TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 따라서, 샘플 준비 형식은 대부분의 액체 취급 장비와 호환되며, 높은 처리량 임상 응용 및 샘플 유형에 여러 매체에 사용할 수 있습니다.
TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 기둥의 형상은 1.0에서 5.0 ML에 볼륨까지 특정 피펫 팁을 적용 할 수 있습니다. 모노리스의 큰 기공은 쉽게 최소한의 유체 배압으로 통과 점성 또는 복잡한 시료 수 있습니다. 양방향 흐름은 기둥과 샘플 사이의 체류 시간을 극대화하고 단일 TruTip 내에서 처리 할 큰 샘플 볼륨을 할 수 있습니다. 에 관계없이 샘플 볼륨 또는 TruTip 기하학의 기본 단계, 세포 용해, TruTip 모노리스의 내부 기공에 바인딩 핵산, 언 바운드 샘플 구성 요소 및 용해 버퍼를 씻어하고, 적절한 버퍼로 정제 농축 핵산 용출 있습니다. TruTip의 특성과 적응성이 에펜 도르프 epMotion 5070를 사용하여 세 개의 자동화 된 임상 샘플 처리 프로토콜에 설명되어 있습니다해밀턴 스타와 비 인두 흡인, 전체 혈액에서 게놈 DNA 분리 및 태아 DNA 추출 및 모체 혈장의 대량 (각각)에서 농축로부터 RNA 분리 등 STARplus 액체 처리 로봇.
핵산 정제는 대부분의 분자 진단에 대한 연구는 사용할 필요하고, 생명 과학 응용 프로그램. 다양한 방법이 클로로포름 / 페놀 추출의 시간 이후 등장, 그 중 많은 chaotropic 소금 1의 존재 실리카에 바인딩 핵산의 기본 원칙을 기반으로하고 있습니다. 추출 과정은 (2-13 예제를 참조하십시오) 스핀 필터, 자석 구슬 및 생명 과학 산업을 지배하는 관련 방법과 다양한 비드와 멤브레인 기반 형식의 사용을 통해 간소화 및 자동화하고있다. 효과적인 동안 도전적인 임상 행렬에 직면했을 때, 입자 막은 한계를 알고있다. 예를 들어, 세포막 비드 기반의 열 준수, 작은 기공 크기 (즉, 하이 백 압력)이 있고, 원심 분리기 또는 진공 시스템에서 처리 할 수 있도록 지원의 일부 유형을 필요로합니다. 세포막의 물리적 특성 및 비드 열 결과효율적 소모품 및 / 또는 유니 방향성 흐름 경로를 통해 처리 할 수있는 총 (입력) 샘플 볼륨을 막힘없이 처리 할 수있는 샘플의 종류를 제한하는 중요한 유체 저항. 반대로, 자석 입자를 교반하여 샘플에 배포해야합니다. 균일 솔루션 내에서 자성 입자를 배포 할 필요는 대부분의 자기 비드 소모품으로 처리 할 수있는 총 입력 샘플 볼륨을 제한합니다. 임상 샘플 속성 (예 : 점도 복잡성) 관 또는 막대의 측면에서 비효율적 자기 입자 농도로 이어질 수 있습니다. 또한, 실리카 미세 입자들이 자기를 잃고 최종 샘플을 오염, 추출 과정에서 구슬을 해소 할 수 있습니다.
TruTip 기술은 이러한 핵산 시료 처리 조건 및 제한 사항 14 중 일부를 극복하기 위해 개발되었다. 내 다공성 모노리스를 포함하여피펫 팁, 유체의 배압이 저하되어 진공 (즉, 피펫 흡인)에서 흐름 제어를 가능하게하는. 이 기능은 크게 (그림 1) 간소화하기 어려운 종류의 시료에서 핵산을 정화하는 데 필요한 추출 과정과 계측을 할 수 있습니다. 기둥의 형상과 다공성 모노리스의 두께가 1.0에서 5.0 ML에 이르기까지 샘플 볼륨에 대한 충분한 핵산 결합 용량을 제공하면서, 막힘 최소화하기 위해 지어진다. 시료 흡입 및 토출 동안 양방향 흐름은 샘플 추출하고 효율적인 핵산 복구 및 용출에 대한 바인딩 기둥 사이에 장기 체류 시간을 허용하고 피펫 팁 자체의 볼륨 용량을 초과하는 처리 할 상대적으로 큰 샘플 볼륨을 할 수 있습니다. 우리는 이전에 단일 또는 멀티 채널 라이를 사용하여 인두 샘플에서 인플루엔자 RNA를 정제하기위한 수동 TruTip 절차의 개발 및 응용 프로그램을보고닌 피펫 15. 동등한 추출 효율은 10 6 유전자 사본에 자동 QIAcube 및 수동 TruTip 방법 사이에 인플루엔자 ml 당 인두 흡인을 하였다. 본 연구의 목적은 일반적 참고 임상 실험실에있는 액체 처리 로봇을 사용하여 비 인두 흡인 (NPA) 및 기타 임상 관련 샘플 유형에 대한 중간 및 높은 처리량, 자동화 TruTip 핵산 정화 절차를 시연했다.
TruTip 개념 및 워크 플로우의 단순성 (그림 1)은 쉽게 자동화 효율성 및 임상 시료 매트릭스, 입력 샘플 볼륨 및 액체 처리 시스템의 수에 대한 효과적인 적응합니다. 그것은 모든 임상 샘플 독특한, 그러나, 인식되어야하며, 점도 향후 한, 분진, 점액, 표면 오염 물질, 미생물, 및 / 또는 인간의 유전 적 배경을 달라집니다. 임상 샘플 구성 및 자동화 TruTip 샘플 준비 프로토콜의 의도 된 용도에 예상되는 변화 감안할 때, 그것은 따라서 특정 시료 유형에 대해 원하는 결과를 달성하기 위해 TruTip 과정의 특정 단계를 수정해야 할 수도 있습니다. 에 관계없이 샘플 유형, 그러나, 일반적으로 핵산의 순도 및 / 또는 회복에 가장 큰 영향을 미칠 TruTip 매개 변수는 다음과 같습니다 :
로봇 채널 팔의 형상, 피펫 팁 자료 및 부착 방법은 각 악기 제조 업체 고유하기 때문에, 다른 TruTip의 구조는 각 액체 처리 시스템이 필요합니다. TruTip 기둥 치수 (직경, 두께, 기공 크기)는 핵산 결합 용량 (및 용출 효율)과 상관 관계 않는 등의 고체상 추출 기술에 대해 예상된다. 두께 (> 4mm) 행렬 대용량 샘플 및 / 핵산 결합 용량을 증가 또는 특정 TruTip 형식을 통해 바인딩 용량을 맞춰야하는 1 ML의 TruTip에 포함 할 수 있지만, TruTip 두께와 유량 사이의 트레이드 오프 중에있다 초기 바인딩 단계 (원유 해물의 존재). 따라서, 자동화 프로토콜의 초기 단계는 더 큰 볼륨 피펫 팁으로 더 큰 직경의 모노리스를 포함 때로는 유익 (예를 들어 </ em>를 대용량 추출을위한 5 ML 해밀턴 / Akonni TruTips). 액체 처리 로봇의 제조 업체에 의해 결정되는 특정 TruTip 구성을 감안할 때, 그러나, 우리는 반드시 TruTip 핵산 생산량은 다른 제조 업체, 또는 다른 TruTip 크기에 걸쳐 액체 처리 플랫폼에서 동일하게 기대하지 않습니다.
그들은 일반적으로 무균 사이트 (예를 들어 뇌척수액)로부터 획득하지 않는 한 임상 샘플 (정의에 의해) 인간 게놈 DNA의 상당한 수량을 포함합니다. 다른 응용 프로그램에서 인간의 DNA가 원하지 않는 게놈 배경 (그림 5)을 나타내는 반면, 때로는 인간의 게놈 DNA는 (그림 6)을 원하는 않습니다. 배경 DNA의 존재는 일반적으로 기둥의 결합 용량을 초과하지 않는 샘플 핵산의 총 금액만큼 문제가되지 않으며, 배경 DNA는 캐리어 역할을 할 수 원하는 타겟 핵산 경우산 미량 존재이다. 대용량 플라즈마 추출 프로토콜 (그림 7)의 목적은 제외 감염증 테스트의 샘플 준비의 목적과 유사합니다 산모 DNA의 20 배 초과의 존재 (조각화) 태아 DNA를 분리하는 것입니다 서열이 높은 합동에만 매우 구체적인 분자 시험 및 / 또는 크기 차별로 구분할 수 있습니다. 이 경우, 전체 순환 DNA는 5 ML TruTip, 후속 고분자와 저분자 태아 DNA를 분리를 사용하여 격리 된 바인딩 버퍼 조건을 변경하여 1 ML의 TruTip 이후에 바인딩 및 용출. 실리카 모노리스에 그들의 바인딩과 용출 특성에 따라 타겟 핵산의 선택적 크기의 분리와 농축 막 또는 크기 배제 스핀 컬럼에 의해 달성보다 행동의 유의 한 차이 모드입니다. 인간 게놈 DNA의 미생물 DNA의 크기 분리 농축 할 수 있습니다TruTip 바인딩 및 용출 버퍼를 사용자 정의를 통해 미래의 응용 프로그램에서 ccomplished.
자동화 된 프로토콜은 여기에 다양한 임상 샘플을 처리 TruTip 모노리스 자체의 유틸리티 및 방법은 많은 양의 특정 액체 처리 로봇 적용 할 수 있습니다을 강조 보여 주었다. 유선형의 방법은 일반적으로 다른 자동화 시스템에 비해 빠른 추출 프로토콜에서 결과. TruTip 절차를 자동화하는 데 필요한 기본 하드웨어 피펫 채널 암 자체보다는 자기 봉, 진공 시스템이기 때문에 TruTip 기술의 단순함은, 그러나, 또한 새로운 자동 핵산 정화 시스템 구매에 관심있는 사람에 대한 몇 가지 비용 이점을 준다 또는 온보드 원심 분리기. 미리 채워진 시약 판을 활용하면 공간과 필요한 소모품을 줄이고, 실행 당 처리량을 두 배로 할 수 있습니다. TruTip 프로토콜과 데크 공간을 최소화하면 통합하는 고급 사용자 수 상위 또는 DTruTip와 ownstream 자동화 된 프로세스. 예를 들어 분별 전혈 해밀턴의 easyBlood 솔루션은 크게 바이오 뱅킹 프로세스를 간소화 할 자동화 TruTip 추출 방법으로 통합 할 수 있습니다. 같은 핵산 정량, 정상화, PCR 셋업, 또는 DNA 시퀀싱과 같은 글 추출 프로세스는 쉽게 큰 액체 처리 플랫폼 TruTip에 통합되어 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품의 일부는 부여 R 44 AI072784에 따라 국립 보건원 (NIH)에 의해 지원되었다. 우리는 박사 키얼 스틴 세인트 조지, 사라 B. Griesemer, 대릴 램슨 및 바이러스 성 질병, 워즈워스 센터, 정량 인플루엔자 비리 및 임상 검증 인플루엔자 실시간 접근을위한 건강의 뉴욕 주학과 연구소의 에이미 딘 감사합니다 PCR의 분석.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |