In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Summary

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und Reagenzien

Abstract

Der Fadenwurm C. elegans ist ein idealer Modellorganismus für relativ einfache, kostengünstige neuronalen Bildgebung in vivo. Seine kleinen transparenten Körper und einfache, ermöglicht gut charakterisierten Nervensystems Identifikation und Fluoreszenz-Imaging von jedem Neuron im intakten Tier. Einfache Immobilisierungstechniken mit minimalen Auswirkungen auf die Tier-Physiologie ermöglichen erweiterte Zeitraffer-Aufnahmen. Die Entwicklung von genetisch-kodierten Kalzium Fluorophore wie cameleon ¹ und GCaMP ² ermöglichen in-vivo-Bildgebung neuronaler Calcium Zusammenhang sowohl Zellphysiologie und neuronaler Aktivität. Zahlreiche transgenen Stämme exprimieren diese Fluorophore in spezifischen Neuronen sind leicht erhältlich oder können unter Verwendung gut etablierter Techniken hergestellt werden. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur Messung Kalzium Dynamik innerhalb eines einzelnen Neurons in vivo sowohl mit GCaMP und cameleon. Wir diskutieren Vor-und disadvantAlter beider sowie verschiedene Verfahren zur Probenvorbereitung (tierische Immobilisierung) und Bildanalyse. Schließlich stellen wir die Ergebnisse von zwei Experimenten: 1) Verwenden GCaMP die sensorische Reaktion eines bestimmten Neurons mit einer externen elektrischen Feldes und 2) Verwenden cameleon die physiologische Calciumreaktion eines Neurons auf traumatische Laserschaden zu messen. Calcium bildgebenden Verfahren wie diese werden ausführlich in C eingesetzt elegans und sind Messungen in sich frei bewegenden Tieren, mehrere Neuronen gleichzeitig und Vergleich erstreckte sich über genetischen Hintergründen. C. elegans stellt eine robuste und flexible Anlage zur in vivo Bildgebung mit neuronalen Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in technische Einfachheit und Wirtschaftlichkeit.

Introduction

Hier präsentieren wir Ihnen praktische Methoden zur in vivo Calcium Imaging in C. elegans Neuronen. Die Entwicklung von genetisch kodierte Calcium-sensitiven Fluorophore mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis macht C. elegans eine vergleichsweise einfache und kostengünstige System zur Messung von neurophysiologischen und Aktivität. Unsere Bildgebung ist mit einem Standardsubstanzsampler Mikroskop unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenzabbildung allgemein verfügbarer Fluorophore getan. Wir präsentieren verschiedene Techniken unter Verwendung verschiedener Fluorophore und verschiedenen Probenvorbereitung, diskutieren die Stärken und Schwächen der einzelnen. Daten werden dann aus zwei Experimenten Beispiel vorgestellt. Eine ausgezeichnete zusätzliche Ressource auf den hier beschriebenen Techniken können in WormBook, "Imaging die Aktivität der Nervenzellen und Muskeln" von R. Kerr, (gefunden werden http://www.wormbook.org ) ^3.

Zwei Hauptklassen von gentechnischtisch kodierte fluoreszierende Kalzium-Reporter sind häufig in C eingesetzt elegans: Einkanal GCaMP und FRET-basierten cameleon. Wir beschreiben Methoden und zeigen Beispiele für Daten, die von jedem erzeugt.

GCaMP basiert auf einer modifizierten Green Fluorescent Protein (GFP), die empfindlich auf die umgebende Calciumkonzentration basiert. Dies wird durch Fusion von GFP und dem hohen Calcium-Calmodulin Protein Affinität, so dass die Bindung von Calcium durch Calmodulin das GFP-Molekül bringt in einen effizienten fluoreszierenden Bestätigung ² bewerkstelligt. Die jüngsten Fortschritte in dieser Fluorophore erzeugen außergewöhnlich gutes Signal Größe mit bis zu 500% Anstieg der Fluoreszenzintensität über einen physiologischen Bereich von Kalzium und einigermaßen schnell Kinetik ~ 95 ms Anstiegszeit und ~ 650 ms Abklingzeit ^4. Über relativ kurze Zeiträume (Minuten), können diese großen Signale für niedrigere Auflösung Bildgebung ermöglichen (untere Vergrößerung) und bei einem wohlerzogenen initial Baseline-Messung, negieren die Notwendigkeit ständiger Grundlinie oder Vergleichsmessungen.

Cameleon hat den Vorteil, eine FRET-Fluorophor, das eine Quotientenmeßschaltung Vergleichens zwei unabhängige Kanäle oder Wellenlängen ¹ erzeugt. Es besteht aus zwei separaten Fluorophore (Cyan-und Gelb-emittierende fluoreszierende Proteine, CFP und YFP) durch eine Calmodulin Protein verknüpft ist. Der Komplex wird mit blauem Licht (440 nm), die die GFP regt beleuchtet. Bindung von Calcium bringt die Fluorophore näher zusammen, wodurch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von dem GFP (Donor) zum YFP (Akzeptor) und Veranlassen des GFP-Emission (480 nm) zu verringern und das YFP-Emission (535 nm) bis zu erhöhen . Relative Kalziumspiegel werden als das Verhältnis des YFP / GFP Intensität gemessen. Cameleon Kinetik langsamer als die GCaMP, in vivo gemessen werden, um eine Anstiegszeit von ~ 1 sec und eine Abfallzeit von ~ 3 sec ⁵ haben. Jedochdas Verhältnis der gegenläufigen Signale erhöht die Signalgröße und kompensiert einer Anzahl möglicher Artefakte aufgrund veränderter Fluorophorkonzentration, Bewegung oder Fokusdrift und Bleichen.

Genetisch codierte fluoreszierende Reporter zu negieren viel von der Probenvorbereitung mit exogen verabreichtem Sonden und C geforderten elegans kleinen transparenten Körper ermöglicht die Abbildung innerhalb des intakten Tier mit einfachen weites Feld Fluoreszenz. Die wichtigste technische Herausforderung in der Probenvorbereitung ist daher sicher fixieren die Tiere. Es gibt eine Anzahl von unterschiedlichen häufigsten verwendeten Techniken mit jeweils Vorteile und Nachteile. Verwendung eines pharmakologischen Agens, um die Tiere zu lähmen ist einfach zu implementieren und ermöglicht die Montage mehrerer Tiere an einer Zubereitung (Levamisol, ein cholinerger Agonist, Muskelgewebe führt zu ergreifen ist typischerweise ⁶ verwendet). C. elegans kann auch physisch durch die Montage ihnen immobilisiert werdenauf steifen 10% igen ^{7, 8.} Dies minimiert Auswirkungen auf die Physiologie von Tieren, ermöglicht langfristige Bildgebung (Stunden) und Rückgewinnung von mehreren Tieren ist aber technisch schwierig. Beide Techniken den physischen Zugriff auf die Tiere (die unter einem Deckglas) und kann daher nur mit bestimmten experimentellen Stimuli (wie Licht, Temperatur, elektrisches Feld oder Laser-Schaden) verwendet werden. Für Impulse in der physischer Zugriff erforderlich ist, wie Touch-oder die Verabreichung von Chemikalien, haben viele Studien erfolgreich C. geklebt elegans in Ort (mit Veterinär-Grade-Kleber) ^9. Dies ist technisch anspruchsvoller, ist nur ein einziges Tier Vorbereitung und erlaubt keine tierischen Erholung. Schließlich haben zahlreiche mikrofluidischen Bauteilen eingesetzt, dass körperlich zurückzuhalten C. elegans, kann die Erhaltung Tierphysiologie, so dass die Exposition gegenüber den meisten Arten von Stimuli (je nach Geräteausführung) und ermöglichen einen schnellen Austausch und Erholung der Tiere

Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um neuronale Aktivität und Zellphysiologie in C messen elegans. Wir geben jeweils ein Beispiel: Verwendung GCaMP die sensorische Reaktion des ASJ Neuron zu einem äußeren elektrischen Feld zu messen, und Verwenden cameleon die physiologische Reaktion auf Calcium Laserschaden eines Neurons zu messen. Diese Beispiele zeigen die Vorteile und Nachteile der beiden Arten von Fluorophoren und zeigen, was möglich ist mit dem System.

Protocol

Ein. Optischer Aufbau

1. Verwenden Sie eine Standard-Verbindung Mikroskop mit Epifluoreszenz Imaging-Funktionen. Wir verwenden eine Nikon Eclipse Ti-U inverse Mikroskop mit einem Intensilight HG Illuminator.
2. Für optimale Bild-und Signal-Qualität mit einem hohen Vergrößerung, mit hoher numerischer Apertur Ziel. Wir verwenden in der Regel eine Nikon X60 1,4 NA Ölimmersionsobjektiv. In einigen Fällen ist es möglich, geringere Vergrößerung verwenden (X40, X20), je nach Expressionsniveau des Fluorophors und Signalstärke.
3. Verwenden eine hohe Empfindlichkeit gekühlte CCD-Kamera, wie beispielsweise eine Kamera, um Andor Clara Bildempfindlichkeit maximieren und Hintergrundrauschen.
4. Für einfarbige Fluorophore die Standard-Mikroskop-Fluoreszenz-Filter gesetzt konzipiert für die jeweilige Wellenlänge des Fluorophors. Für GCaMP verwenden eine Standard-GFP Filter gesetzt optimiert für Anregung bei 488 nm und Emission bei 525 nm. Keine weiteren optischen Modifikationen erforderlich sind.
Abbildung 1 dargestellt. Es besteht aus:
1. Ein Mikroskop Filter mit 440 ± 20 nm Anregungsfilter und 455 nm eingestellt langen Pass dichroitischen Spiegel.
2. Ein Bild Maske an der ersten Bildebene unmittelbar außerhalb des Mikroskopabbildanordnung Hafens (wo die Kamera CCD-Sensor würde in der Regel sitzen) platziert. Dies schränkt das Sichtfeld derart, dass sie nur die Hälfte des Kamerasensors füllen. Anordnen diese Maske an der ersten Bildebene führt scharfes Bild Grenzen und ohne Überlappung, wenn die zwei Bildern Seite an Seite projiziert werden.
3. Das erste Relais Objektiv eingestellt einer Brennweite von ter erste Bildebene derart, daß sie das Licht kollimiert.
4. Ein dichroitischer Spiegel, der das Licht teilt sich in die beiden separaten bildgebenden Wellenlängen oder Kanälen Reflektieren einer Farbe (> 515 nm, gelb) während der Übertragung des anderen (<515 nm, cyan).
5. Emissionsfilter (Bandpassfilter) weiteren Einschränkung des übertragenen Lichts auf die spezifischen Wellenlängen Bildgebung (Cyan bei 485 ± 40 nm und gelb bei 535 ± 30 nm),
6. Die zweiten Relaislinsen (eine für jeden Kanal) in den Strahlengängen, daß sie das Licht refokussiert einer zweiten Bildebene an der CCD-Kamera angeordnet.
7. Ein Paar von Spiegeln und einen zweiten dichroitischen Spiegel lenkt die Strahlengänge derart, dass die zwei Bilder projiziert werden rekombiniert und Seite-an-Seite auf die Kamera CCD-Sensor. 4A zeigt ein Beispiel des resultierenden Bildes.
5. Initial Optische Ausrichtung: Initiieren Setup und Ausrichtung der Optik mit einem hohen Kontrast image mit einem niedrigen Vergrößerungslinse und übertragen Weitfeld-Licht-Beleuchtungssystem (ein schwarzer sharpie auf einem Objektträger gezogen gut funktioniert). Bringen des Bildes, um durch die Okulare Mikroskop konzentrieren und dann an das Mikroskop zu verwendenden Port geschaltet. Mit hoher Beleuchtung sehen Sie das Bild auf eine Karteikarte in der Anfangsphase Brennebene (wenige cm außerhalb des Mikroskops Port). Platzieren des ersten Relais-Linse (C) im Strahlengang, so daß es zu einem fokalen Abstand von dem ersten Brennebene liegt und kollimiert das Licht zwar nicht Ablenken des Strahlengangs (dh direkt im Strahlengang zentriert). Legen der Maske auf der ersten Brennebene, eingestellt auf die Hälfte des Sichtfeldes zu beschränken und erzeugen eine scharfe Grenze in dem Bild. Positionieren der Spiegel und Filter (D, E, G) derart, daß der Strahlengang parallel zur Tischoberfläche bleibt und läuft in zwei parallelen Bahnen Seite an Seite, wie in 1B gezeigt. Zentrieren der zweiten Relais-Linsen (F) in ihrer jeweiligen Strahlengänge undbewegt sie hin und her entlang der Wege, um die Bilder zu einem Fokus auf eine Karteikarte platziert waren die Kamera CCD-Sensor wird zu bringen. Wenn es richtig gemacht die beiden Bilder sollten parfokal mit dem Mikroskop Okulare und andere Kamera-Ports. Schließlich stellen Sie die Kamera in Position und Feinabstimmung der Ausrichtung.
6. Fine Tuning Optische Ausrichtung: Verwenden Sie den Dual-Bild durch die CCD-Kamera betrachtet die Feineinstellung der optischen Ausrichtung. Verwenden eines Bild mit hohem Kontrast und beginnen mit geringer Vergrößerung, die Umstellung auf eine stärkere Vergrößerung zur endgültigen Ausrichtung. Positionieren Sie die übertragene Bild (cyan Kanal in Abbildung 1B) auf die Hälfte der Kamera Sichtfeld durch Bewegen der Kamera in X und Y. Position das reflektierte Bild (gelber Kanal in Abbildung 1B), die andere Hälfte des Feldes cover cover anzuzeigen, indem die beiden letzten Spiegel (G) in seinem Strahlengang. Optimieren, indem das zweite Relais-Linse für jeden Kanal vor und zurück entlang dem Strahlengang zu konzentrieren. Bleibtunverändert der optische Aufbau sollte stabil und erfordern nur selten eine Feinabstimmung Einstellung.

2. Probenvorbereitung und Datenkommunikation.

1. Erwerben Tieren Ausdruck einer Kalzium-sensitives Fluorophor im Neuron von Zinsen aus dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder anderen Quellen. Alternativ können transgene Tiere hergestellt werden unter Verwendung von Standard C. elegans Techniken. Einzelzelle Expression ist nicht erforderlich (und manchmal auch nicht wünschenswert, wenn mehrere Neuronen untersucht werden sollen, siehe ^12), solange Bilder und Messungen von mehreren Zellen können leicht abgetrennt werden. Wenn das Fluorophor Transgen nicht in das Genom integriert ist, können erhebliche Unterschiede in der Expression von Tier zu Tier auftreten. In diesem Fall Vorauswählen Tiere mit höheren Expressionsniveaus unter Verwendung eines fluoreszierenden Präpariermikroskop erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert und die Messungen. Fluorophor Expression need ausreichend sein, um ohne weiteres mit der Kamera unter den Erfassungsparameter durch das Experiment erforderlich abgebildet.
2. Nehmen Sie die Agarose-Pads für die gewünschte Immobilisierung Technik (siehe Abschnitt 2.3), indem Sie einen kleinen Tropfen geschmolzenen Agarose zwischen zwei Glasplatten durch zwei Stücke von Labor-Band Abstand erforderlich. Falls erforderlich, kann Agarose Pads einem Deckglas vor der Montage die Tiere übertragen werden. Siehe Abbildung 2.
3. Immobilisieren C. elegans zur Bildgebung unter Verwendung einer der folgenden Techniken:
   1. Pharmakologische Erstarrung: In 0,05% Levamisole bis 2% Agarose-Pads (Mischen in das geschmolzene Agarose, bevor Sie die Pads in 2,2). Wählen 5-10 Tiere auf dem Pad und decken mit einem Deckglas. Anwenden geringe Mengen von heißem Wachs-Gemisch (50% Paraffinwachs und 50% Vaseline) zu den Ecken des Deckglases zu in Position halten. Lassen 5-10 min für die Levamisol zur Wirkung und die Tiere b nehmenecome komplett still.
   2. Stiff Agarose Immobilisierung: C. elegans kann physikalisch immobilisiert werden mit steifen 10% igen Pads und 0,05 Mikrometer Durchmesser Polystyrol-Nanopartikeln. Machen Sie 10% igen Pads (10% Agarose in NGM-Puffer nach Gewicht) wie in 2.2. Hinzufügen ~ 3 ul Bead-Lösung (1:10 Polystyrol Mikrokügelchen in NGM Vol.) an die Oberseite des Pads. Schnell, holen 5-10 C. elegans in den Pool der Bead-Lösung auf dem Pad und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Verwenden geschmolzenes Wachs aufgebracht zu den Ecken des Deckglases um in Position halten. (Für weitere Details zu dieser Technik finden Sie ⁷ sowie einer früheren JoVE Artikel ⁸⁾
   3. Kleben: C. elegans kann anstelle mit geringen Mengen an veterinärmedizinischen Gradkleber die auf eine Seite des Tieres verklebt werden.
   4. Mikrofluidiksysteme: Zahlreiche Mikrofluidik-Geräte wurden entwickelt, um physisch zu halten C. elegans an Ort und Stelle für die Bildgebung.
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4. Legen Sie die vorbereitete Folie auf dem Mikroskop und konzentrieren sich auf die gewünschte Neurons. Es ist oft am einfachsten, die C. finden elegans mit Hellfeldbeleuchtung und geringe Vergrößerung. Dann Wechsel zu hoher Vergrößerung und Fluoreszenz-Imaging zu finden und sich auf die spezifischen Neurons.
5. Stimulus: Wenn eine neuronale Antwort auf einen bestimmten Stimulus erwünscht ist (Licht, elektrischem Feld, Geschmacks-und Geruchssinn, Temperatur etc.), muß die Vorrichtung in den Stimulus Mikroskopaufbau, so daß es den Tieren kann die verabreichte ausgebildet sein Probenvorbereitung, während Bildgebung.
6. Erwerben Sie Bilder mit dem Mikroskop CCD-Kamera. Belichtungszeiten und Anregungslicht Ebene auf der Grundlinie Signal und Expressionsniveau des Fluorophors ab, wobei schwächere Signale erfordern längere Belichtungszeiten mit konkordant weniger Zeitauflösung. Wir verwenden in der Regel ~ 300 msec Belichtungszeiten.
7. Bilder aufzunehmen, entweder einzeln oder als time-Videovorlauf. Weil C. elegans Neuronen in der Regel angezeigt langsame Aktivierung Dynamik (dh es fehlt Natrium-basierte Aktionspotentiale), sind relativ langsam Bildraten von ~ 1 sec reicht oft zu Neuron Dynamik zu messen. Abtastraten bis zu ~ 90 Frames pro Sekunde verwendet wurden, obwohl diese durch die Integration notwendige Zeit für schwache Fluoreszenz begrenzt werden kann. Einzelne Filme eines einzelnen Neurons kann leicht für mehrere Minuten (~ 5-10 min) oder mehr erstrecken, wenn die Immobilisierung Zubereitung ist stabil und die Bildrate relativ langsam.

3. Data Analysis

1. Es gibt eine Reihe von verschiedenen Fluoreszenz-Imaging-Software-Pakete mit dynamischen und ratiometrische Analyse-Funktionen einschließlich ImageJ und NIS-Elements. Wir verwenden ein einfaches Programm, das individuelle MATLAB die durchschnittliche Fluoreszenzsignal über einen ausgewählten Bereich von Interesse misst.
2. Für einzelne Bilder (oder Zeitraffer-Filme, die bleibenabsolut still) Auswählen einer interessierenden Region (ROI) innerhalb des abgebildeten Neuron und einem separaten Nähe Region für die Hintergrundmessung. Für ratiometrisch Bilder auszuwählen ähnlichen ROI und Hintergrund Regionen für jedes der zwei Bilder.
3. Leichte Bewegung des abgebildeten Neuronen innerhalb einer Zeitraffer-Film erfordert eine zusätzliche Analyse, um automatisch die ROI in jedem Frame, die unter Verwendung von zahlreichen Objektverfolgung Systeme werden können. Unser Programm zeigt ein komprimiertes Bild aller Bilder in dem Film, von dem eine grobe Grenze (umfasst das Objekt des Interesses in allen Frames) manuell ausgewählt wird und eine unabhängige Hintergrund Region ausgewählt. Für den ersten Rahmen, wird ein ROI manuell aus dem Grenzbereich ausgewählt. Für jeden nachfolgenden Rahmen, wählt das Programm den hellsten Pixel innerhalb des Randbereiches einen ROI von der richtigen Größe (dh die gleiche Anzahl von Pixeln wie die manuelle ersten Rahmen ROI) zu erzeugen. Bei Bildern, wo die Zielet der Interessen ausreichend heller als die umgebenden Hintergrund im Randbereich dieses Protokoll wählt einen vernünftigen ROI für jeden Frame.
4. Das Fluoreszenzsignal, F, für jeden Rahmen wird als die durchschnittliche Pixelintensität in dem ROI minus der mittleren Intensität in dem Hintergrundbereich berechnet. Ratiometrische Werte als das Verhältnis der beiden Signale (YFP-YFP _Hintergrund) / (GFP _{GFP-Hintergrund)} -0,65 berechnet. Der Faktor von 0,65 kompensiert Durchscheinen des GFP YFP Kanal in den Kanal, die abhängig von den Fluorophoren sowie insbesondere Filtersatz verwendet werden (dieser Wert typischerweise ~ 0,6 für cameleon Setups) sein wird.
5. Die relative Calciumspiegel für jeden Rahmen wird als die prozentuale Änderung in der Intensität zu einer anfänglichen normalisierten Ausgangswert von dem ersten Rahmen (oder eine Serie von Frames) gemessen wird, berechnet: &Dgr; F / F = (F (t)-F _o) / F _o, wobei F (t) ist die Fluoreszenz zum Zeitpunkt t und F _oist die erste Ausgangswert.
6. Ein Auswählen des ROI Zellkörper erzeugt die stärksten Signale robustesten aber es ist auch möglich, auszuwählen und zu messen Signale von einem ROI entlang der Nervenprozesse.

4. Problemlösung

1. Bleaching: Exposition gegenüber Anregungslicht kann Bleichen des Fluorophors und wird von einer stetigen Abnahme des Signals, die abhängig von Exposition ist markiert. Ratiometrische Messungen helfen, dies zu kompensieren. Allerdings selektive Bleichen von einer Wellenlänge können immer noch auftreten (typischerweise CFP Bleichmittel schneller als YFP). Wenn Bleichmittel reduzieren Lichtexpositions-Niveau durch Reduzieren Belichtungszeiten und / oder Anregungsintensität (mit Neutralfilter im Beleuchtungs-Weg) auftritt. Falls erforderlich, kann ein zum Bleichen indem Schauprozesse (mit der gleichen Anregung Exposition aber keine neuronalen Reiz) und Quantifizierung der Zeitkonstante Signalabfall kompensieren.
2. C.. elegans der Belichtung und experimentelle Reize reagieren, so dass sie am wahrscheinlichsten zum Zeitpunkt der Aufnahme zu bewegen. Leichte Bewegung kann erhebliche Rauschen in der Messung führen vor allem bei der Messung von Axon Prozesse. Ratiometrische Analyse hilft, diese Folgen zu einem gewissen Grad und Messungen vom Zellkörper sind robuster zu mildern. Sorgfältige Ausführung und Verfeinerung der Immobilisierung Verfahren werden in ganz still Tieren führen.
3. Hintergrundauswahl: Eine sorgfältige Auswahl eines Hintergrundes Region ist für erfolgreiche Bildanalyse. Hintergrund Regionen sollten einigermaßen einheitliche und dunkler als das abgebildete Neuron. Es muss ausreichend entfernt werden, um Streulicht (und somit ein Signal Pickup) aus dem abgebildeten Neuron vermeiden. Wir finden eine einheitliche Region 20-50 um aus dem ROI funktioniert in den meisten Fällen.
4. Ratiometric Optik: Die korrekte Ausrichtung der Abbildungsoptik ist entscheidend für die Erzeugung eine klare duale Bild. Kommerzielle Mikroskop Anhänge für ratiometrische Bildgebung zur Verfügung. Eine alternative Technik ist es, eine schnelle sequentielle Bildgebung unter Verwendung einer schnellen Filterrad rasch zwischen Emissionswellenlängen zu schalten, während der Aufnahme getrennten Bildern für jeden einzusetzen.
5. Ratiometrische Analyse: Die hier beschriebene Analyse ist eine relativ einfache Technik, robuste Signale generiert durch Mittelung über eine ROI. Es erfordert eine erkennbar helles Objekt, um den ROI zu wählen. Weitere anspruchsvolle ratiometrische Analyse ist durch präzise Ausrichten und Kartierung der dualen Bildern, so dass das fluoreszierende Verhältnis Pixel kann durch Pixel berechnet werden kann.

Representative Results

Hier präsentieren wir die Ergebnisse von zwei getrennten Experimenten. Der erste beschäftigt GCaMP um die Reaktion eines bestimmten sensorischen Neurons zu einer definierten äußeren Reiz zu messen, die einen guten Beispiel, wie fluoreszierenden Calcium Reporter verwendet werden, um optisch zu überwachen neuronale Aktivität in intakten C werden elegans. Die zweite setzt cameleon zur Messung der intrazellulären Calcium transienten ausgelöst innerhalb eines Neurons in Reaktion auf spezifische Laserschaden somit darstellt, wie Calcium Physiologie innerhalb einer einzelnen Zelle in vivo gemessen werden kann. Um auf die technischen Aspekte jeder Messung einzelner Studienergebnisse vorgestellt und ausführlich diskutiert konzentrieren. Oft ist die durchschnittliche Antwortzeit über der Zeit (berechnet als das durchschnittliche Antwortzeit zu jedem Zeitpunkt in bezug auf den Stimulus) oder einer bestimmten Metrik (wie die durchschnittliche Amplitude der Reaktion) werden in zahlreichen Studien ermittelt. Typischerweise 10-20 Studien sind notwendig, um eine akzeptable durchschnittliche Messung zu erzeugen, sondern tseine Nummer wird in der inhärenten Variabilität der Antwort abhängen. Solche Daten-Analyse für die diskutierten Experimente können hier in ¹² und ¹³ zu finden.

GCaMP Messung sensorische Reaktion: Bei einem starken externen elektrischen Feldes (≥ 3 V / cm), C unterzogen elegans aktiv gegenüber dem negativen Pol des Feldes mit präziser gerichtete Bewegung kriechen. Wir haben vorher gezeigt, dass dieses Verhalten electrotactic allem wird durch die linken und rechten ASJ Neuronen amphid sensorischen Neuronen in den Kopf des Tieres ¹² angeordnet vermittelt. Um diese Reaktion zu visualisieren verwendeten wir eine transgene Stamm exprimieren GCaMP3 spezifisch in den linken und rechten ASJ Neuronen unter der gpa-9-Promotor ist. Wir immobilisiert Tieren zur Bildgebung unter Verwendung von Agarose-Pads, die 0,05% Levamisol zwischen zwei Deckgläser (wie in den Verfahren beschrieben) angeordnet. Die elektrische Impulse verabreicht wurde mit einem speziell angefertigten bildgebenden Kammer, die auf der passtStufe eines invertierten Nikon Ti-Mikroskop (siehe ^12). Kurz gesagt, wird das Deckglas platziert Herstellung (mit der Schnecke nach unten) über einem Loch in einer kleinen Kammer Kunststoff den Zugang für die Ziele von unten und durch das Standard-Bildgebung Deckglas. Die Kammer wurde mit 0,25 mM NaCl und 50 mM gefüllt Glycerin Puffer und das elektrische Feld mit Hilfe von zwei Stimulus Platinelektroden entlang der Enden der Kammer. Wie oben beschrieben, exprimieren ein einziges Neuron ASJ CGaMP abgebildet wurde unter Verwendung eines 1,4 X100 NA Ölimmersionsobjektiv und Standard GFP Filtersatz. Ein Zeitraffer-Film wurde für 80 sec (1 Bild / s, 300 ms Belichtungszeit) erworben, während Aussetzen des Tieres mit einem externen 3 V / cm elektrischen Feldes für drei separaten Studien mit einer Dauer 10 sec (Abbildung 3). Wir maßen Fluoreszenzintensität bei dem Zellkörper Verwendung der Bildanalyse zuvor beschrieben. Das Video zeigt geringfügige Störungen sowohl Bewegung und Fokusdrift im Verlauf des Experiments. The strength der GCaMP Signal bleibt robust allerdings zeigt große eine ~ 250% Anstieg der Fluoreszenz in Abhängigkeit sowohl von der ^1. und ^3. Reize. Das Ergebnis aus der zweiten Reize wesentlich reduziert demonstrieren Variabilität in der neuronalen Antwort. Bleaching ist minimal, da offensichtlich durch die Rückkehr zu einer konsequenten Basisniveau.

Cameleon Messung der zellulären Calcium-Physiologie: Traumatische Zellverletzung löst eine große Calciumtransienten innerhalb eines Neurons, die eine wesentliche Rolle in der physiologischen Reaktion diktieren zelluläre Schicksal (dh Zelltod vs Einleitung Reparatur-Prozesse). Wir messen können diese Schäden induzierten Reaktion in vivo mit einem Femtosekunden-Laser, um einzelne C. sever elegans Neuronen ¹⁴ bei gleichzeitiger Messung zellulären Calcium-Signale mit cameleon YC3.60 ^{13, 15.} Tiere ausdrücken cameleon YC3.60 in den sechs mechanosensorischen Neuronen (unter dermec-4-Promotor) wurden unter Verwendung von 10% immobilisierter Agarose und Polystyrol-Nanopartikel, wie in den Verfahren beschrieben. Wir verwendeten Dual Abbildungsoptik auf Signale von sowohl dem GFP und YFP-Fluoreszenz-Kanäle wie in den Verfahren beschrieben aufzuzeichnen. Wir abgebildet eine einzige ALM Neuron und Laser gezielt das Axon ~ 20 um aus dem Zellkörper (Abb. 4A). Das Axon wurde durch einen kurzen (<1 sec) Exposition aus einem Femtosekunden gepulsten Infrarot-Laser am Zielpunkt entlang des Axons durch die abbildende Objektiv (siehe ¹³ für Einzelheiten zur Laserchirurgie) fokussiertes Licht durchtrennt. Zeitraffer-Bilder mit einem Rahmen alle 3 Sek. mit 400 msec Belichtungszeiten wurden für 320 sec aufgezeichnet, während der Durchführung Laserchirurgie und Kalziumspiegel errechnet ratiometrische Analyse.

Signale wurden unabhängig bei Zellkörper (4B) und für das Segment innerhalb Axon 5 um der Trenngrenze (4C) gemessen. Die Zahlen zeigen sowohl die CFP und YFP Intensitäten sowie die daraus resultierende FRET-Verhältnis. Die Messung am Zellkörper ist gut mit der GFP rasch abnimmt und die YFP in Erwiderung auf Laser-Schaden bei t = 0 sec (roter Pfeil) verhalten. Dies führt zu einer sofortigen ~ 200% ige Erhöhung der ratiometrische Signal (&Dgr; F / F), die für ~ 90 Sekunden vor Zurückfallen in der Nähe Ausgangswert wird aufrechterhalten. Bleaching ist minimal, da sich aus der konsequenten Grundlinie.

Im Axon in der Nähe des Segments Trenngrenze, variiert die Menge des lokalen Fluorophor über den Verlauf des Experiments, verkompliziert das Signal. Laserchirurgie trennt das Axon und kurz reißt die Membran, so dass Fluorophor zu entkommen und eine vorübergehende Senkung ihrer lokalen cytoplasmatischen Konzentration. Dies ergibt sich aus einer anfänglichen Abnahme der YFP Spur in 4C und einen Vergleich des Axon-Segment in der Nähe der Schadstelle in den YFP Bilder zu den Zeitpunkten t = 0 s und t = 6 s, 4A. An later Zeitpunkten, quillt das abgetrennte Ende als Teil seiner fortgesetzten Erholung, was zu mehr lokalisierte Fluorophor und einem Anstieg in der Intensität. Dies ist am deutlichsten in der langsam ansteigenden Kurve GFP in 4C und einen Vergleich des Axons Segment in GFP Bilder zu den Zeitpunkten t = 0 s und t = 270 sec, 4A. Allerdings sind diese Variationen beeinflussen beide Kanäle gleich und die FRET-Ratio wirkungsvoll kompensiert. Das Messergebnis zeigt eine Anzeige ähnlich der Zellkörper mit einer sofortigen ~ 150% Erhöhung in der Signalleistung (AF / F), einer dramatischen Rückgewinnung nahe Basislinie bei ~ 90 Sekunden und dann eine zusätzliche kleinere sekundäre Antwort bei ~ 150 sek. Die ratiometrische Analyse ist für diese Messung wie er wäre extrem schwierig, die Calcium-Signal von anderen Effekten, die stark variieren können von Neuron zu Neuron und Chirurgie zur Operation trennen. Das Axon Signal mehr Lärm im Vergleich zum Zellkörper Signal vor allem aufgrund von Fluoreszenz Dimmer unddie kleinere ROI im engeren Axon.

Abbildung 1. Basic setup und ratiometrische Optik. A) Das Foto zeigt den Versuchsaufbau, bestehend aus einer invertierten zusammengesetzte Mikroskop und ratiometrische Abbildungsoptik. B) Eine schematische Darstellung, die die abbildende Optik für die ratiometrische FRET-Messungen erforderlich. Das Bild wird in den zwei Wellenlängen oder Kanäle, die Seite-an-Seite projiziert auf dem CCD-Array gespalten.

Abbildung 2. Probenvorbereitung. C. elegans auf dünnem Agarose-Pads für die Bildgebung montiert. A) Agarose Pads, indem ein kleiner Tropfen gemacht werdengeschmolzene Agarose zwischen zwei Objektträgern durch zwei Stücke von Labor Band. B) Die Tiere werden auf das Pad Agarose überführt und mit einem Deckglas abgedeckt, an Stelle von einer kleinen Menge an Wachs an jeder der vier Ecken gehalten beabstandet.

Abbildung 3. GCaMP beispielsweise Daten. GCaMP Signal &Dgr; F / F, in vivo vom Zellkörper der Neuronen ASJ Reagieren auf einer alternierenden Ein / Aus elektrisches Feld (grüne Kurve) aufgezeichnet. Dicken grauen Linien zeigen Perioden, wenn der externe elektrische Feld (3 V / cm) an das Tier angelegt. Maßstab entspricht 100% Anstieg der Fluoreszenzintensität.

Abbildung 4. Cameleon beispielsweise Daten. A) Drei separate Frames, die die Dual ImageAnsicht einer ALM Neuronen vor und nach Laserchirurgie der Axon 20 um aus dem Zellkörper. Der rote Pfeil in der Mitte Panel zeigt den Schnittpunkt. Das untere Feld zeigt den Zellkörper und Axon-Segment Erzeugung der Signale in B und C. B) Die cameleon YC3.60 Signal am Zellkörper der ALM Neuronen vor und nach Laser-Chirurgie (roter Pfeil). C) Die cameleon YC3 gemessen 0,60 Signal am Axon Segment innerhalb 5 um des Schnittes Punkt gemessen vor und nach Laserchirurgie. Yellow Spuren zeigen, YFP-Signale, blau Spuren zeigen GFP-Signale und orange Spuren sind die resultierende FRET-Verhältnis. Alle Zeiten sind relativ zum Zeitpunkt der Laserchirurgie. Maßstabsbalken stellen eine 100% ige Steigerung der Fluoreszenzintensität. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wurden weitgehend in C genutzt elegans Neurobiologie. Zahlreiche Gruppen haben diese Techniken verwendet werden, um Reaktion der primären sensorischen Neuronen auf äußere Reize zu studieren, wie hier mit dem ASJ Reaktion auf ein elektrisches Feld demonstriert. Prominente Beispiele umfassen Empfindung mechanische Berührung, bestimmte Chemikalien, die Temperatur und ein elektrisches Feld ^{12, 16-19.} Aktivität von Interneuronen und Muskelzellen haben auch beide in Reaktion auf Reize und die Kontrolle über das Verhalten der Tiere überwacht. Viele dieser Studien haben geschoben dieser Techniken einen Schritt weiter mit Bilderkennung und Tracking-Techniken, um die Aufnahme von Neuronen in teilweise verhaltenen oder sogar frei beweglichen Tieren sowie die Aufnahme von mehreren Neuronen gleichzeitig zu ermöglichen. Zusätzliche Studien haben andere Aspekte der Calcium Physiologie wie der Reaktion auf Neuronenschädigung ^{13, 20,} wie hier dargestellt, sowie untersuchtenneuronale Degeneration auf längeren Zeitskalen ^21.

Bei der Gestaltung eines bestimmten Experiment, sollte jede der alternativen Techniken zu häufig verwendeten Calcium Reportern und Tier Immobilisierung sorgfältig abgewogen werden. Immobilisierung von Techniken wird durch technische Aspekte wie die Notwendigkeit für den physischen Zugriff auf das Tier, die Fähigkeit, Tiere nach Bildgebung oder die Notwendigkeit für einen hohen Durchsatz zu erholen diktiert werden. Verschiedene fluoreszierende Kalzium Reporter haben spezifische Vor-und Nachteile. GCaMP beschäftigt geradlinig Einkanal Bildanalyse und das große Signal-zu-Rausch-Verhältnisses ist es für viele Situationen. Cameleon andererseits erfordert komplexere Abbildung und Analyse aber die resultierende Quotientenmeßschaltung kann kritisch sein in Situationen mit möglicherweise großen Artefakte. Beispielsweise können Schwankungen in der Menge des Fluorophors (wie in der Laser-Schaden Beispiel) auch über lange Zeiträume auftreten(H) aufgrund von Veränderungen in Expressionsniveaus. Zusätzliche Dual Imaging-Strategien sind auch wie GCaMP mit (oder physisch verbunden) ein RFP Fluorophor coexprimierten möglich. Während nicht-FRET dies Vorteil der großen dynamischen Bandbreite moderner GCaMP Varianten nehmen, während mit dem roten Kanal als Echtzeit-Baseline-Messung.

Es ist wichtig zu beachten, dass zahlreiche zweikanaligen Bildgebung Mikroskopsysteme und Analyse-Software, die im Handel erhältlich, während häufig teurer, attraktiv sein Forschern nicht gewillt, die Haus gebaut hier beschriebene System kann konstruieren sind. Kommerzielle dualen Abbildungssysteme (DualView2-DV2, Photometrics) verwenden typischerweise Optiken ähnlich unserer Haus gebaut System, sondern in einem einzigen-Aufsatz mit standardisiertem Ausrichtungsverfahren enthalten. Alternativ ermöglichen die schnelle Filterwechsel Systeme (Lambda DG-4/DG-5 Plus, Sutter Instruments) schnelle Echtzeit-Darstellung von Sequenzen zwei Farbkanäle wiTHOUT zusätzliche bildgebende Optik, sondern sind auch teuer und erfordern eine präzise Synchronisation zwischen dem Filterwechsel und Kamera Akquisition.

Zusammenfassend C. elegans stellt eine Anzahl von Vorteilen, wie eine in vivo-Bildgebungssystems. Die genetisch kodierte Fluorophore sind oft zellspezifischen und kann die Notwendigkeit zur Injektion oder Verabreichung von exogenen Fluorophoren zu beseitigen. C. elegans optische Zugänglichkeit ermöglicht die Abbildung in intakten Tieren, die einfach und kostengünstig zu warten sind, erfordern keine komplizierten Dissektion oder neuronalen Kultivierung und Erhaltung Zellphysiologie. Zusätzlich C. elegans hat große Kapazitäten für die genetische Analyse mit einer großen Anzahl von verfügbaren genetischen Reagenzien und etablierte Techniken. Es gibt natürlich auch Nachteile des Systems, das primäre Anliegen vielleicht ist, dass es ein Wirbellosen. Darüber hinaus berichten Fluorophore relativen Änderungen der Kalzium-Konzentration Rather ist als ein absoluter Wert und die zeitliche Auflösung der Messung kann sowohl von der Dynamik des Fluorophors, sondern auch die notwendige Integration Zeiten schwacher Fluoreszenz-Signale beschränkt werden. Schließlich ist während Calcium integraler Bestandteil der neuronalen Aktivität und Signalisieren der Fluorophore nicht direkt berichten die Membran Spannungspotential wie bei elektrophysiologischen Verfahren gemessen. Trotzdem durch die Verfahren hier vorgestellten C dargestellt elegans ist eine attraktive, relativ einfache, kostengünstige System für eine breite Palette von neuronalen Bildgebung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eclipse Ti-U inverted microscope	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Fluorescent light source
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Optical table or 3'X3' optical grade breadboard	Thor Labs		If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice.
Clara Interline Camera	Andor Technology		High-sensitivity CCD camera
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	GFP filter set for imaging GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	excitation filter for cameleon
Dichroic mirror > 455 nm longpass	Chroma	455DCLP BS	microscope dichroic for cameleon imaging
Dichroic mirror > 515 nm longpass	Chroma	515DCLP BS	dichroic mirror for cameleon imaging
Filter 535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m EM	YFP emission filter
Filter 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m EM	CFP emission filter
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Relay lens for FRET optics (3)
Silver broadband mirror	Thor Labs	ME2S-P01	FRET optics (2)
NGM buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter	polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization
Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Transgenic strain, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B