Summary
TruTip är en enkel nukleinsyra extraktion teknik varigenom en porös, monolitisk bindande matris är införd i en pipettspets. Följaktligen är provberedning format som är kompatibelt med de flesta vätskehantering instrument, och kan användas för många medium till hög kapacitet kliniska tillämpningar och provtyper.
Abstract
TruTip är en enkel nukleinsyra extraktion teknik varigenom en porös, monolitisk bindande matris är införd i en pipettspets. Geometrin av monoliten kan anpassas för specifika pipettspetsar varierar i volym från 1,0 till 5,0 ml. Den stora porositet monoliten möjliggör viskösa eller komplexa prover för att lätt passera igenom det med minimal fluidisk mottryck. Dubbelriktat flöde maximerar uppehållstid mellan monoliten och prov, och möjliggör stora provvolymer som ska behandlas inom en enda TruTip. De grundläggande stegen, oberoende av provvolymen eller TruTip geometri, inkluderar cellys, nukleinsyrabindning till de inre porerna i TruTip monolit, borttvättning komponenter obundet prov och buffertar lys, och eluering renades och koncentrerades nukleinsyror i en lämplig buffert. Attributen och anpassningsförmåga TruTip demonstreras i tre automatiserade kliniska protokoll sampelbehandlingen med en Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR och STARplus flytande robotar hantering, däribland RNA isolering från nasofarynxaspirat, genomisk DNA-isolering från helblod, och fetalt DNA extraktion och anrikning av stora volymer av moderns plasma (respektive).
Introduction
Nukleinsyrarening är nödvändigt för de flesta molekylär diagnostik, forskning bruk, och livet applikationer vetenskap. Olika metoder har dykt upp sedan tiden för fenol / kloroform extraktioner, många av vilka bygger på den grundläggande principen om nukleinsyrabindning till kiseldioxid i närvaro av kaotropa salter 1. Utvinning processen har varit rationaliseras och automatiseras med hjälp av olika pärla-och membran-baserade format, med spinn filter, magnetiska pärlor och metoder för detta dominerar biovetenskap industrin (se exempel i 2-13). Medan effektiva, har partiklar och membran kända begränsningar när de konfronteras med utmanande kliniska matriser. Till exempel, membran och kulbaserade kolumner är godkända, har små porstorlekar (sålunda, höga mottryck), och kräver någon typ av stöd för att behandlas av en centrifug eller vakuumsystem. De fysikaliska egenskaperna hos membran och pärla kolumner resulterar ibetydande fluidic motstånd, vilket begränsar den typ av prover som effektivt kan behandlas utan att täppa till förbrukningsvara, och / eller den totala (input) provvolym som kan vara uni-directionally bearbetas genom flödesbanan. Omvänt måste magnetiska partiklar skall fördelas över hela genom omrörning. Behovet av att homogent fördela magnetiska partiklar inom en lösning begränsar den totala volymen insamplet som kan bearbetas med de flesta magnetiska pärlor förbrukningsvaror. Kliniska prov attribut (såsom viskositet eller komplexitet) kan leda till ineffektiv magnetisk partikelkoncentration på sidan av ett rör eller en stång. Dessutom kan kiseldioxid fina partiklar bryta av pärlorna under extraheringen, förlorar sin magnetisering och förorenar det slutliga provet.
Den TruTip Tekniken utvecklades för att övervinna några av dessa nukleinsyra bearbetning syrliga prov restriktioner och begränsningar 14. Genom att bädda en porös monolit inom enpipettspetsen, fluidic mottryck sänks, vilket möjliggör flödesreglering genom vakuum (dvs. pipett aspiration). Denna funktion möjliggör extraktion och instrumentering som krävs för att rena nukleinsyror från svåra provtyper att förenklas avsevärt (figur 1). Geometrin och porositet av monoliten är skräddarsydd för att minimera igensättning, medan tjockleken av monoliten ger tillräcklig nukleinsyra bindningskapacitet för provvolymer som sträcker sig från 1,0 till 5,0 ml. Dubbelriktad flödet under prov aspiration och dispensering möjliggör förlängda uppehållstider mellan provextraktet och bindande monolit för effektiv nukleinsyra återhämtning och eluering, och möjliggör relativt stora provvolymer som skall bearbetas som överstiger den volym kapacitet pipettspetsen själv. Vi rapporterade tidigare utveckling och tillämpning av en manuell TruTip förfarande för rening av influensa RNA från nasofarynxprov med en enkel-eller flerkanaligt Rainin pipett 15. Likvärdiga utvinning effektivitetsvinster erhölls mellan automatiserad QIAcube och manuella metoder TruTip vid 10 6 genkopior influensa A per ml nasofarynxaspirat. Syftet med denna studie var att visa medel-och hög genomströmning, automatiserade TruTip nukleinsyror förfaranden sura rening för nasofarynxaspirat (NPA) och andra kliniskt relevanta typer provet med vätskehantering robotar vanligen finns i referens kliniska laboratorier.
Protocol
Tre automatiserade TruTip utvinning protokoll beskrivs och demonstreras här: 1) medel-genomströmning RNA-extraktion från NPA på en Eppendorf epMotion 5070, 2) hög genomströmning genomisk DNA-extraktion från låga volymer av helblod på Hamilton STAR, och 3) selektiv isolering och anrikning av fragmenterad foster-DNA från stora volymer av moderns plasma på Hamilton STARplus. Automatiserade skript finns tillgängliga från Akonni och endast hög nivå program deskriptorer ges här. Utvinning och eluering reagenser automatiskt ut från bulk reagens tråg till 96-brunnar med automatiserade script (s) innan de kliniska proverna bearbetas.
Ett. Automatiserad RNA-extraktion från nasofarynxaspirat
Den tidigare beskrivna manuella TruTip metod 15 är nu anpassad för att köras på en Eppendorf epMotion 5070 vätskehantering robot, med hjälp av en stor matris por TruTip inbäddad i 1,0 ml Eppendorf rörtte tips, en 2 ml djup-brunnar (USA Scientific), Akonni TruTip reagenser utvinning och NPA som provtyp. Den epMotion 5070 vätskehantering robot rymmer upp till 8 tips samtidigt, så en baslinje automatiserat protokoll beskrivs för 8 parallella extraktioner. Emellertid kan upp till 24 prover behandlas under ett enda program i en djup och 96-brunnars provplattan. En separat epMotion program är tillgängliga (och krävs) för att bearbeta 16 eller 24 prover. Det protokoll som beskrivs nedan är för en 8 prov automatiserade skript.
Setup
- Ta nasofarynxprov till RT innan extraktionen.
- Fördela 100 l nasofarynxaspirat plus 150 l nukleasfritt vatten i kolumn 1 av provet plattan (Figur 2A).
- Placera provet plattan sätts på plats B1 på epMotion arbetsbordet (Figur 2B).
- Placera pipettspetsar, TruTips och 30 ml dalar reagensen in sina respektive epMotion Worktable positioner (Figur 2B).
- Öppna Eppendorf epBlue mjukvaran, välj Kör filen som Akonni för 8 prover, och laddar genom att klicka på knappen RUN på RUN fliken.
- Under Inställningar Nivågivare, välj Nivåer och tips, och klicka på knappen Kör.
- Input provets volym i mjukvaran och klicka på RUN.
- Den epMotion skriptet frågar användaren lägga till utvinning och eluering reagens till reagenstråg belägna vid position B2 på arbetsbordet. Lägg de rekommenderade volymer av varje reagens till respektive tråg. För 8 prover, de minsta reagensvolymer är:
| Reagens | Volym (ml) | Trough Position |
| 95% etanol | 3,5 | 2 |
| Wash Buffer D | 9,0 | 3 |
| Tvättbuffertkoncentrat E | 9,0 4 | |
| Elueringsbuffert A2 | 1,3 | 5 |
| Lys och Binding Buffer D | 11,0 | 6 |
- Mata in reagensvolymer i tabellen presenteras av epMotion programvaran under uppmaningen från steg 8 ovan. Det inmatade värdet ska avspegla den faktiska volymen buffert matas in av användaren i respektive reagens reservoar, och måste vara större än eller lika med de minsta volymerna som angivits ovan. Felaktiga inmatningar volym kan resultera i felaktiga volymer som levereras av epMotion hårdvara till varje rör eller brunn i 96-brunnar (er).
Automatiserad Program
- Välj RUN för att starta den automatiserade metoden. Den automatiserade skript kommer att gå igenom följande steg utan att användaren behöver:
Prov lys och reagens Distribution:- Fördela 375 l D lyseringsbuffert i kolumn 1 och blanda i 10cykler (apirate + dosera = 1 cykel). Detta steg börjar processen lys inkubation medan de återstående reagens alikvoterades.
- Dosera 1,6 ml Wash Buffer D i kolumn 2.
- Dosera 1,6 ml E Wash Buffer i kolumn 3.
- Fördela 50 pl elueringsbuffert A i kolumn 4.
- Paus för 6 minuter att slutföra 10 inkubation min prov i lyseringsbuffert D.
- Lägg 375 pl etanol till varje brunn i kolumn 1, blandning av varje prov med etanol genom pipettering 10 cykler.
- Ladda 8 TruTips från position A2 på arbetsbordet, och börja extraktionsprocessen beskrivs översiktligt i fig 1.
- Aspirera och dispensera prov / lyseringsbuffert / etanol-blandning från kolumn 1 av provet plattan för sju cykler att binda nukleinsyra till TruTip monolit. Även provflödet genom TruTip kan variera (på grund av skillnader i kliniska provet viskositet), var nukleinsyra avkastningen för dessa prov nrt påverkas av flödet variation. Alternativ för att förbättra provets flöde beskrivs i diskussionen.
- Flytta TruTips till provplattan kolumn 2, och cykla Wash Buffer D 5x över monoliten att avlägsna rester lyseringsbuffert och provmatris.
- Flytta TruTips till provplattan kolumn 3, och cykla Wash Buffer E 5x över monoliten att avlägsna proteiner och andra föroreningar från den bundna nukleinsyra.
- Flytta TruTips till den tomma reagensbehållare position 1 (i arbetsbordet plats B2) och cykla 80x (vid en snabb flödeshastighet) för att torka monoliten. Det är viktigt att noggrant torka TruTip, såsom återstående lösningsmedel i eluerade nukleinsyra-preparat kommer att negativt påverka enzymer såsom omvänt transkriptas och Taq DNA-polymeras.
- Flytta TruTips till provplattan kolumn 4 och cykla 5x i Elution Buffert A. extraheras och renas nukleinsyra är nu i elueringsbufferten i kolumn provplattan 4 brunnar.
- Mata TruTips in i epMotion soptunna.
Programmet för 16 totalt prover kommer att upprepa stegen 10.1 till 10.13 med provplattan kolumnerna 5-8. För 24-program exempel, steg 10,1 till 10,13 upprepas 2x använda kolonner provplattan 5-8 och 9-12, respektive.
2. 96-väl genomisk DNA-extraktion från helblod
En Hamilton STAR vätskehantering robot används för att påvisa automatiserad extraktion av 96 prover samtidigt från helblod. The Hamilton STAR skiljer sig från epMotion systemet i att en frivillig värmare / skakutrustning är tillgänglig på däck, vilket är viktigt för enzymatisk digerering av vissa kliniskacal matriser, såsom helblod. Eftersom systemet kan förses med en 96-kanals pipett huvud, finns det en speciell 96-brunnar för varje TruTip steg och reagens.
Setup
- Slå på STAR instrumentet och datorn.
- Öppna Hamilton programvaran Run Control.
- Öppna Kör filen från Akonni för 96 prover.
- Placera laboratorieutrustning på STAR däck såsom visas i fig 3.
- Fördela reagenser till deras motsvarande dalar (volymer beteckna det minimum som krävs för att bearbeta 96 prover):
| Reagens | Volym (ml) | Trough Position |
| Lys och Binding Buffer F | 75 | 5 |
| 95% etanol | 100 | 6 |
| Wash Buffer J | 175 | 7 |
| TvättaBuffert K | 175 | 8 |
| Elueringsbuffert A2 | 12 | 9 |
| Proteinas K (20 mg ml -1) | 8 | 15 |
6. Låt prover i jämvikt till rumstemperatur.
7. Placera provrören i racken provbärare (däck position 4 i figur 3). Placera Prov 1 i den bakre delen av långt vänstra hållaren och flytta stegvis ner varje bärare med prov 96 slutar i främre högra positionen.
Automatiserad Program
- Markera Play-knappen i övre vänstra hörnet på Kör filen fönstret och mata in antalet prover som bearbetas. Den automatiserade skript kommer sedan gå igenom följande steg utan att användaren behöver:
Prov lys och reagens Distribution- Överför 200 | il från varje provrör till inkubationsplattan vid position 14 på hanater / shaker modulen (Figur 3).
- Dispensera 80 | il proteinas K i varje provexemplar brunn i inkubationsplattan.
- Dispensera 600 pl F lyseringsbuffert i varje brunn i inkubationsplattan.
- Blanda lösningen under 10 cykler, och sedan inkubera under 20 min vid 70 ° C och 500 rpm. De 70 ° C inställda temperatur resulterar i en ~ 60 ° C-provet temperatur inom den djupa brunnar, vilket är inom intervallet av proteinas K-aktivitet. Medan proverna inkubering, fortsätter vätskehanteringssystem operativsystem genom att fördela reagens till deras motsvarande plattor och brunnar:
- 100 pl elueringsbuffert A i varje brunn av den djupa brunnar i position 13.
- 800 | al etanol i varje brunn av den djupa brunnar vid position 10.
- 1,6 ml tvättbuffert K i varje brunn av den djupa brunnar vid position 12.
- 1,6 ml tvättbuffert J i varje brunn av den djupa brunnar vid position 11.
- Mata reagens tips i papperskorgen.
Extraktion
Denna del av gDNA blod förfarandet är mycket lik den epMotion influensa protokoll, med undantag för sammansättningen av tvätt reagenser och siffror cykel. The Hamilton TruTips tips är svart, så att flödet av vätskor genom TruTip inte är synlig.
- Ladda 96 TruTips från däck läge 3.
- Aspirera och dispensera provet / lyseringsbufferten / etanol-blandning i position 10 för 10 cykler för att binda nukleinsyror till TruTip monolit.
- Flytta TruTips att positionera 11 och cykla Wash Buffer J 5x över monoliten att avlägsna rester lyseringsbuffert och provmatris.
- Flytta TruTips att positionera 12 och cykla Wash Buffer K 5x att avlägsna proteiner och andra föroreningar från den bundna nukleinsyra. Cykla TruTip 40x i hög hastighet för att lufttorka.
- Flytta TruTips till position 13 och cykla 5x i Elution Buffer A2. Det extraherade och renad nukleinsyra är nu i elueringsbufferten i den djupa brunnar.
- Mata TruTips i papperskorgen.
När programmet är klart, ta bort Elution tavla från instrumentet och överföra de extraherade proverna till lämpliga rör för lagring eller efterföljande program.
Tre. DNA-extraktion från stora prover Volume Plasma
The Hamilton STARplus instrument används för att demonstrera ett automatiserat protokoll för extrahering cirkulerar fritt fetalt DNA från 5 ml moderns plasma. Den STARplus systemet kan stödja två automatiska vapen pipett kanal, en med 8 x 5 ml kanaler och en med 8 x 1 ml kanaler. Dessa vapen kan fungera parallellt för förskjutet bearbetning i satser om åtta prover vardera. En 5 ml TruTip används för den initiala large-volym extraktion, och en 1 ml TruTip används för storleksseparation och koncentration av den extraherade nukleinsyran.
Set-up
- Slå på STARplus instrumentet och datorn.
- Öppna Hamilton programvaran Run Control.
- Öppna Kör filen från Akonni för 8 stora prover volym plasma.
- Placera laboratorieutrustning på STARplus stativet som visas i figuren 4.
- Dispensera reagenser till deras motsvarande reservoarer:
| Reagens | Volym (ml) | Trough Position |
| CN-W1 | 17 | 5A |
| CN-W2 | 17 | 5B |
| CN-W4 | 21 | 5C |
| Proteinas K (20 mg ml -1) | 5 | 6A |
| EBB | 17 6B | |
| EBA2 | 5 | 6C |
| CN-W3 | 5 | 6D |
| CN-B2 | 5 | 6E |
| CN-B3 | 5 | 6F |
| CN-L1 | 52 | 7 |
| CN-B1 | 175 | 8 |
- Tillåt provet att komma i jämvikt till RT.
- Placera provrören i ställningarna provbärare (däck ställning 3 i figur 4). Placera Prov 1 i den bakre och flytta stegvis mot framsidan av däcket.
Automatiserad Program
Grund av den stora insamplet volym, måste lysis och homogenisering steg utföras off av Hamilton STARplus instrumentet i ett vattenbad. Åtgärder som kräver åtgärder från användaren inom den automatiserade protokoll är markerade med en asterisk (*) vid beginning av meningen, och fetstil.
Prov lys och reagens Distribution: Provet inkuberas med proteinas K och lyseringsbuffert att homogenisera provet och släpp DNA.
- Markera Play-knappen i övre vänstra hörnet på Kör filen fönstret. Mata in antalet prover som bearbetas, placeringen av pipettspetsar på däck, och platsen för TruTips på däck.
- Den automatiserade skript lägger 615 pl proteinas K, 5 ml plasma, och 6,2 ml Lyseringsbuffert CN-L1 till vardera 50 ml koniska rör, och kommer därefter PAUSE.
- * Ta bort de 50 ml koniska rör från provet däck, vortex under 30 sekunder på hög hastighet, och inkubera off-line i 30 min vid 60 ° C i ett vattenbad eller värmeblock. Efter de koniska rör avlägsnas från Hamilton däck, återuppta den automatiserade skript för att fortsätta distributionen av reagens i deras respektive matriser och brunnar (Figur 4B och 4C):
- 2 ml CN-W2 till varannan väl i position 9 kolumn 2.
- 2 ml CN-W4 till varannan väl i position 9 kolumn 3.
- 250 ^ EBA2 till varannan väl i position 9 kolumner 4 och 5.
- 495 pl KN-B2 till varannan väl i position 10 kolumn 1.
- 1 ml EBB till varje annan väl i position 10 kolumn 2.
- 500 | il CN-W3 till varje annan väl i position 10 kolumn 3.
- 500 | il CN-W4 till varannan väl i position 10 kolumn 4.
- 50 pl EBA2 till varannan väl i position 10 kolumn 5.
Eftersom de 5 ml kanalerna är för bred för att använda intilliggande brunnar för varje prov, de automatiserade program doserar reagens i varje annan brunn av djupa brunnar i däck position 9. Den mekaniska armen som används för 1 ml kanalerna kräver också användningen av alla andra bra i reagens plattor för uteslutning och koncentration stEPS av protokollet.
Efter utmatning reagenser, programmet pausas.
- * Efter 30 min, 60 ° C inkubering, placera 50 ml koniska rör på is under 5 min.
- * Avkastning på 50 ml koniska rör till sina ursprungliga positioner inom provbäraren rack på däck position 4, och återuppta den automatiserade skript.
- Tillsätt 12 ml bindningsbuffert CN-B1 till varje provrör och blanda 10x.
Stor volym Extraktion: 5 ml TruTips används vid extraktion av totalt DNA från lyserade plasmaprovet.
- Plocka upp 5 ml TruTips från position 2 för stora volymer nukleinsyra extraktion.
- Cykel provet mixture15 gånger i 50 ml koniska rör, med början i botten av röret och flytta 3 mm högre efter varje pipettering cykel. Detta steg binder den totala nukleinsyra till TruTip monolit.
- Flytta TruTips till de djupa brunnsplattor vid position 6 kolumn 1, och cycle 1x i Wash Buffer CN-W1.
- Flytta TruTips till läge 9 kolumn 2 och cykla 1x i Wash CN-W2.
- Flytta TruTips till läge 9 kolumn 3 och cykla 2x i Wash CN-W4.
- Flytta TruTips till läge 9 kolumn 4 och cykla 40x i hög hastighet för att torka bindande matris.
- Flytta TruTips till läge 9 kolumn 5 och cykla 10x att eluera de bundna nukleinsyror från 5 ml TruTips. Det är stora volymer eluering # 1.
- Flytta TruTips till kolumn 6 och upprepa steget med den andra alikvoten av elueringsbuffert. Det är stora volymer eluering # 2.
- Överför eluering # 2 i position 9 kolumn 5 för att kombinera det med eluering # 1, och kasta TruTips.
Uteslutning och Koncentration: Den DNA med hög molekylvikt avlägsnas från det extraherade provet, och den återstående DNA isoleras och koncentreras.
- Lägg kombinerat elueringsmedel från steg 22 till position 10 kolumn 1 och blanda väl 10x.
- Plocka upp 1 ml TruTips från position 13 och cykla 20x att binda DNA med hög molekylvikt till monoliten.
- Flytta TruTips till läge 10 kolumn 2 och cykla 5x att skölj spetsen och ta bort DNA med hög molekylvikt. De TruTips bibehålls och placeras tillbaka i spetsen racket i position 13.
- Med reagens tips från position 12, tillsätt 575 pl Binding Buffer KN-B3 till provet i position 10 kolumn 1 och blanda 10x.
- Plocka upp TruTips från steg 25, återvänder till position 10 kolumn 1, och cykla 20x för att binda den återstående DNA från provet till 1 ml TruTip.
- Flytta TruTips att positionera 10 kolumn 4 och cykla 1x i Wash CN-W3 för att avlägsna eventuella kvarvarande hämmare.
- Flytta TruTips att placera 10 kolumn 5 och cykla 1x i Wash CN-W4 att skölja restsalter från CN-W3.
- Höj TruTips över position 10 kolumn 5 och cykla luft igenom tipsen 35x torka monoliten.
- Flytta TruTips att positionera 10 kolumn 6 och cykla 10x i EBA2 att eluera renade, storlek-urvalTed och koncentrerad nukleinsyra.
- Släng TruTips.
- Överför det eluerade provet från kolumn 6-1,5 ml rör på plats 11. Extraherade prover är klara för lagring eller efterföljande bearbetning.
Representative Results
Real-time PCR data för influensa RNA-extraktion från NPA visas i figur 5A. Uppskattad nukleinsyra extraktion effektivitet liknar resultaten med den manuella versionen av protokollet 15. En linjär respons i genomsnitt c T-värden observeras mellan 10 4 och 10 6 gen kopior ml -1 ändrade influensa (R 2 = 0,99 och 0,98 för influensa A och B, respektive), med standardavvikelser i genomsnitt C t-värden mindre än 1 cykel. Frånvaron av korskontaminering med epMotion systemet visas i figur 5B, där 12 positiva NPA prover innehållande 10 6 genkopior ml -1 NPA varvades med 12 buffert blanksteg. Den genomsnittliga C t för de positiva kontrollerna var 30,16 ± 0,14, och alla buffert ämnen var negativa. Den totala provet handläggningstiden är 16, 28 och 40 minuter för 8, 16 och 24 prover.Eftersom en typisk klinisk nasofarynxaspirat eller pinnen kommer att innehålla 10 7 gen kopior ml -1 (förutsatt 1.000 virioner per TCID50 16 och> 10 4 TCID50 ml -1 influensa 17), är den automatiserade epMotion protokollet förväntas vara effektiv på en majoritet av kliniska NPA prover.
Mot bakgrund av antalet molekylära tester som utförs på humant genomiskt DNA, är det primära målet av nukleinsyra extraktion från helblod för att producera kontamineringsfri, högmolekylär DNA vikt genomisk. Den automatiserade protokoll för 96 prover är avslutat inom en timme, vilket är en förbättring jämfört med andra automatiserade system (t.ex. Promega MagneSil = 90 min och Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx system = 2,5 h). Fig. 6A visar de UV / Vis-absorbans-profiler för 45 positiva blodprov behandlas samtidigt med 45 reagens ämnena på Hamilton STAR-protokollet, med en genomsnittlig A
Realtid resultat från åtta replikatprover av ett poolat maternal plasmaprov bearbetats med stor volym TruTip förfarande visas i figur 7. Det kompletta protokollet (inklusive off-line proteinas K inkubation) är klar i ca 2,5 timmar, liknande den Qiagen manuell Cirkulerande NucleicAcids Kit (inga jämförbara automatiserade utsugskåpor finns ännu tillgängliga). De genomsnittliga C t-värden över alla replikat är 34.58 ± 0,66 och 29,76 ± 0,50 för fostrets manliga (CHY) och total (CH1) DNA, respektive, som visar utmärkt repeterbarhet automatiserad extraktion metoden. Koncentrationen av fetalt DNA i den totala DNA-poolen (i genomekvivalenter), beräknas baserat på passform punktanalys jämförelse med standarder, med den resulterande genomsnittliga% fetalt DNA i alla prover av 2,8%. Själva% fetalt DNA för detta prov är okänt eftersom proverna slogs samman innan du utför utvinning. Fetal DNA-kompositioneni icke-poolade plasmaprover extraherades med användning av TruTip metod är typiskt 1,5-faldigt högre jämfört med resultat med en Qiagen Cirkulerande Nucleic Acids Kit (ej visad).
Figur 1. Den TruTip extraktion och arbetsflöde, oavsett vätskehanteringssystem. Annan provberedning eller flytande steg hantering kan införlivas i automatiserade rutiner beroende på egenskaperna hos den specifika vätskehantering instrument och mjukvara.
Figur 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 provplattan layout. (B) Arrangemang av reagens / Consumaker på arbetsbordet. Provplattan kan konfigureras för upp till 24 prover (kolumnerna 1, 5 respektive 9), även om epMotion kommer endast behandla maximalt 8 prover samtidigt. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Hamilton STAR däck layout för rening av genomiskt DNA från helblod (ej skalenlig) Deck Position 1 = Hamilton 1 ml filtrerade tips,. 2 = Hamilton 1 ml ofiltrerade tips, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; fyra = Ingång blodprov bärare (blodprovtagningsrör eller rör mikrorör), 5-9 = 290 ml reagens dalar för Lyseringsbuffert F, Etanol, Wash Buffer J, Wash Buffer K och Elution Buffer A2, respektive, 10 = 96 dEEP väl Bindande plattan, 11 = 96 djup brunn Tvätta J, 12 = 96 djup brunn Tvätta K, 13 = 96 djup brunn Elution plattan, 14 = Hamilton HHS2 värmare / shaker med Nunc 96 djup brunn inkubationsplatta, 15 = 50 ml reagens tråg innehållande proteinas K. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Hamilton STARplus däckslayouten för rening av DNA från stora prover volym plasma (ej i skala). Systemet är utrustat med 8 x 5 ml kanaler och 8 x 1 ml kanaler (ej visad i däckslayout). Deck Position 1 = Hamilton 4 ml filtrerade tips, 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips, 3 = källplasma prov, 4 = 50 ml koniska rör, 5 = 120 ml reagens tråg innehållande CN-W1, CN-W2 och CN-W4 Reagents, 6 = låg volym reagens tråg innehållande proteinas K, CN-B2, CN-B3, EBA2, ebb och CN-W3 reagenser, 7 = 290 ml reagens tråg innehållande CN-L1 reagens, 8 = 290 ml reagens tråg innehållande CN -B1 reagens, 9 = 96 djupa brunnar för Steg 1, 10 = 96 djupa brunnar för Steg 2, 11 = provets bärare för renad, slutprodukten, 12 = Hamilton 1 ml ofiltrerade tips, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. (A). Real-time PCR-resultat från automatiserad TruTip utvinning av influensavirus lagt in nasofarynxaspirat (NPA). Ingång NPA volym = 100 | il, elueringsvolym = 50 | il. Resultaten är medelvärdet av tre replikat extractions från 5 olika NPA bakgrunder (n = 15) per utspädning nivå och influensa mål. qPCR utfördes på LightCycler 480-systemet med analysbetingelserna beskrivits tidigare 15. (B) Nej korskontaminering detekteras när 12 positiva NPA prov varvas med utan strängar och som omfattas av automatiserad extraktion förfarandet. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Resultat av humant genom DNA-extraktion från helblod. A) UV-synliga spår från en NanoDrop 1000 (ThermoFisher) från 10 slumpvis utvalda replikat. B) 1% agarosgel av TruTip renat gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Raderna 1 - 4 = ~ 100 ng renat gDNA från fyra slumpmässigt utvalda replikat. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Real-time PCR-resultat från åtta replikat TruTip extraktioner av fritt cirkulerande DNA från plasma. Prover betecknade med asterisk (* eller **) extraherades på separata dagar. CHY kvantifierar manligt foster-DNA och CH1 kvantifierar total DNA närvarande (fetal och maternell). qPCR utfördes på en LightCycler 480-systemet (Roche) med tidigare publicerade analyser inriktade CHY och CH1 18.
Discussion
Enkelheten i TruTip konceptet och arbetsflöde (figur 1) gör det lätt anpassas, automatiserat och effektivt för ett antal kliniska provmatriser, input volymer prov och flytande hanteringssystem. Det bör dock vara medveten om att varje kliniskt prov är unik och kommer att variera en till nästa viskositet, partiklar, slem, ytkontaminanter, mikrobiella och / eller genetiska bakgrunder. Med tanke på förväntade variationer i kliniskt prov sammansättning och avsedd användning av ett automatiserat TruTip provberedning protokoll, kan det därför vara nödvändigt att ändra vissa steg i en TruTip förfarande för att uppnå önskat resultat för en viss typ av prov. Oavsett vilken provtyp, dock TruTip parametrar som typiskt sett har den mest betydande inverkan på nukleinsyra renhet och / eller återvinning inkluderar:
- Prov blandning och homogenisering med lysbuffert (med alkohol). Medan TruTips har en relatively stor porstorlek, prov homogenisering och kondensering är mycket viktigt för effektiv cellys och framtida bindande steg till TruTip monolit. Med en homogen och väl flytande lysat, kan proverna gå igenom TruTip med högre flöden, vilket minskar den totala tiden prov behandling. Den stora volymen plasma protokoll visar potentialen för användare att noggrant homogenisera och vätskeform svåra prov (on-line eller off-line), trots den stora ingången provvolym.
- Flödeshastigheter. Långsammare Flödeshastighetema under nukleinsyrabindande eller eluering resulterar typiskt i högre nukleinsyra-utbyten, om än på bekostnad av den totala behandlingstiden. Långsammare flödeshastigheter kan också minska graden av DNA-klippning.
- Cycle nummer. Det optimala antalet för aspiration och dispensera cykler är beroende provtyp, totala provvolymen, och provsystemet. Steg 1 i figur 1 är typiskt den punkt vid vilken cykel numbers (och flöden) kan kräva viss empirisk optimering, med prover såsom nasofarynxaspirat (Figur 5) som företräder en av de mer utmanande lysates att optimera på utbudet av NPA viskositeter från olika patienter.
- Torkning. Fullständig torkning av TruTip monoliten är absolut nödvändigt för att förhindra kvarvarande organiska lösningsmedel från eluerar samtidigt med det renade nukleinsyraprovet och inhiberande nedströmsprocesser eller tester. Eftersom TruTip inte torkas via centrifugering eller vakuumfiltrering, är det viktigt att maximera både flödeshastigheten och siffror cykel under torkningssteget. Ibland finns det en kvarvarande droppe av tvättlösning på ändstationen av TruTip efter torkprogram är klara. The Hamilton roboten har förmågan att utföra en "tips touch" på sidan av brunnen för att frigöra droppen, och därmed säkerställa en lösningsmedelsfri eluering. Den epMotion Systemet har inte denna funktion, men en försköljning av TruTip ändstationen i elmepannor buffert kan programmeras för att uppnå samma effekt.
Eftersom geometrin, pipett spets material och fästmetod till robotic kanal armarna är unika för varje instrument tillverkare, är en annan TruTip konstruktion krävs för varje vätskehanteringssystem. De TruTip monolithögtalare dimensioner (diameter, tjocklek och porstorlek) korrelerar med nukleinsyra bindningskapacitet (och eluerings-effektivitet), är som väntat för en fast-fas extraktionsteknik. Medan tjocka (> 4 mm) matriser kan bäddas in i en 1 ml TruTip att öka nukleinsyra bindningskapacitet för stora volymer prover och / eller utjämna bindningskapaciteten över specifika TruTip format, finns det en kompromiss mellan TruTip tjocklek och flödeshastigheter under det initiala bindningssteget (i närvaro av råa lysat). Därför är det ibland fördelaktigt att bädda större diameter monoliter i större volymer pipettspetsar för de första stegen i en automatiserad protokoll (t.ex. </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips för stora volymer extraktioner). Med tanke på de särskilda TruTip konfigurationer dikteras av tillverkarna av vätskehanteringsinstallationer robotar, men vi behöver inte nödvändigtvis förvänta TruTip nukleinsyra avkastningen att vara identiska över vätskehanteringsinstallationer plattformar från olika tillverkare, eller mellan olika TruTip storlekar.
Kliniska prov (per definition) kommer att innehålla betydande mängder av humant genom DNA om de inte förvärvats från vanligtvis steril platser (t.ex. cerebrospinalvätska). Ibland humant genom-DNA önskas (såsom i fig. 6), medan i andra tillämpningar det humana DNA: t representerar en oönskad genomiska bakgrunden (som för figur 5). Närvaron av bakgrunds-DNA är vanligtvis inte problematisk, så länge som den totala mängden nukleinsyra i provet inte överstiger bindningskapaciteten av monoliten, och bakgrunds-DNA kan fungera som bärare om den önskade målnukleinsyransyra är närvarande i spårmängder. Syftet med stora volymer plasmaextraktion protokollet (Figur 7) är att isolera (fragmenterad) fetalt DNA i närvaro av en 10 till 20-faldigt överskott av moderns DNA, som liknar den provberedning målet för infektionssjukdomar tester med undantag för att sekvenserna är mycket kongruenta och kan bara särskiljas genom mycket specifika molekylära tester och / eller storlek diskriminering. I detta fall kommer de sammanlagda cirkulerande DNA isolerat med användning av en 5 ml TruTip, och efterföljande hög-molekylära och låg molekylvikt fetalt DNA separeras genom efterföljande bindning och eluering till en 1 ml TruTip genom att förändra bindande buffertbetingelser. Selektiv storleksseparation och anrikning av målnukleinsyror som baseras på deras bindning och egenskaper elueringsbetingelser till en kiseldioxid monolit är en väsentligt annorlunda verkningssätt än uppnås med membran eller storleksuteslutande kolumner spin. Size separation och anrikning av mikrobiellt DNA från humant genom-DNA kan vara enccomplished i framtida tillämpningar via anpassa TruTip bindande och buffertar elueringstider.
De automatiserade protokoll visade här betona nyttan av TruTip monolit sig för bearbetning olika kliniska prover, och hur den kan anpassas för stora volymer och specifika flytande robotar hantering. De strömlinjeformade metoder resulterar typiskt i snabbare extraktion protokoll jämfört med andra automatiserade system. Enkelheten i TruTip teknik, men också ger vissa kostnadsfördelar för dem som är intresserade av att köpa en ny, automatiserad nukleinsyra systemet surt rening, eftersom den primära hårdvara som krävs för att automatisera TruTip förfaranden är pipetten kanalen armen själv snarare än magnetiska stavar, vakuumsystem , eller ombord centrifuger. Använda förfyllda reagens plattor kan också minska utrymme och nödvändiga förbrukningsvaror, och fördubbla genomströmningen per körning. Minimera däck utrymme med TruTip protokoll också möjliggör avancerade användare att integrera uppströms eller downstream automatiserade processer med TruTip. Till exempel Hamiltons easyBlood lösning för fraktionering helblod kan införlivas med den automatiserade TruTip extraktion metod, vilket avsevärt skulle effektivisera bio-banking processer. Post-extraktion processer såsom nukleinsyra kvantifiering, normalisering, PCR set-up, eller DNA-sekvensering är också lätt integreras med TruTip på de större plattformarna vätskehantering.
Disclosures
Författarna är anställda i Akonni Biosystems, Inc. som producerar material som används i den här artikeln.
Fri tillgång och produktion av denna artikel är sponsrad av Akonni Biosystems, Inc.
Acknowledgments
Delar av detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) enligt bidragsavtal R 44 AI072784. Vi tackar Dr Kirsten St George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson och Amy dekanus för laboratoriet för virussjukdomar, Wadsworth Center, New York State Dept of Health för kvantifierade influensavirioner och tillgång till kliniskt validerade influensa realtid PCR-analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) |  Akonni Biosystems, Inc. |
300-11120 | |
| 95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| 99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
| DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
| Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
| Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
| epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
| Equipment | |||
| epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
| Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
| Reservoir rack | 960002148 | ||
| Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
| Reagent/Material | |||
| TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. |
300-20341 | |
| 95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
| 1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
| 1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
| 50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
| Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
| Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
| Equipment | |||
| Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
| 1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
| 1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
| Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
| Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
| Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
| Reagent/Material | |||
| TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. |
Call to inquire | |
| 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
| Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
| Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
| Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
| Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
| 96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
| 50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
| 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| 120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
| Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
| Equipment | |||
| STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
| 1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
| 5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
| Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| 120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
| Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| 50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
| 24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
| 32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
| Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. | |||
References
- Boom, R., Sol, C. J. A., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Baker, M. P., Mitchell, A., et al. Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology. BioTechniques. 31, 142-145 (2001).
- Sinclair, B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. The Scientist. 12, 17-24 (1998).
- Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl. Acids Res. 30, e32 (2002).
- Levison, P. R., Badger, S. E., et al. Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification. J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).
- Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment. Vox Sang. 89, 71-76 (2005).
- Perelle, S., Cavellini, L., et al. Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water. J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).
- Riemann, K., Adamzik, M., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).
- Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids. J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).
- Kessler, H., Mühlbauer, G. Fully automated nucleic acid extraction. MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).
- Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing. Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).
- Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).
- Kruhøffer, M., Voss, T., et al. Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications. J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).
- Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. Belgrader, P. , US7759112 (2010).
- Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples. J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).
- Chan, K. H., Lai, S. T., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1). J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).
- Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A. subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).
- Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).
