TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Folglich ist die Probenvorbereitung Format kompatibel mit den meisten Liquid Handling Geräte, und kann für viele mittel-bis High-Throughput-klinische Anwendungen und Probe-Typen verwendet werden.
TruTip ist eine einfache Extraktion von Nukleinsäuren Technologie, bei der eine poröse, monolithische Bindematrix in eine Pipettenspitze eingesetzt ist. Die Geometrie des Monolithen können nach bestimmten Pipettenspitzen Bereich im Volumen von 1,0 bis 5,0 ml angepasst werden. Die große Porosität des Monolithen ermöglicht viskosen oder komplexen Proben zu leicht durch sie hindurch mit minimalem Fluidik Gegendruck. Bi-direktionale Flow maximiert Verweilzeit zwischen dem Monolith und Probe und ermöglicht große Probenvolumina innerhalb eines einzigen TruTip verarbeitet werden. Die grundlegenden Schritte, unabhängig von Probenvolumen oder TruTip Geometrie gehören Zell-Lyse, Nukleinsäure-Bindung an den inneren Poren des TruTip Monolith, Waschen entfernt ungebundenen Bestandteile der Probe und Lysepuffern und Eluieren gereinigt und konzentriert Nukleinsäuren in einem geeigneten Puffer. Die Attribute und Anpassungsfähigkeit der TruTip sind in drei automatischen klinischen Probe Verarbeitung Protokolle unter Verwendung einer Eppendorf epMotion 5070 gezeigt, Hamilton STAR und STARPLUS Liquid-Handling-Roboter, einschließlich RNA-Isolation aus Nasopharynx absaugen, genomische DNA-Isolierung aus Vollblut und fetalen DNA-Extraktion und Anreicherung von großen Mengen im mütterlichen Plasma (jeweils).
Nukleinsäure-Aufreinigung notwendig ist für die meisten molekularen Diagnostik, Forschung nur zu verwenden, und Life-Science-Anwendungen. Verschiedene Ansätze wurden seit der Zeit der Phenol / Chloroform Extraktionen entstanden, von denen viele auf dem grundlegenden Prinzip der Nukleinsäure-Bindung an Silica in der Gegenwart chaotroper Salze 1 basiert. Die Extraktion wurde gestrafft und automatisiert durch den Einsatz von verschiedenen Perlen-und Membran-basierte Formate, mit Spin Filter, magnetische Kügelchen und verwandte Ansätze dominieren die Life Sciences-Industrie (siehe Beispiele in 2-13). Während wirksam, haben Partikel und Membranen Einschränkungen bekannt, wann mit herausfordernden klinischen Matrizen konfrontiert. Zum Beispiel, Membranen und Kügelchen Säulen auf-konform sind, haben kleine Porengrößen (also hohen Gegendrücken) und erfordern irgendeine Art von Unterstützung, um durch eine Zentrifuge oder Vakuum verarbeitet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Membranen und Kügelchen Spalten einesignifikante Strömungswiderstand, der die Art der Proben, die effizient, ohne zu verstopfen die Verbrauchsmaterialien und / oder die Gesamtmenge (Eingang) Probenvolumen, die uni-direktional verarbeitet durch den Strömungsweg können verarbeitet werden begrenzt. Umgekehrt muß magnetischen Teilchen in der Probe durch Rühren verteilt. Die Notwendigkeit, die homogen verteilen magnetischen Teilchen in einer Lösung schränkt die insgesamt eingesetzten Probenmenge, die mit vielen magnetischen Kügelchen Verbrauchsmaterialien verarbeitet werden können. Klinische Probe Attribute (wie Viskosität oder Komplexität) zu ineffizienten Magnetpartikel-Konzentration auf der Seite eines Rohres oder Stabes führen. Darüber hinaus können Silica Feinstaub brechen der Perlen während der Extraktion, verlieren ihre Magnetisierung und verunreinigen das letzte Probe.
Die TruTip Technologie wurde entwickelt, um einige dieser Nukleinsäure-Probe Verarbeitung Auflagen und Beschränkungen 14 zu überwinden. Durch die Einbettung eines porösen Monolithen innerhalb einerPipettenspitze, Fluidik Gegendruck abgesenkt, die Ablaufsteuerung ermöglicht durch Vakuum (dh Pipette Aspiration). Diese Funktion ermöglicht die Extraktion und Instrumentierung benötigt, um Nukleinsäuren aus schwierigen Probe Typen zu reinigen, um stark vereinfacht werden (Abbildung 1). Die Geometrie und die Porosität des Monolithen wird hergestellt, um ein Verstopfen zu minimieren, während die Dicke des Monolithen ausreichende Nukleinsäure Bindungskapazität für Probenvolumina im Bereich von 1,0 bis 5,0 ml. Durchfluss in beide Richtungen während Probe Aufnahme und Abgabe ermöglicht längere Verweilzeiten zwischen der Probenlösung und der Monolith für eine effiziente Bindung Nukleinsäuregewinnung und Elution und ermöglicht relativ große Probenvolumina verarbeitet, dass mehr als die Volumenkapazität der Pipettenspitze selbst sein. Wir bereits berichtet die Entwicklung und Anwendung eines manuellen TruTip Verfahren zur Reinigung von Influenza-RNA aus Nasen-Rachen-Proben unter Verwendung eines Single-oder Multi-Channel-Rainin Pipette 15. Equivalent Extraktionseffizienzen wurden zwischen automatisierten und manuellen QIAcube TruTip Methoden bei 10 6 Genkopien Influenza A pro ml Nasen-Rachen absaugen erhalten. Das Ziel dieser Studie war es, mittel-und High-Throughput-, automatisierte TruTip Nukleinsäurereinigung Verfahren zur Nasen-Rachen absaugen (NPA) und anderen klinisch relevanten Probenarten mit Liquid-Handling-Roboter häufig in Bezug klinischen Laboratorien gefunden zu demonstrieren.
Die Einfachheit des TruTip Konzept und Workflow (Abbildung 1) machen es leicht angepasst, automatisierte, effiziente und effektive für eine Reihe von klinischen Probenmatrices, Eingang Probenvolumina und Liquid-Handling-Systeme. Es sollte jedoch erkannt werden, dass jede klinische Probe einzigartig ist, und eine mit der nächsten in der Viskosität, Partikel, Schleim, Oberflächenverunreinigungen, mikrobiellen und / oder menschlichen genetischen Hintergründen variieren. Angesichts erwarteten Variationen in der klinischen Probe Zusammensetzung und Verwendungen von einer automatisierten Probenvorbereitung TruTip Protokoll, kann es daher notwendig sein, bestimmte Schritte in einer TruTip Verfahren zu modifizieren, um die gewünschten Ergebnisse für eine bestimmte Art Probe zu erreichen. Unabhängig von der Art der Probe enthalten jedoch TruTip Parameter, die haben in der Regel den größten Einfluss auf Nukleinsäure Reinheit und / oder Verwertung:
Da die Geometrie Pipettenspitze Material und Befestigungsart der Roboter-Arm-Kanal einzigartig für jedes Instrument Hersteller sind, ist eine andere TruTip Konstrukt für jede Liquid-Handling-System erforderlich. Die TruTip Monolith Abmessungen (Durchmesser, Dicke und Porengröße) haben mit Nukleinsäure-bindende Kapazität (und Elution Wirkungsgrade) korrelieren, ist wie bei jedem Festphasenextraktion Technik erwartet. Während dicke (> 4 mm) Matrizen zu einer 1 ml TruTip auf Nukleinsäure-bindende Kapazität für großvolumige Proben zu erhöhen und / oder die Bindung auszugleichen Kapazität über spezifische TruTip Formate eingebettet sein kann, gibt es einen Kompromiss zwischen TruTip Dicke und Flussraten während die anfängliche Bindung Schritt (in Gegenwart von Rohlysaten). Daher ist es manchmal vorteilhaft, größeren Durchmesser Monolithen in größerem Volumen Pipettenspitzen einzubetten für die ersten Schritte eines automatisierten Protokoll (zB </ Em> die 5 ml Hamilton / Akonni TruTips für großvolumige Extraktionen). Angesichts der spezifischen TruTip Konfigurationen durch die Hersteller von Liquid Handling-Roboter diktiert, jedoch haben wir nicht unbedingt erwarten TruTip Nukleinsäure Renditen identisch sein über Liquid Handling-Plattformen verschiedener Hersteller, oder über verschiedene TruTip Größen.
Klinische Proben (per Definition) enthalten erhebliche Mengen an humaner genomischer DNA, wenn sie aus einer normalerweise sterilen Websites (zB Rückenmarksflüssigkeit) erworben werden. Manchmal ist die humane genomische DNA gewünscht wird (wie in 6), während in anderen Anwendungen der menschlichen DNA stellt einen unerwünschten Hintergrund Genom (wie bei Figur 5). Die Anwesenheit von Hintergrund-DNA ist in der Regel unproblematisch, solange die Gesamtmenge von Nucleinsäure in der Probe nicht mehr als die Bindungskapazität des Monolithen und die Hintergrund-DNA als Träger zu dienen, wenn das gewünschte Ziel-NukleinsäureSäure ist in Spuren vorhanden. Das Ziel des hochvolumigen Plasmaextraktion Protokoll (Fig. 7) zu isolieren (fragmentierten) fötale DNA in Gegenwart einer 10-20 fachen Überschuß der mütterlichen DNA, die ähnlich wie die Probenvorbereitung Ziel Infektionskrankheit Tests ist, außer dass die Sequenzen hohe Kongruenz und kann nur durch sehr spezifische molekulare Tests und / oder Größe Diskriminierung unterscheiden. In diesem Fall wird die gesamte Umlauf-DNA isoliert mit einer 5 ml TruTip und anschließende hochmolekularen und niedermolekularen fetalen DNA durch getrennt nachfolgende Bindung und Elution mit einem 1 ml TruTip durch Veränderung der Bindung Pufferbedingungen. Selektive Größe Trennung und Anreicherung von Ziel-Nukleinsäuren auf ihre Bindung und Elution Eigenschaften auf eine Silica-Monolith basiert, ist ein deutlich anderen Wirkmechanismus als durch Membranen oder Größenausschluss-Spin-Säulen erreicht. Größe Trennung und Anreicherung von mikrobieller DNA aus humanen genomischen DNA kann eine seinccomplished in zukünftigen Anwendungen über Customizing TruTip verbindlich und Elutionspuffer.
Die automatisierten Protokolle gezeigt betonen die Nützlichkeit der TruTip Monolith selbst zum Verarbeiten diverse klinische Proben, und wie sie für große Mengen und spezifischen Liquid-Handling-Roboter angepasst werden. Die optimierte Methoden in der Regel schneller Extraktion Protokolle im Vergleich zu anderen automatisierten Systemen führen. Die Einfachheit des TruTip Technologie, aber auch bietet einige Kostenvorteile für die Interessenten in den Kauf eines neuen, automatisierten Aufreinigung von Nukleinsäure-System, weil die primären Hardware für die Automatisierung TruTip Verfahren erforderlich ist die Pipettenkanal Arm selbst eher als magnetische Stäbe, Vakuum-Systeme oder On-Board-Zentrifugen. Verwendung Fertigspritze Reagenz Platten können auch zu einer Verminderung Raum und erforderlichen Verbrauchsmaterialien und die doppelte Durchsatz pro Lauf. Minimierung Deck mit TruTip Protokolle ermöglicht auch fortgeschrittene Anwender zu integrieren stromaufwärts oder downstream automatisierte Prozesse mit dem TruTip. Zum Beispiel Hamiltons easyBlood Lösung zur Fraktionierung Vollblut können mit dem automatisierten TruTip Extraktionsverfahren, die deutlich straffen würde Bio-Banking-Prozesse integriert werden. Post-Extraktionsverfahren wie Nukleinsäure Quantifizierung, Normalisierung, PCR Set-up, oder DNA-Sequenzierung sind auch leicht mit TruTip auf den größeren Liquid-Handling-Plattformen integriert.
The authors have nothing to disclose.
Teile dieser Arbeit wurden durch die National Institutes of Health (NIH) unter dem Förderkennzeichen 44 R AI072784 unterstützt. Wir danken Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson und Amy Dean des Labors für Viruskrankheiten, Wadsworth Center in New York State Dept of Health für quantifiziert Influenza-Virionen und Zugang zu klinisch validiert Influenza Echtzeit PCR-Assays.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |