totala (input) provvolym som kan vara uni-directionally bearbetas genom flödesbanan. Omvänt måste magnetiska partiklar skall fördelas över hela genom omrörning. Behovet av att homogent fördela magnetiska partiklar inom en lösning begränsar den totala volymen insamplet som kan bearbetas med de flesta magnetiska pärlor förbrukningsvaror. Kliniska prov attribut (såsom viskositet eller komplexitet) kan leda till ineffektiv magnetisk partikelkoncentration på sidan av ett rör eller en stång. Dessutom kan kiseldioxid fina partiklar bryta av pärlorna under extraheringen, förlorar sin magnetisering och förorenar det slutliga provet.
Den TruTip Tekniken utvecklades för att övervinna några av dessa nukleinsyra bearbetning syrliga prov restriktioner och begränsningar 14. Genom att bädda en porös monolit inom enpipettspetsen, fluidic mottryck sänks, vilket möjliggör flödesreglering genom vakuum (dvs. pipett aspiration). Denna funktion möjliggör extraktion och instrumentering som krävs för att rena nukleinsyror från svåra provtyper att förenklas avsevärt (figur 1). Geometrin och porositet av monoliten är skräddarsydd för att minimera igensättning, medan tjockleken av monoliten ger tillräcklig nukleinsyra bindningskapacitet för provvolymer som sträcker sig från 1,0 till 5,0 ml. Dubbelriktad flödet under prov aspiration och dispensering möjliggör förlängda uppehållstider mellan provextraktet och bindande monolit för effektiv nukleinsyra återhämtning och eluering, och möjliggör relativt stora provvolymer som skall bearbetas som överstiger den volym kapacitet pipettspetsen själv. Vi rapporterade tidigare utveckling och tillämpning av en manuell TruTip förfarande för rening av influensa RNA från nasofarynxprov med en enkel-eller flerkanaligt Rainin pipett 15. Likvärdiga utvinning effektivitetsvinster erhölls mellan automatiserad QIAcube och manuella metoder TruTip vid 10 6 genkopior influensa A per ml nasofarynxaspirat. Syftet med denna studie var att visa medel-och hög genomströmning, automatiserade TruTip nukleinsyror förfaranden sura rening för nasofarynxaspirat (NPA) och andra kliniskt relevanta typer provet med vätskehantering robotar vanligen finns i referens kliniska laboratorier.
Enkelheten i TruTip konceptet och arbetsflöde (figur 1) gör det lätt anpassas, automatiserat och effektivt för ett antal kliniska provmatriser, input volymer prov och flytande hanteringssystem. Det bör dock vara medveten om att varje kliniskt prov är unik och kommer att variera en till nästa viskositet, partiklar, slem, ytkontaminanter, mikrobiella och / eller genetiska bakgrunder. Med tanke på förväntade variationer i kliniskt prov sammansättning och avsedd användning av ett automatiserat TruTip provberedning protokoll, kan det därför vara nödvändigt att ändra vissa steg i en TruTip förfarande för att uppnå önskat resultat för en viss typ av prov. Oavsett vilken provtyp, dock TruTip parametrar som typiskt sett har den mest betydande inverkan på nukleinsyra renhet och / eller återvinning inkluderar:
Eftersom geometrin, pipett spets material och fästmetod till robotic kanal armarna är unika för varje instrument tillverkare, är en annan TruTip konstruktion krävs för varje vätskehanteringssystem. De TruTip monolithögtalare dimensioner (diameter, tjocklek och porstorlek) korrelerar med nukleinsyra bindningskapacitet (och eluerings-effektivitet), är som väntat för en fast-fas extraktionsteknik. Medan tjocka (> 4 mm) matriser kan bäddas in i en 1 ml TruTip att öka nukleinsyra bindningskapacitet för stora volymer prover och / eller utjämna bindningskapaciteten över specifika TruTip format, finns det en kompromiss mellan TruTip tjocklek och flödeshastigheter under det initiala bindningssteget (i närvaro av råa lysat). Därför är det ibland fördelaktigt att bädda större diameter monoliter i större volymer pipettspetsar för de första stegen i en automatiserad protokoll (t.ex. </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips för stora volymer extraktioner). Med tanke på de särskilda TruTip konfigurationer dikteras av tillverkarna av vätskehanteringsinstallationer robotar, men vi behöver inte nödvändigtvis förvänta TruTip nukleinsyra avkastningen att vara identiska över vätskehanteringsinstallationer plattformar från olika tillverkare, eller mellan olika TruTip storlekar.
Kliniska prov (per definition) kommer att innehålla betydande mängder av humant genom DNA om de inte förvärvats från vanligtvis steril platser (t.ex. cerebrospinalvätska). Ibland humant genom-DNA önskas (såsom i fig. 6), medan i andra tillämpningar det humana DNA: t representerar en oönskad genomiska bakgrunden (som för figur 5). Närvaron av bakgrunds-DNA är vanligtvis inte problematisk, så länge som den totala mängden nukleinsyra i provet inte överstiger bindningskapaciteten av monoliten, och bakgrunds-DNA kan fungera som bärare om den önskade målnukleinsyransyra är närvarande i spårmängder. Syftet med stora volymer plasmaextraktion protokollet (Figur 7) är att isolera (fragmenterad) fetalt DNA i närvaro av en 10 till 20-faldigt överskott av moderns DNA, som liknar den provberedning målet för infektionssjukdomar tester med undantag för att sekvenserna är mycket kongruenta och kan bara särskiljas genom mycket specifika molekylära tester och / eller storlek diskriminering. I detta fall kommer de sammanlagda cirkulerande DNA isolerat med användning av en 5 ml TruTip, och efterföljande hög-molekylära och låg molekylvikt fetalt DNA separeras genom efterföljande bindning och eluering till en 1 ml TruTip genom att förändra bindande buffertbetingelser. Selektiv storleksseparation och anrikning av målnukleinsyror som baseras på deras bindning och egenskaper elueringsbetingelser till en kiseldioxid monolit är en väsentligt annorlunda verkningssätt än uppnås med membran eller storleksuteslutande kolumner spin. Size separation och anrikning av mikrobiellt DNA från humant genom-DNA kan vara enccomplished i framtida tillämpningar via anpassa TruTip bindande och buffertar elueringstider.
De automatiserade protokoll visade här betona nyttan av TruTip monolit sig för bearbetning olika kliniska prover, och hur den kan anpassas för stora volymer och specifika flytande robotar hantering. De strömlinjeformade metoder resulterar typiskt i snabbare extraktion protokoll jämfört med andra automatiserade system. Enkelheten i TruTip teknik, men också ger vissa kostnadsfördelar för dem som är intresserade av att köpa en ny, automatiserad nukleinsyra systemet surt rening, eftersom den primära hårdvara som krävs för att automatisera TruTip förfaranden är pipetten kanalen armen själv snarare än magnetiska stavar, vakuumsystem , eller ombord centrifuger. Använda förfyllda reagens plattor kan också minska utrymme och nödvändiga förbrukningsvaror, och fördubbla genomströmningen per körning. Minimera däck utrymme med TruTip protokoll också möjliggör avancerade användare att integrera uppströms eller downstream automatiserade processer med TruTip. Till exempel Hamiltons easyBlood lösning för fraktionering helblod kan införlivas med den automatiserade TruTip extraktion metod, vilket avsevärt skulle effektivisera bio-banking processer. Post-extraktion processer såsom nukleinsyra kvantifiering, normalisering, PCR set-up, eller DNA-sekvensering är också lätt integreras med TruTip på de större plattformarna vätskehantering.
The authors have nothing to disclose.
Delar av detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) enligt bidragsavtal R 44 AI072784. Vi tackar Dr Kirsten St George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson och Amy dekanus för laboratoriet för virussjukdomar, Wadsworth Center, New York State Dept of Health för kvantifierade influensavirioner och tillgång till kliniskt validerade influensa realtid PCR-analyser.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |