In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

Summary

Med sin lilla transparent kropp väldokumenterad neuroanatomi och en mängd mottagliga genetiska tekniker och reagens,

Abstract

Den nematod mask C. elegans är en idealisk modell organism för relativt enkla, billiga neuronal avbildning in vivo. Dess små genomskinlig kropp och enkla, gör väl karakteriserade nervsystemet identifiering och fluorescens avbildning av en neuron i det intakta djuret. Enkla immobiliseringstekniker med minimal påverkan på djurets fysiologi tillåter längre tid-lapse avbildning. Utvecklingen av genetiskt kodade kalcium känsliga fluoroforer som cameleon ¹ och GCaMP ² tillåter in vivo avbildning av neuronala kalcium om både cell-fysiologi och nervaktivitet. Talrika transgena stammar som uttrycker dessa fluoroforer i specifika neuroner är lätt tillgängliga eller kan konstrueras med användning av väletablerade tekniker. Här beskriver vi detaljerade förfaranden för att mäta kalcium dynamik i en enda neuron in vivo med både GCaMP och cameleon. Vi diskuterar fördelar och disadvantåldrar såväl samt olika metoder för provberedning (djur immobilisering) och bildanalys. Slutligen, presenterar vi resultaten från två experiment: 1) Använda GCaMP att mäta sensoriska svaret hos en särskild neuron till en extern elektrisk fält och 2) Använda cameleon att mäta den fysiologiska kalcium svaret hos en neuron till traumatisk laserskada. Kalcium avbildningstekniker som dessa används i stor utsträckning i C. elegans och har utvidgats till att mätningar i fritt rörliga djur, flera neuroner samtidigt och jämförelse mellan genetisk bakgrund. C. elegans presenterar ett robust och flexibelt system för in vivo neuronala avbildning med fördelar jämfört med andra modellsystem i teknisk enkelhet och kostnad.

Introduction

Här presenterar vi praktiska metoder för in vivo-kalcium avbildning i C. elegans nervceller. Utvecklingen av genetiskt kodade kalcium-känsliga fluoroforer med högt signal-till-brus-förhållande gör C. Elegans en jämförelsevis okomplicerad och kostnadseffektivt system för mätning av neurofysiologi och aktivitet. Vår avbildning görs med en vanlig förening mikroskop med brett fält fluorescens avbildning av allmänt tillgängliga fluoroforer. Vi presenterar flera tekniker som utnyttjar olika fluoroforer och olika preparat prov, diskutera styrkor och svagheter för varje. Data presenteras sedan från två exempel experiment. En utmärkt extra resurs på de tekniker som beskrivs här kan hittas i WormBook, "Imaging aktiviteten hos nervceller och muskler" av R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Två huvudklasser av genetiskttiskt kodade fluorescerande kalcium reportrar används ofta i C. elegans: en kanal GCaMP och FRET-baserade cameleon. Vi kommer att beskriva metoder och visa exempel på data som genereras av varje.

GCaMP baseras på en modifierad grönt fluorescerande protein (GFP) som är känslig för omgivande kalciumkoncentrationen. Detta åstadkommes genom fusion av GFP och den höga kalcium affinitetsprotein kalmodulin, så att bindningen av kalcium från kalmodulin bringar GFP molekylen till en effektiv fluorescerande bekräftelse ^2. De senaste framstegen inom dessa fluoroforer genererar exceptionell signal storlek med upp till 500% ökning i fluorescensintensitet över ett fysiologiskt område av kalciumnivåer och rimligt snabb kinetik ~ 95 ms stigtid och ~ 650 ms avklingningstid ^4. Under relativt korta tidsperioder (min), kan dessa stora signaler möjliggöra lägre upplösning avbildning (lägre förstoring) och med tanke på en väluppfostrad initIAL referensnivåberäkning, förneka behovet av kontinuerlig baslinje eller jämförande mätningar.

Cameleon har fördelen av att vara en FRET-baserad fluorofor som genererar en ratiometrisk mätning jämför två oberoende kanaler eller våglängder ^1. Den består av två separata fluoroforer (cyan-och gul-utsläpp fluorescerande proteiner, GFP och YFP) länkade med en calmodulin protein. Komplexet belyses med blått ljus (440 nm) som väcker den gemensamma fiskeripolitiken. Bindning av kalcium ger fluoroforerna närmare varandra, ökar fluorescens resonansenergiöverföring (FRET) från GFP (donator) till YFP (acceptom) och bringar GFP emissionen (480 nm) för att minska och YFP emissionen (535 nm) för att öka . Relativa kalciumnivåer mäts som förhållandet mellan YFP / fiskeripolitiken intensitet. Cameleon kinetik är långsammare än GCaMP, mätt in vivo för att ha en stigtid på ~ 1 sek och en avklingningstid av ~ 3 sekunder ^5. Emellertidförhållandet av motsatt rörliga signaler ökar signal storlek och kompenserar för ett antal möjliga artefakter på grund av förändringar i fluorofor koncentration, rörelse eller fokus drift och blekning.

Genetiskt kodade fluorescerande reportrar förnekar mycket av provberedning krävs med exogent administrerade sonder och C. elegans liten genomskinlig kropp tillåter avbildning inom den intakta djuret med enkla brett fält fluorescens. Den viktigaste tekniska utmaningen i provberedningen är därför att på ett säkert sätt immobilisera djuren. Det finns ett antal olika vanliga tekniker vardera fördelar och nackdelar. Med hjälp av en farmakologiskt medel att förlama djuren är enkel att implementera och tillåter montering av flera djur på en beredning (Levamisol, en kolinerg agonist som orsakar muskelvävnaden att gripa används typiskt ^6). C. elegans kan också fysiskt immobiliseras genom att montera dempå hård 10% agaros ^{7, 8.} Detta minimerar inverkan på djurens fysiologi, medger en långsiktig avbildning (timmar) och återvinning av flera djur men är mer tekniskt svårt. Båda dessa tekniker begränsar fysisk tillgång till djuren (som är under ett täckglas) och kan därför bara användas med vissa experimentella stimuli (t.ex. ljus, temperatur, elektriskt fält eller laser skada). För stimuli där fysisk åtkomst krävs, såsom beröring eller administration av kemikalier, har många studier limmade framgångsrikt C. elegans på plats (med hjälp veterinär klass lim) ^9. Detta är tekniskt mer utmanande, är ett enda djur förberedelse och tillåter inte djur återhämtning. Slutligen har många mikrofluidikanordningar använts som fysiskt hindra C. elegans, kan bevara djurens fysiologi, vilket exponering för de flesta typer av stimuli (beroende på enheten design) och möjliggöra snabbt utbyte och återvinning av djuren

De metoder som presenteras här kan användas för att mäta neuronal aktivitet och cellfysiologi i C. elegans. Vi ger ett exempel på varje: med GCaMP att mäta den sensoriska svar ASJ neuron till en extern elektriskt fält, och använder cameleon för att mäta den fysiologiska kalcium svaret på laserskada av en neuron. Dessa exempel visar fördelarna och nackdelarna med de två typerna av fluoroforer och illustrerar vad som är möjligt med systemet.

Protocol

1. Optisk inställning

1. Använd en vanlig förening mikroskop med epifluorescens bildfunktioner. Vi använder en Nikon Eclipse Ti-U inverterat mikroskop med en Intensilight HG Illuminator.
2. För bästa bild-och signalkvalitet använda hög förstoring, hög numerisk apertur mål. Vi använder vanligtvis en Nikon X60 1,4 NA oljeimmersionsobjektivet. I vissa fall är det möjligt att använda lägre förstoring (X40, X20) beroende på expressionsnivån av fluoroforen och signalstyrkan.
3. Använd en hög känslighet kyld CCD-kamera, t.ex. en Andor Clara kameran för att maximera bild känslighet och minimera bakgrundsljud.
4. För enfärgade fluoroforer använder standardfilter mikroskop fluorescens som utformats för den särskilda våglängd fluoroforen. För GCaMP använd en standard GFP-filter som optimerats för excitation vid 488 nm och emission vid 525 nm. Inga ytterligare optiska modifieringar krävs.
figur 1. Den består av:
1. Ett mikroskop filter set med 440 ± 20 nm excitationsfilter och 455 nm passerar länge dikroisk spegel.
2. En bild mask placerad vid den första bildplanet omedelbart utanför mikroskop imaging-porten (där kameran CCD-sensorn vanligtvis skulle sitta). Detta begränsar synfältet så att det kommer att fylla endast hälften av kamerasensorn. Placera denna mask på de första resultaten bildplan i skarp bild gränser och inga överlappande när de två bilderna projiceras sida-vid-sida.
3. Den första relälins in en brännvidd från than initialt bildplan så att det kollimerar ljuset.
4. En dikroisk spegel som delar ljuset i de två separata imaging våglängder eller kanaler återspeglar en färg (> 515 nm, gul) under sändning den andra (<515 nm, cyan).
5. Emissionsfilter (bandpassfilter) ytterligare begränsar det överförda ljuset till den specifika våglängderna imaging (cyan vid 485 ± 40 nm och gult vid 535 ± 30 nm),
6. Det andra reläet linser (en för varje kanal) placeras i strålbanorna så att den inriktningen på ljuset till ett andra bildplan på CCD-kameran.
7. Ett par av speglar och en andra dikroisk spegel riktar strålen banor så att de två bilderna rekombineras och projiceras sida vid sida på kamerans CCD-sensor. Figur 4A visar ett exempel på den resulterande bilden.
5. Initial optisk inriktning: Initiera installation och anpassning av optiken med hög kontrast image med en låg förstoring lins och sänds breda fält ljus belysning (en svart Sharpie ritas på ett objektglas fungerar bra). Ta bilden att fokusera genom mikroskopet okularen och sedan bytte till mikroskopet port som ska användas. Med hög ljus belysning visa bilden på ett index kort på den första fokalplanet (några cm utanför mikroskopet porten). Placera den första relälinsen (C) i strålgången, så att den är en fokalavstånd från den initiala fokalplanet och kollimerar ljuset utan avböjning av strålgången (dvs. är direkt centrerad i strålgången). Placera masken vid den första fokalplanet, justeras för att begränsa halv synfältet och ger en skarp gränslinje i bilden. Placera speglarna och filter (D, E, G) så att strålbanan förblir parallell med bordsytan och löper i två parallella banor sida vid sida, såsom visas i figur 1B. Center den andra relä objektiv (F) i sina respektive balk vägar ochflytta dem fram och tillbaka längs stigarna för att få bilderna till en fokusering på ett index kort placeras var kameran CCD-sensorn kommer att bli. Om gjort rätt de två bilderna ska vara parfocal med mikroskopet okularen och andra hamnar kamera. Slutligen placera kameran på plats och finjustera inriktningen.
6. Finjustering Optisk Justering: Använd den dubbla bilden ses av CCD-kameran för att finjustera den optiska inriktningen. Använd en bild med hög kontrast och börja med lägre förstoring, byte till högre förstoring för slutlig justering. Placera den överförda bilden (cyan-kanal i fig. 1B) för att täcka hälften av kamerans synfält genom att flytta kameran i X och Y. Placera reflekterade bilden (gul kanal i Figur 1B) för att täcka den andra halvan av området visa genom att justera de sista två speglar (G) i strålgången. Optimera fokus genom att flytta den andra relälinsen för varje kanal och tillbaka längs med strålbanan. Om den lämnasoförändrad den optiska installationen ska vara stabil och endast kräver sällsynt finjustera justering.

2. Provberedning och datainsamling.

1. Förvärva djur som uttrycker en kalciumkänsligt fluorofor i neuronen intresse från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) eller andra källor. Alternativt transgena djur kan konstrueras med användning av standard C. elegans tekniker. Enda cell uttrycket är inte nödvändigt (och ibland inte önskvärt om flera nervceller ska utredas, se ^12), så länge som bilder och mätningar från flera celler kan lätt separeras. Om fluoroforen transgenen inte är integrerad i genomet, kan betydande variation i uttryck ske från djur till djur. I detta fall, förval djur med högre expressionsnivåer med en fluorescerande dissektionsmikroskop ökar signal-till-brus-förhållande och förbättrar mätningarna. Fluoroforenhetema expressionsnivåer need är tillräcklig för att lätt avbildas med kameran under ackvisitionsparametrar krävs av experimentet.
2. Gör agarosen kuddar som krävs för den önskade immobiliseringen tekniken (se nedan 2,3) genom att trycka på en liten droppe av smält agaros mellan två glasskivor åtskilda av två bitar av laboratorie tejp. Om nödvändigt, kan agaros kuddar överföras till en täckglas före montering djuren. Se figur 2.
3. Immobilisera C. elegans för avbildning med en av följande tekniker:
   1. Farmakologisk lamslås: Lägg 0,05% Levamisol till 2% agaros kuddar (blanda det i den smälta agarosen innan dynorna i 2,2). Plocka 5-10 djur på kudden och täck med ett täckglas. Applicera små mängder varmt vax blandning (50% paraffinvax och 50% vaselin) till hörn täckglaset för att hålla den i läge. Låt 5-10 min för Levamisol att träda i kraft och djuren att become helt stilla.
   2. Styv Agarose immobilisering: C. elegans kan vara fysiskt immobiliseras med styva 10% agaros kuddar och 0,05 um diameter nanopartiklar polystyren. Gör 10% agaros kuddar (10% agaros i NGM buffert vikt) som i 2,2. Lägg ~ 3 pl pärlor lösning (1:10 polystyren mikrosfärer i NGM volym) till toppen av dynan. Snabbt, plocka 5-10 C. elegans i den pool av pärla lösning på plattan och försiktigt täcka med ett täckglas. Använd smält vax appliceras på hörn täckglaset för att hålla den i läge. (För ytterligare information om denna teknik ser ⁷ samt en tidigare JUPITER artikel ⁸⁾
   3. Limning: C. elegans kan limmas på plats med användning av små mängder av veterinärmedicinska adhesiv anbringas på ena sidan av djuret.
   4. Mikroflödessystem enheter: har många mikroflödessystem enheter har utformats för att fysiskt hålla C. elegans på plats för avbildning.
   </ Li>
4. Placera den förberedda bilden på mikroskopet och fokusera på det önskade neuron. Det är ofta enklast att hitta C. elegans med ljust fält belysning och låg förstoring. Sedan byta till hög förstoring och fluorescens avbildning att hitta och fokusera på det specifika neuron.
5. Stimulus: Om en neuronal svar på en specifik stimulus önskas (ljus, elektriska fält, smak och lukt ledtrådar, temperatur etc) måste stimulans apparaten utformas i mikroskop setup, så att det kan ges till djuren i provberedning medan avbildning.
6. Acquire bilder med mikroskop CCD-kamera. Exponeringstider och excitationsljus nivå kommer att bero på baslinjen signalen och expressionsnivå av fluoroforen, med svagare signaler kräver längre exponeringstider med concordantly mindre tidsupplösning. Vi använder typiskt ~ 300 ms exponeringstider.
7. Hämta bilder antingen individuellt eller som en time-lapse film. Eftersom C. elegans nervceller i allmänhet uppvisar långsamma aktivering dynamik (dvs. de saknar natrium-baserade aktionspotentialer), relativt långsamma frame rates i ~ 1 sek är ofta tillräckligt för att mäta neuron dynamik. Förvärv på upp till ~ 90 bilder per sekund har använts även om dessa kan begränsas genom integrationen tid som behövs för svag fluorescens. Individuella filmer på en enda neuron kan lätt sträcka sig flera minuter (~ 5-10 minuter) eller längre om immobiliseringen Preparatet är stabilt och bildhastighet relativt långsam.

3. Dataanalys

1. Det finns ett antal olika fluorescerande paket bildhanteringsprogramvara finns med dynamiska och ratiometrisk analysfunktioner inklusive ImageJ och NIS-element. Vi använder en enkel anpassad MATLAB-program som mäter den genomsnittliga fluorescerande signalen över en vald region av intresse.
2. För enskilda bilder (eller tidsförlopp filmer som finns kvarhelt stilla) Välj en region av intresse (ROI) inom avbildade neuron och en separat närliggande område för bakgrunden mätning. För kvotmetriska bilder väljer samma ROI och regioner bakgrund för varje dubbla bilder.
3. Liten rörelse av avbildade neuron inom en time-lapse film kräver ytterligare analys för att automatiskt välja ROI i varje ram, vilket kan åstadkommas med hjälp talrika system objektspårning. Vårt program visar en komprimerad bild av alla bilder i filmen som en grov gräns (som omfattar föremål av andelar i alla ramar) är manuellt valda och en oberoende bakgrund som valts. För den första ramen, är en ROI manuellt inifrån gränsområdet. För varje efterföljande ram väljer programmet de ljusaste pixlarna inifrån gränsområdet för att generera en avkastning av rätt storlek (dvs. samma antal pixlar som den manuella första bilden ROI). För bilder där målt intressen är tillräckligt ljusare då den omgivande bakgrunden inom gränsområdet detta protokoll väljer en rimlig avkastning på investeringen för varje bildruta.
4. Den fluorescerande signal, F, för varje ram beräknas som den genomsnittliga pixelintensiteten i ROI minus medelintensiteten i bakgrunden regionen. Ratiometrisk värden beräknas som förhållandet mellan de två signalerna (YFP-YFP _bakgrund) / (GFP-GFP _bakgrund) -0,65. Faktorn 0,65 kompenserar för blödning genom av GFP kanalen i YFP-kanalen, som kommer att vara beroende på fluoroforer samt det speciella filtret uppsättningen används (detta värde är typiskt ~ 0,6 för cameleon konfigurationer).
5. Den relativa kalcium nivån för varje ram beräknas som den procentuella förändringen i intensitet normaliserad till ett initialt baslinjevärdet mätt från den första ramen (eller serie av ramar): AF / F = (F _(t)-Fo) / _Fq, där F (t) är fluorescensen vid tiden t och _Fqär det initiala utgångsvärdet.
6. En ROI välja cellkroppen genererar de starkaste mest robusta signaler men det är också möjligt att välja och mäta signaler från en ROI längs nerven processerna.

4. Problemlösning

1. Blekning: Exponering för excitation ljus kan orsaka blekning av fluoroforen och präglas av en stadig minskning av signal som är beroende av exponeringsnivåer. Ratiometrisk mätningar bidra till att kompensera för detta. Men selektiv blekning av en våglängd fortfarande kan förekomma (typiskt gemensamma fiskeripolitiken blekmedel snabbare sedan YFP). Om blekning inträffar minskar ljuset exponeringsnivån genom att minska exponeringstider och / eller excitation intensitet (med neutrala täthetsfilter i belysningen vägen). Om nödvändigt, kan en kompensera för blekning genom att köra skenrättegångar (med samma exciterings exponering men ingen neuronala stimuli) och kvantifiera tidskonstanten hos signalen förfall.
2. C.. elegans svara på ljusexponering och experimentella stimuli, vilket gör dem mest sannolikt att röra vid inspelningen. Liten rörelse kan införa betydande brus i mätningen, särskilt vid mätning av axon processer. Ratiometrisk analys hjälper till att mildra dessa effekter i viss utsträckning och mätningar från cellkroppen är mer robusta. Noggrann utförande och förfining av immobilisering förfarandena kommer att resultera i helt stilla djur.
3. Bakgrund Urval: noggrant välja en bakgrund regionen är en nödvändighet för en framgångsrik bildanalys. Bakgrund regioner bör vara av någorlunda enhetlig och mörkare än det avbildade neuron. Det måste vara tillräckligt avlägsnas för att undvika spritt ljus (och därmed pickup en signal) från det bildförsedda neuronen. Vi hittar en enhetlig region 20-50 um från ROI fungerar bra i de flesta fall.
4. Ratiometrisk Optik: Korrekt inriktning av avbildande optik är kritisk för att generera en klar dubbel bild. Kommersiella mikroskop fästen för ratiometrisk avbildning finns. En alternativ teknik är att använda en snabb sekventiell avbildning med en snabb filterhjul att snabbt växla mellan emissionsvåglängder under inspelning separata bilder för varje.
5. Ratiometrisk analys: Analysen beskriven här är en relativt enkel teknik som genererar robusta signaler genom medelvärdesbildning över en ROI. Det kräver en tydlig och ljust objekt att välja ROI. Mer sofistikerade ratiometrisk analys är möjlig genom att exakt anpassa och kartlägga de dubbla bilderna så att den fluorescerande förhållandet kan beräknas pixel för pixel.

Representative Results

Här presenterar vi resultaten från två separata experiment. Den första utnyttjar GCaMP att mäta svaret hos en särskild sensorisk neuron till en definierad yttre stimulans, vilket ger ett bra exempel på hur fluorescerande kalcium reportrar kan användas för att optiskt övervaka neuronal aktivitet i intakt C. elegans. Den andra använder cameleon att mäta intracellulärt kalcium övergående visas inom en neuron som svar på specifika laserskada, vilket visar hur kalcium fysiologi kan mätas inom en enda cell in vivo. Att fokusera på de tekniska aspekterna av varje mätning enskilda studieresultat presenteras och diskuteras i detalj. Ofta genomsnittliga responsen över tid (beräknat som den genomsnittliga responsen vid varje tidpunkt med avseende på stimulus) eller en specifik mått (såsom den genomsnittliga amplituden för responsen) beräknas över flera försök. Normalt 10-20 försök är nödvändiga för att generera en acceptabel genomsnittlig mätning men thans nummer beror i den inneboende variabilitet i svaret. Sådana dataanalys för experimenten diskuteras här kan hittas i ¹² och ^13.

GCaMP mätning av sensorisk respons: när de utsätts för stark yttre elektriskt fält (≥ 3 V / cm), C. elegans krypa aktivt mot den negativa polen av fältet med exakt riktad rörelse. Vi visade tidigare att den här electrotactic beteende primärt medieras av de vänstra och högra ASJ neuroner, amphid sensoriska neuroner är belägna i djurets huvud ^12. För att visualisera detta svar använde vi en transgen stam uttrycker GCaMP3 särskilt i vänster och höger ASJ nervceller under GPA-9-promotor. Vi immobiliserade djur för avbildning med agaros kuddar innehållande 0,05% Levamisol inklämt mellan två täckglas (såsom beskrivs i förfarandena). Den elektriska stimulansen administrerades med en specialbyggd avbildning kammare som passar påskede av ett inverterat Nikon Ti mikroskop (se ^12). I korthet, är täckglas preparatet placeras (med masken nedåt) över ett hål i en liten plast kammare som medger tillträde för målen underifrån och standard avbildning genom täckglaset. Kammaren fylldes med 0,25 mM NaCl och 50 mM glycerol-buffert och det elektriska fältet stimulans appliceras med två platinaelektroder kantar ändar av kammaren. Såsom beskrivits ovan, en enda neuron ASJ uttryckande CGaMP avbildades med användning av en X100 1,4 NA oljeimmersionsobjektivet och standard GFP filteruppsättning. En time-lapse film förvärvades för 80 sek (1 bild / sek, 300 ms exponeringstid), samtidigt utsätta djuret till en extern 3 V / cm elektriskt fält för tre separata försök var varar 10 sek (figur 3). Mätte vi fluorescensintensiteten vid cellkroppen med bildanalys som beskrivits ovan. Videon visar smärre fel av både rörelse och fokus driver under loppet av experimentet. STrength av GCaMP signalen fortsatt stark men visar stor ~ 250% ökning av fluorescens som svar på både ^1: a och ^{3: e} stimuli. Resultatet från den andra stimuli reduceras väsentligt visar variabilitet i neuronala svar. Blekning är minimal eftersom framgår av återgången till en jämn baslinjenivå.

Cameleon mätning av cellulär kalcium fysiologi: Traumatisk cellulär skada utlöser en stor kalcium övergående inom en neuron som spelar en väsentlig roll i den fysiologiska responsen dikterar cellulär öde (dvs. celldöd vs initiering av reparationsprocesser). Vi kan mäta denna skada-inducerad respons in vivo med hjälp av en femtosecond laser för att bryta individuella C. elegans neuroner ¹⁴ samtidigt mäter cellulära kalcium signaler med hjälp cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Djur som uttrycker cameleon YC3.60 i de sex mechanosensory neuroner (enligtmec-4-promotorn), immobiliserades med användning 10% agaros och polystyren nanopartiklar som beskrivs i förfarandena. Vi anställda dubbla avbildande optik för att spela in signaler från både den gemensamma fiskeripolitiken och YFP fluorescens-kanaler som beskrivs i förfarandena. Vi avbildas en enda ALM neuron och laser riktad axonet ~ 20 um från cellkroppen (Figur 4A). Axonet avskildes av en kort (<1 sek) exponering för ljus från en femtosecond pulsad infraröd laser fokuserad på målet punkt längs axonet av avbildning målet (se ¹³ för detaljer om laserkirurgi). Time-lapse bilder i en ram var 3 sek, med 400 msek exponeringstider registrerades för 320 sekunder när de utför laserkirurgi och kalciumnivåer beräknats med ratiometrisk analys.

Signaler mättes oberoende vid cellkroppen (fig. 4B) och för axonet segmentet inom 5 um från skärningspunkten (figur 4C). Siffrorna visar både CFP och YFP intensiteter samt resulterande FRET förhållandet. Mätningen vid cellkroppen är väluppfostrade med den gemensamma fiskeripolitiken snabbt minskande och YFP ökar som svar på laserskada vid t = 0 sekunder (röd pil). Detta resulterar i en omedelbar ~ 200% ökning i kvotmetriska signalen (AF / F), som varar i ~ 90 sekunder innan den föll tillbaka till nära baslinjenivåer. Blekning är minimal eftersom framgår av konsekvent baslinjen.

I axonet segmentet nära skärningspunkten, varierar den lokala mängden fluorofor under loppet av experimentet, komplicerar signalen. Laserkirurgi bryter axonet och kort spräcker membranet, vilket fluoroforen att fly och tillfälligt minska den lokala cytoplasmiska koncentration. Detta är uppenbart från en initial minskning i YFP spår i fig. 4C och en jämförelse av axonet segmentet nära skadan punkt i YFP bilderna vid tiderna t = 0 sekunder och t = 6 sekunder, Figur 4A. På later tidpunkter, sväller den avskurna änden som en del av dess fortsatta återhämtning, vilket resulterar i mer lokaliserad fluorofor och en ökning i intensitet. Detta är tydligast i långsamt ökande fiskeripolitiken spår i figur 4C och en jämförelse av axonet segmentet i den gemensamma fiskeripolitiken bilder ibland t = 0 sekunder och t = 270 sekunder, Figur 4A. Men dessa olikheter påverkar båda kanalerna lika och FRET förhållandet effektivt kompenserar. Den resulterande mätningen visar ett svar som liknar cellkroppen med en omedelbar ~ 150% ökning i signalen (AF / F), en dramatisk återhämtning till nära baslinjen vid ~ 90 sekunder och sedan en ytterligare mindre sekundära svaret på ~ 150 sek. Den kvotmetriska analysen är kritiskt för denna mätning, eftersom det skulle vara extremt svårt att separera kalcium-signalen från de andra effekter, som kan variera kraftigt från neuron till neuron och kirurgi till operation. Axonet signalen har mer brus än cellkroppen signalen främst på dimmer fluorescens ochden mindre ROI i den smalare axonet.

Figur 1. Grundläggande installation och kvotmetriska optik. A) Fotografiet visar den experimentella uppställningen består av ett inverterat mikroskop förening och kvotmetriska optik imaging. B) Ett schematiskt diagram som illustrerar avbildande optik som behövs för de kvotmetriska FRET-baserade mätningar. Bilden är uppdelad i de två våglängderna eller kanaler, vilka projiceras sida vid sida på CCD-uppställningen.

Figur 2. Provberedning. C. elegans är monterade på tunna agaros kuddar för avbildning. A) agaros kuddar tillverkas genom sandwich en liten droppesmält agaros mellan två mikroskopobjektglas åtskilda av två bitar av laboratorie tejp. B) Djur överförs på agaros dynan och täcktes med ett täckglas, som hölls på plats av en liten mängd vax vid vardera av de fyra hörnen.

Figur 3. GCaMP exempel uppgifterna. GCaMP signalen AF / F, inspelad in vivo från cellkroppen av ASJ neuronen svarar på ett alternerande på / av elektriskt fält (grön spår). Tjocka grå linjer indikerar perioder när det externa elektriska fältet (3 V / cm) anbringades till djuret. Skala stapel betecknar 100% ökning i fluorescensintensitet.

Figur 4. Cameleon exempeldata. A) Tre separata ramar som visar dubbla bildenvisa av en ALM neuron före och efter laserkirurgi av axon 20 um från cellkroppen. Den röda pilen i mitten panelen visar skärningspunkten. Den nedre panelen visar cellkroppen och axon segmentet producerar signalerna i B-och C. B) cameleon YC3.60 signalen mäts vid cellkroppen av ALM neuron före och efter laserkirurgi (röd pil). C) cameleon YC3 0,60 signal som mäts vid axonet segmentet inom 5 um av skärningspunkt före och efter laserkirurgi. Gula spår visar YFP signaler, blå spår visar GFP signaler och orange spår är den resulterande FRET förhållandet. Alla tider är relativt tiden för laserkirurgi. Skala staplarna representerar en 100% ökning av fluorescensintensitet. Klicka här för att se större bild .

Discussion

Genetiskt kodade kalcium indikatorer har allmänt används i C. elegans neurobiologi. Många grupper har använt dessa tekniker för att studera svar av primära sensoriska neuroner på yttre stimuli såsom visas här med ASJ svar på ett elektriskt fält. Framträdande exempel inkluderar känsla av mekanisk beröring, specifika kemikalier, temperatur och ett elektriskt fält ^{12, 16-19.} Aktiviteten av interneuron och muskelceller har också följts både som svar på stimuli och kontroll över djurens beteende. Många av dessa studier har drivit dessa tekniker ett steg längre med hjälp bildigenkänning och spårning tekniker för att aktivera inspelning från nervceller i delvis hindras eller ens fritt flytta djur samt inspelning från flera neuroner samtidigt. Ytterligare studier har undersökt andra aspekter av kalcium fysiologi såsom svaret på neuronal skada ^{13, 20} som presenteras här, liksomneurondegeneration på längre tidsskalor ^21.

Vid utformning av en särskild experimentet bör varje alternativa tekniker om vanliga kalcium reportrar och djur immobilisering noggrant övervägas. Immobiliseringstekniker kommer att dikteras av tekniska aspekter såsom behovet av fysisk tillgång till djuret, förmågan att återhämta djur efter avbildning eller behovet av hög genomströmning. Olika fluorescerande kalcium reportrar har särskilda fördelar och nackdelar också. GCaMP använder enkel enda analys kanal bild och den stora signal-brus-förhållande gör den tillämpbar på många situationer. Cameleon däremot kräver mer komplex avbildning och analys, men den resulterande kvotmetriska mätningen kan vara avgörande i situationer med potentiellt stora artefakter. Till exempel, kan fluktuationer i mängden av fluorofor (såsom i laserskada exemplet) förekommer också över långa tidsperioder(H) på grund av ändringar i expressionsnivåer. Ytterligare dubbla imaging strategier är också möjliga, såsom GCaMP samuttryckt med (eller fysiskt kopplad till) en RFP fluorofor. Även om inte FRET-baserade skulle dra nytta av den stora dynamiska utbud av moderna GCaMP varianter när du använder den röda kanalen som en realtid baslinjemätning.

Det är viktigt att notera att många två-kanals imaging mikroskop system och analysprogram är kommersiellt tillgängliga som visserligen ofta är dyrare, kan vara attraktivt för forskare ovilliga att konstruera hem byggt system som beskrivs här. Kommersiella dubbla bildsystem (DualView2-DV2, ljustekniska) använder oftast optik liknar vårt hem byggt systemet men finns i en enda mikroskop infästning med standardiserade anpassning förfaranden. Alternativt, snabb filterbyte system (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) tillåter snabb realtid sekventiell avbildning av två färgkanaler without ytterligare avbildande optik men är också dyra och kräver exakt synkronisering mellan filtret utbyte och kamera förvärv.

Sammanfattningsvis, C. elegans presenterar ett antal fördelar som en in vivo-avbildningssystem. De genetiskt kodade fluoroforer är ofta cellspecifikt och kan eliminera behovet för injicering eller administrering av exogena fluoroforer. C. elegans optisk tillgänglighet kan avbildning inom intakta djur som är enkelt och kostnadseffektivt att underhålla, inte kräver komplicerade dissektion eller neuronal odling och bevara cellfysiologi. Dessutom, C. elegans har stora möjligheter för genetisk analys med ett stort antal tillgängliga genetiska reagenser och väletablerade tekniker. Det finns naturligtvis nackdelar till systemet, det primära målet kanske är att det är en invertebrat. Dessutom fluoroforer rapporterar relativa förändringar i kalciumkoncentration Rather än ett absolut värde och tidsupplösningen av mätningar kan begränsas av både dynamik fluoroforen utan också de nödvändiga tider integrering av svaga fluorescenssignaler. Slutligen, är medan kalcium en integrerad del av neuronal aktivitet och signalering fluoroforerna inte direkt rapporterar den potentiella membranet spänningen mätt med elektrofysiologiska tekniker. Ändå illustreras av de procedurer som framförts här, C. elegans är en attraktiv, relativt enkelt, kostnadseffektivt system för ett brett spektrum av neuronala imaging studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B