TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. Conseguentemente, il formato preparazione del campione è compatibile con gli strumenti di manipolazione più liquidi, e può essere utilizzato per molte applicazioni cliniche medio-alto throughput e tipi di campione.
TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. La geometria del monolite può essere adattato per specifici puntali variano nel volume di 1,0-5,0 ml. La grande porosità del monolite consente campioni viscosi o complessi di passare facilmente attraverso di esso con la minima contropressione fluidico. Flusso bidirezionale massimizza il tempo di permanenza tra il monolito e il campione, e consente grandi volumi di campione da elaborare all'interno di un singolo TruTip. I passi fondamentali, indipendentemente dal volume di campione o geometria TruTip, includono la lisi cellulare, vincolante per i pori interni della TruTip monolite acido nucleico, lavando via i componenti del campione non legato e buffer di lisi e eluizione di acidi nucleici purificati e concentrati in un tampone appropriato. Gli attributi e le capacità di adattamento di TruTip sono dimostrate in tre protocolli di trattamento del campione clinici automatici utilizzando un epMotion Eppendorf 5070, STARPLUS robot di manipolazione dei liquidi, inclusi l'isolamento dell'RNA da aspirato nasofaringeo, estrazione di DNA genomico da sangue intero, e l'estrazione del DNA fetale e arricchimento da grandi volumi di plasma materno (rispettivamente) e Hamilton STAR.
Nucleico purificazione acido è necessario per la diagnostica molecolare più, uso di ricerca, e le applicazioni delle scienze della vita. Vari approcci sono emerse dopo il tempo di fenolo / cloroformio, molte delle quali sono basate sul principio fondamentale di legame alla silice in presenza di sali di acido nucleico caotropici 1. Il processo di estrazione è stato semplificato e automatizzato attraverso l'uso di vari formati di perline e membrana a base, con filtri rotativi, perline magnetiche e approcci connessi dominano il settore delle scienze della vita (vedi esempi in 2-13). Mentre efficace, le particelle e le membrane hanno conosciuto limiti quando si confronta con le matrici clinici difficili. Per esempio, le membrane e colonne bead-based sono compliant, hanno piccole dimensioni dei pori (quindi, elevate pressioni di schiena), e richiedere un certo tipo di sostegno al fine di essere trasformati con un sistema di centrifugazione o di vuoto. Le caratteristiche fisiche di membrane e colonne tallone risultato insignificativa resistenza fluida, che limita il tipo di campioni che possono essere elaborati in modo efficiente senza intasare il consumo, e / o il volume totale (input) di esempio che può essere unidirezionalmente elaborati attraverso il percorso di flusso. Viceversa, particelle magnetiche devono essere distribuiti in tutto il campione mediante agitazione. La necessità di distribuire omogeneamente particelle magnetiche all'interno di una soluzione limita il volume del campione totale di ingresso che può essere elaborato con i materiali di consumo di perline più magnetici. Esempio di attributi clinici (quali viscosità o complessità) può portare ad una concentrazione inefficiente particella magnetica sul lato di un tubo o asta. Inoltre, silice polveri sottili possono staccarsi delle perline durante il processo di estrazione, perdendo la loro magnetizzazione e contaminare il campione finale.
La tecnologia TruTip stata sviluppata per superare alcuni di questi vincoli di acido nucleico campione e limiti di lavorazione 14. Incorporando un monolite poroso all'interno di unpunta di pipetta, fluidico contropressione si abbassa, che permette il controllo del flusso di aspirazione (cioè pipetta di aspirazione). Questa caratteristica consente al processo di estrazione e strumentazione necessaria per purificare acidi nucleici da tipi di campioni difficili essere notevolmente semplificato (Figura 1). La geometria e la porosità del monolito è su misura per minimizzare intasamento, mentre lo spessore del monolito fornisce sufficiente acido nucleico capacità di legame per volumi di campione che vanno 1,0-5,0 ml. Flusso bidirezionale durante l'aspirazione del campione e di erogazione consente tempi di residenza prolungati tra il campione e il monolito vincolante per efficiente recupero di acido nucleico e di eluizione, e consente relativamente grandi volumi di campione da lavorare che superi la capacità di volume del puntale stesso. Abbiamo precedentemente riportato lo sviluppo e l'applicazione di una procedura TruTip manuale per la purificazione di RNA di influenza da campioni del rinofaringe utilizzando un singolo o multi-canale Rainin pipetta 15. Efficienze di estrazione equivalenti sono stati ottenuti tra automatizzato QIAcube e metodi TruTip manuali a 10 6 copie del gene influenza A per ml aspirato nasofaringeo. L'obiettivo di questo studio era di dimostrare a medio e alto-rendimento, automatizzati TruTip nucleici procedure di purificazione di acidi per aspirato nasofaringeo (NPA) e altri tipi di campioni clinicamente rilevanti, utilizzando robot di manipolazione dei liquidi che si trovano comunemente nei laboratori clinici di riferimento.
La semplicità del concetto TruTip e workflow (Figura 1) lo rendono facilmente adattabile, automatizzato, efficiente ed efficace per una serie di matrici di campioni clinici, volumi di campionamento in ingresso, e sistemi di manipolazione dei liquidi. Va riconosciuto, tuttavia, che ogni campione clinico è unico, e varierà uno all'altro in viscosità, particolati, muco, contaminanti, microbici, e / o sfondi genetiche umane. Dato variazioni previste nella composizione del campione clinico e usi previsti per un protocollo di preparazione del campione TruTip automatizzato, può quindi essere necessario modificare alcuni passaggi in una procedura TruTip al fine di ottenere i risultati desiderati per un tipo specifico campione. Indipendentemente dal tipo di campione, tuttavia, TruTip parametri che in genere hanno l'impatto più significativo sulla purezza dell'acido nucleico e / o recupero comprendono:
Perchè la geometria, materiale pipetta punta, e il metodo di fissaggio ai bracci robotici canale sono unici per ogni marca di strumenti, è richiesto un diverso costrutto TruTip per ogni sistema di gestione dei liquidi. Le dimensioni monolite TruTip (diametro, spessore e dimensione dei pori) sono correlate con l'acido nucleico capacità di legame (e l'efficienza di eluizione), come previsto per qualsiasi tecnica di estrazione in fase solida. Mentre spessi (> 4 mm), matrici possono essere incorporati in un TruTip 1 ml di acido nucleico per aumentare capacità di legame per campioni di grande volume e / o equalizzare la capacità di legame di tutti i formati TruTip specifici, vi è un compromesso tra lo spessore TruTip e portate durante la fase di legame iniziale (in presenza di lisati greggio). Così, a volte è vantaggioso incorporare monoliti di diametro maggiore in grandi volumi puntali per le fasi iniziali di un protocollo automatizzato, (ad es </ Em> i 5 ml Hamilton / Akonni TruTips per estrazioni di grande volume). Date le configurazioni TruTip specifiche dettate dai costruttori di robot di manipolazione dei liquidi, tuttavia, non necessariamente aspettiamo TruTip rendimenti di acidi nucleici per essere identici per tutte le piattaforme di gestione dei liquidi di diversi produttori, o attraverso diverse dimensioni TruTip.
Campioni clinici (per definizione) conterranno quantità significative di DNA genomico umano a meno che non sono acquisite da siti normalmente sterili (ad esempio liquido cerebro-spinale). A volte il DNA genomico umano è desiderato (come in figura 6), mentre in altre applicazioni del DNA umano rappresenta un fondo genomico indesiderato (come per la Figura 5). La presenza di DNA di sfondo non è solitamente problematico finché la quantità totale di acido nucleico nel campione non supera la capacità di legame del monolito, e il DNA sfondo può servire come un trasportatore, se il nucleico target desideratoacido è presente in tracce. L'obiettivo del protocollo di estrazione del plasma ad alta disponibilità (Figura 7) è isolare (frammentato) DNA fetale in presenza di un eccesso di piega 10-20 DNA materno, che è simile all'obiettivo preparazione del campione di test di malattie infettive tranne che le sequenze sono altamente congruenti e possono essere distinti da collaudo molecolare altamente specifico e / o di discriminazione dimensione. In questo caso, il DNA totale circolante viene isolato utilizzando un 5 ml TruTip, e successiva DNA fetale peso molecolare elevato e basso peso molecolare vengono separati mediante eluizione e successivo legame ad un 1 ml TruTip alterando le condizioni del tampone di legame. Separazione dimensionale selettivo e arricchimento di acidi nucleici bersaglio in base alle loro proprietà di legame e di eluizione di un monolito di silice è una modalità di azione significativamente diverso rispetto raggiunto da membrane o esclusione dimensionale colonne di rotazione. Separazione dimensione e l'arricchimento del DNA microbico da DNA genomico umano può essere unccomplished in future applicazioni tramite la personalizzazione TruTip vincolante e tamponi di eluizione.
I protocolli automatizzati dimostrato qui sottolineare l'utilità del TruTip monolite stesso per l'elaborazione di diversi campioni clinici, e come può essere adattato per grandi volumi e specifiche robot di manipolazione dei liquidi. I metodi semplificati di solito sfociano in protocolli di estrazione più veloce rispetto ad altri sistemi automatizzati. La semplicità della tecnologia TruTip, tuttavia, offre anche alcuni vantaggi di costo per coloro che sono interessati all'acquisto di un nuovo sistema automatizzato di purificazione acido nucleico, perché l'hardware primaria necessaria per l'automazione delle procedure TruTip è il braccio pipetta canale stesso, piuttosto che barrette magnetiche, sistemi per il vuoto , oppure a bordo centrifughe. Utilizzando le piastre dei reagenti preriempite può anche ridurre lo spazio e materiali di consumo necessari, e raddoppiare la velocità per corsa. Riducendo al minimo spazio della piattaforma con i protocolli TruTip consente inoltre agli utenti avanzati di integrare a monte o dprocessi automatizzati ownstream con il TruTip. Per esempio soluzione easyBlood di Hamilton al sangue intero frazionare può essere incorporato con il metodo di estrazione TruTip automatizzato, che sarebbe snellire significativamente i processi bio-banking. Processi di post-estrattivi, come la quantificazione degli acidi nucleici, la normalizzazione, PCR set-up, o sequenziamento del DNA sono anche facilmente integrati con TruTip sulle grandi piattaforme di gestione dei liquidi.
The authors have nothing to disclose.
Parti di questo lavoro sono stati sostenuti dal National Institutes of Health (NIH) in concessione R 44 AI072784. Ringraziamo il Dr. Kirsten San Giorgio, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean del Laboratorio di virologia, Wadsworth Center, New York State Dipartimento di Sanità per virioni influenzali quantificati e l'accesso ai clinicamente validato influenza in tempo reale PCR.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |