TruTip is een eenvoudige nucleïnezuur extractie technologie waarbij een poreuze monolithische bindende matrix wordt in een pipetpunt. Bijgevolg monstervoorbereiding compatibel is met de meeste vloeistofverwerking instrumenten, en kan worden gebruikt voor vele medium tot hoog-klinische toepassingen en soorten monsters.
TruTip is een eenvoudige nucleïnezuur extractie technologie waarbij een poreuze monolithische bindende matrix wordt in een pipetpunt. De geometrie van de monoliet kunnen worden aangepast voor specifieke pipetpunten variërend in volume 1,0-5,0 ml. De grote porositeit van de monoliet maakt visceuze of complexe monsters gemakkelijk doorheen kan met minimale fluidisch tegendruk. Bidirectionele stroom maximaliseert verblijftijd tussen de monoliet en steekproef, en maakt grote steekproef volumes worden verwerkt binnen een TruTip. De fundamentele stappen, ongeacht monstervolume of TruTip geometrie omvatten cellyse nucleïnezuur binding aan de binnenste poriën van de TruTip monoliet, het wegwassen van ongebonden monster onderdelen en lysis buffers en geëlueerd gezuiverd en geconcentreerd nucleïnezuren in een geschikte buffer. De attributen en het aanpassingsvermogen van TruTip worden aangetoond in drie geautomatiseerde klinische monster verwerkingsprotocollen met een Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR en Starplus liquid handling robots, waaronder RNA isolatie uit nasopharyngeal aspireren, genomische DNA-isolatie uit volbloed en foetale DNA-extractie en verrijking van grote hoeveelheden plasma van de moeder (respectievelijk).
Nucleïnezuur zuivering is noodzakelijk voor de meeste moleculaire diagnostiek, alleen het onderzoek te gebruiken, en life science applicaties. Verschillende benaderingen zijn gekomen sinds de tijd van fenol / chloroform extracties, waarvan vele zijn gebaseerd op het fundamentele beginsel van nucleïnezuur binding aan silica in aanwezigheid van chaotrope zouten 1. Het extractieproces is gestroomlijnd en geautomatiseerd door het gebruik van verschillende kralen-en membraan-gebaseerde formaten, met spin filters, magnetische kralen en aanverwante benaderingen domineren de life sciences industrie (zie voorbeelden in 2-13). Hoewel effectief, hebben deeltjes en membranen beperkingen bekend wanneer ze geconfronteerd worden met uitdagende klinische matrices. Bijvoorbeeld, membranen en bead-based kolommen voldoen, hebben kleine poriën (dus, hoge drukken rug), en vereisen een soort van steun om te worden verwerkt door een centrifuge of een vacuümsysteem. De fysische eigenschappen van membranen en kralen kolommen leidensignificant vloeibare weerstand, dat het soort monsters die efficiënt kan worden verwerkt zonder verstopping van de verbruiksgoederen en / of het totaal (input) monstervolume dat unidirectioneel verwerkt via de stromingsbaan kan worden beperkt. Anderzijds moet magnetische deeltjes in het monster worden verdeeld door roeren. De noodzaak om homogeen verdelen magnetische deeltjes in een oplossing beperkt de totale input monstervolume dat kan worden verwerkt met de meeste magnetische bead verbruiksgoederen. Klinisch monster attributen (zoals viscositeit of complexiteit) kan tot inefficiënte magnetisch concentratie aan de zijkant van een buis of stang. Daarnaast kan silica fijn stof af te breken van de korrels tijdens het extractieproces, verliezen hun magnetisatie en vervuilen het eindmonster.
De TruTip technologie is ontwikkeld sommige nucleïnezuurmonster verwerking beperkingen en restricties 14 overwinnen. Door het inbedden van een poreuze monoliet binnenpipetpunt, fluïdische tegendruk wordt verlaagd, waardoor flow control stelt door middel van vacuüm (dwz pipet aspiratie). Deze functie maakt het extractieproces en instrumentatie die nodig zijn om nucleïnezuren uit moeilijke types monster zuiveren sterk vereenvoudigd worden (figuur 1). De geometrie en de porositeit van de monoliet is afgestemd op verstopping te minimaliseren, terwijl de dikte van de monoliet voldoende nucleïnezuur bindingscapaciteit voor monstervolumes variërend 1,0-5,0 ml. Bidirectionele stroom tijdens monsteraspiratie en doseren zorgt voor langere verblijftijden tussen het monsterextract en de binding monoliet voor een efficiënte nucleïnezuur herstel en elutie, en maakt relatief grote steekproef volumes te verwerken dat het volume capaciteit van de pipet tip zelf overschrijdt. We hebben eerder gemeld de ontwikkeling en toepassing van een handmatige procedure TruTip voor het zuiveren van influenza RNA uit nasopharyngeal monsters met behulp van een enkel-of meerkanaals Rainin pipet 15. Equivalent extractie efficiëntie werd verkregen tussen geautomatiseerde QIAcube en handmatige TruTip methoden bij 10 6 genkopieën influenza A per ml nasopharyngeal aspireren. Het doel van deze studie was om het midden-en high-throughput, geautomatiseerde TruTip nucleïnezuurzuivering procedures voor nasopharyngeal aspireren (NPA) en andere klinisch relevante soorten, met gebruik van liquid handling robots vaak gevonden in verwijzing klinische laboratoria aan.
De eenvoud van de TruTip concept en workflow (figuur 1) maken het gemakkelijk aangepast, geautomatiseerd, efficiënt en effectief voor een aantal klinische monstermatrices, ingang monster volumes en liquid handling systemen. Er dient echter te worden erkend dat elk klinisch monster is uniek en verschilt ene naar de volgende in viscositeit, deeltjes, slijm, verontreinigingen, microbiële en / of menselijke genetische achtergronden. Gegeven de verwachte veranderingen in de klinische steekproef samenstelling en het beoogde gebruik van een geautomatiseerde TruTip monstervoorbereiding protocol, kan het noodzakelijk zijn om bepaalde stappen in een TruTip procedure om de gewenste resultaten voor een bepaald type monster te bereiken te wijzigen. Ongeacht het type monster echter TruTip parameters die typisch de meest significante impact op nucleïnezuur zuiverheid en / of terugwinning omvatten:
Omdat de geometrie, pipetpunt materiaal, en de gehechtheid methode om de robot kanaal armen zijn uniek voor elke fabrikant van het instrument, is een andere TruTip construct vereist voor elke liquid handling systeem. De TruTip monoliet afmetingen (diameter, dikte en poriegrootte) correleren met nucleïnezuur bindingscapaciteit (en elutie efficiëntie), zoals verwacht voor een vaste-fase extractie techniek. Terwijl dikke (> 4 mm) matrices kunnen worden ingebed in een 1 ml TruTip tot nucleïnezuur bindingscapaciteit voor zware volumemonsters verhogen en / of egaliseren de bindingscapaciteit in specifieke TruTip formats, er een afweging tussen TruTip dikte en stroomsnelheden tijdens de initiële binding stap (in aanwezigheid van ruwe lysaten). Derhalve is het soms voordelig om grotere diameter monolieten insluiten in een groter volume pipetpunten voor de eerste stappen van een geautomatiseerd protocol (bijv. </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips voor groot-volume extracties). Gezien de specifieke TruTip configuraties gedicteerd door de fabrikanten van liquid handling robots wij echter niet per se verwachten TruTip nucleïnezuur rendementen op identiek voor liquid handling platformen van verschillende fabrikanten, of over verschillende TruTip maten zijn.
Klinische monsters (per definitie) zal aanzienlijke hoeveelheden van het menselijk genoom DNA bevatten, tenzij ze worden verkregen uit een normaal steriele plaatsen (bv cerebrospinale vloeistof). Soms menselijk genomisch DNA wordt gewenst (zoals in figuur 6), terwijl in andere toepassingen de menselijke DNA vertegenwoordigt een ongewenste genomische achtergrond (zoals bij figuur 5). De aanwezigheid van achtergrond DNA is gewoonlijk geen probleem zolang de totale hoeveelheid nucleïnezuur in het monster wordt de bindingscapaciteit van de monoliet niet overschrijden, en de achtergrond DNA kan dienen als een drager als de gewenste doelwitnucleïnezuurzuur is aanwezig in zeer kleine hoeveelheden. Het doel van de high-volume plasma extractie protocol (figuur 7) is te isoleren (gefragmenteerde) foetaal DNA in de aanwezigheid van een 10-20-voudige overmaat van maternale DNA, die vergelijkbaar is met de monstervoorbereiding doelstelling tests voor infectieziekten uitzondering de sequenties zijn zeer congruent en kan slechts worden verkregen door zeer specifieke moleculaire tests en / of discriminatie grootte. In dit geval wordt de totale circulerende DNA geïsoleerd met behulp van een 5 ml TruTip en daaropvolgende hoogmoleculaire en laagmoleculaire foetale DNA gescheiden door daaropvolgende binding en elutie van een 1 ml TruTip doordat het de binding buffer omstandigheden. Selectieve scheiding volgens grootte en verrijking van doelnucleïnezuren op basis van hun binding en elutie eigenschappen over een silicagelkolom monoliet is significant verschillend werkingsmechanisme dan bereikt door membranen of grootte exclusie spinkolommen. Maat scheiding en verrijking van microbiële DNA uit humaan genomisch DNA kan eenccomplished in toekomstige toepassingen via het aanpassen TruTip binding en elutiebuffers.
De geautomatiseerde protocollen aangetoond benadrukken hier het nut van de TruTip monoliet zelf te verwerken verschillende klinische monsters, en hoe het kan worden aangepast voor grote volumes en specifieke vloeistofverwerking robots. De gestroomlijnde methoden meestal resulteren in snellere extractieprotocollen vergelijking met andere geautomatiseerde systemen. De eenvoud van de TruTip technologie echter biedt ook een aantal kostenvoordelen voor diegenen die geïnteresseerd in aanschaf van een nieuwe, geautomatiseerde nucleïnezuur zuiveringssysteem, omdat de primaire hardware die voor automatisering TruTip procedures is het kanaal pipet arm zelf en niet magnetische staven, vacuümsystemen , of on-board centrifuges. Gebruik te maken van vooraf ingevulde reagens platen kan ook verminderen ruimte en benodigde verbruiksartikelen, en het dubbele van de omzet per run. Het minimaliseren van het dek ruimte met TruTip protocollen ook zorgt voor geavanceerde gebruikers te integreren stroomopwaarts of downstream geautomatiseerde processen met de TruTip. Bijvoorbeeld Hamilton easyBlood oplossing te fractioneren volbloed kan worden samengevoegd met de geautomatiseerde TruTip extractiemethode, die aanzienlijk biobanking processen zou stroomlijnen. Post-extractie processen zoals nucleïnezuur kwantificatie, normalisatie, PCR set-up, of DNA-sequencing zijn ook gemakkelijk geïntegreerd met TruTip op de grotere liquid handling platforms.
The authors have nothing to disclose.
Delen van dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) onder toekenning R 44 AI072784. Wij danken dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson en Amy Dean van het Laboratorium voor Virale Ziekten, Wadsworth Center, New York State Dept of Health voor gekwantificeerde influenza virusdeeltjes en toegang tot klinisch gevalideerde influenza real-time PCR assays.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |