Summary
ويعوق الدراسات التنموية في الماوس عن طريق عدم إمكانية الوصول إلى الجنين أثناء الحمل. لتعزيز ثقافة طويلة الأمد من القلب الجنينية في المراحل المتأخرة من الحمل، وضعنا بروتوكولا التي يتم تربيتها قلب رفعه في شبه صلبة، Matrigel المخفف.
Abstract
ويعوق الدراسات التنموية في الماوس عن طريق عدم إمكانية الوصول إلى الجنين أثناء الحمل. وهكذا، وبروتوكولات لعزل والثقافة الأجهزة الفردية للمصلحة ضرورية لتوفير وسيلة لكلا تصور التغييرات في التنمية والسماح استراتيجيات العلاج الرواية. لتعزيز ثقافة طويلة الأمد من القلب الجنينية في المراحل المتأخرة من الحمل، وضعنا بروتوكولا التي يتم تربيتها قلب رفعه في شبه صلبة، Matrigel المخفف. يوفر هذا الركيزة ما يكفي من الدعم للحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد ولكن هو مرنة بما فيه الكفاية للسماح استمرار الانكماش. باختصار، يتم رفعه قلوب من الجنين وضعت في خليط من Matrigel الباردة المخفف 1:1 متوسطة النمو. بعد يتصلب Matrigel المخفف، يضاف متوسطة النمو إلى الطبق الثقافة. كانت قلوب رفعه في وقت متأخر من يوم الجنينية 16.5 قابلة للحياة لمدة أربعة أيام بعد تشريح. ويبين تحليل الضفيرة التاجية أن هذا الأسلوب لاتعطيل التنمية الأوعية الدموية التاجية. وبالتالي، فإننا نقدم وسيلة جديدة لثقافة طويلة الأمد من قلوب الجنينية.
Introduction
خلال السنوات الأخيرة، كان الماوس المعدلة وراثيا في النظام النموذجي السائد لدراسة عيوب القلب التنمية. ومع ذلك، فقد ثبت الكائنات نموذج آخر، مثل الزرد، لديك مزايا هامة على الماوس. ثلاث مزايا رئيسية من الزرد هي زرع الخارجية للبيض، لسهولة الوصول إلى الأجنة، والشفافية البصرية من الأجنة، والذي يسمح التصور سهل للتنمية القلب؛ وسهولة تطبيق العلاجات الجزيئية صغيرة لتعديل وضع الجنين 1. وبالتالي، فإن تطوير تقنية الثقافة التي سمحت نمو الرحم السابقين من جهاز الجنينية الالتفافية، على الأقل في جزء، والقيود من ذوي الخبرة حاليا من قبل الباحثين الذين يدرسون العمليات التنموية في الفئران المعدلة وراثيا.
وقد وضعت خارج الحي نظم الاستزراع القلب في كل من جنين فأر كتكوت والتي تسمح للعلاج مع جزيئات صغيرة وتحليل لكيفية DIFالمناطق مختلفتين من القلب التواصل 2-6. للماوس كلها ثقافة قلب، قلوب المأخوذة من الأجنة تصل إلى الجنينية (E) 12.5 من العمر يمكن وضعها في مستنبت مع أو بدون هزاز 2،3،5. باستخدام هذه التقنية، وقلوب الجنينية وقد حضنت بنجاح إلى معادلة من E13.5، ولقد تم الحفاظ على قلوب تربيتها مع هزاز لطالما ثلاثة أيام (ابتداء من الساعة E10.5) 3. ومع ذلك، فقد الإبلاغ عن أي دراسات ثقافة الناجح للقلوب من الأجنة في السن. وبالمثل، فقد التجارب الإنقاذ اقتصرت على تطبيق كيل العلاجية على الصعيد العالمي لثقافة المتوسط 2.
كما تم استخدام نظام ثقافة شريحة، الذي يتم رفعه قلوب، جزءا لا يتجزأ، ومقطوع باستخدام vibratome، سواء بالنسبة لقلوب الشباب، مثل E12.5 قلوب الماوس وهمبرغر هاملتون المرحلة 36 (ما يقرب من E16 في الماوس) قلوب كتكوت 2،4،6، وكبار السن القلوب، مثل ح الماوس بعد الولادة وتعليم الكبارearts وقلوب الإنسان البالغ 7،8. في حين أن التحليلات الجنينية قد تستخدم عادة أبواب سميكة 150 ميكرون 2،4، ويمكن أن يكون سمك الباب الكبير الى 500 ميكرون من دون دليل على الحرمان من الأكسجين 8. وقد تم الحفاظ على هذه الثقافات شريحة طالما شهرين في الثقافة، مع معظم شرائح الحفاظ على انقباض طوال هذه الفترة 9. مقارنة دراسات في العضلية معزولة، هذه الثقافات شريحة تسمح الرئيسين ثقافة العضلية مع أنواعها الخلية المجاورة وتوفير وسيلة مفيدة لتحليل فيفو السابقين. ومع ذلك، هذه الثقافات يتطلب أكثر تفصيلا انشاء من مجرد وضع القلب في مستنبت (مثل تضمين قلب حي لباجتزاء على vibratome)، وأي تحليل محدود من الواضح إلى جزء من القلب داخل القسم.
ونظرا للقيود المذكورة أعلاه لزراعة قلوب الماوس الجنينية وثروة المعدلة وراثيا الفئران افاilable للدراسة، وضعنا في الجسم الحي الماوس قلب نظام الثقافة السابقين مشابه لنظام الثقافة الرئة فيفو السابقين التي وضعتها ويفر، وآخرون. 10 نظام ثقافتنا ثقافة يسمح على المدى الطويل والتخيل من الدورة التاجية إعادة عرض ضمن كله قلوب الماوس الجنينية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام Matrigel يسمح الخرز الذي سيعقد في مكان بالقرب من القلب، وبالتالي توفير العلاج الموضعي مع العوامل العلاجية. هذه التجارب لا يمكن أن يؤديها في مختلف نقاط زمنية التنموية للمقارنة بين تأثير العلاج معين على عملية تشكيل مثل الشريان التاجي. لأن جزيئات صغيرة يمكن نشرها من خلال Matrigel، يمكن لهذا النظام ثقافة أن تستخدم أيضا لثقافة المناطق تشريح من القلب بالقرب من بعضها البعض لتحديد ما إذا اتصالات خلية خلية محددة ضرورية للعمليات التنموية معينة أو ما إذا كان يشير نظير الصماوي من منطقة إلى أخرى هو اللازمة.
هذا النظام ثقافةهو بسيط نسبيا، وعلى عكس نظام ثقافة شريحة، يجعل من استخدام الكواشف الثقافة الأساسية ومجموعة عمليات التي تتوافر بسهولة في معظم المختبرات. باختصار، يتم تربيتها قلوب الجنينية رفعه في Matrigel المخفف، الذي يوفر دعما شبه صلبة. هذا الدعم كافيا للحفاظ على مورفولوجيا ثلاثي الأبعاد للقلب مع السماح أيضا القلب إلى العقد. باستخدام هذا النظام، يمكن الحفاظ على قلوب كامل من أجنة الفئران الأكبر سنا (E14.5-E16.5) في الثقافة لمدة تصل إلى أربعة أيام. يتم الحفاظ على الضفيرة التاجية بأكمله، خلافا لما حدث في الثقافات شريحة، لذلك تبقى أي العظة مما يشير إلى أن تحدث من مناطق مختلفة من قلب الحاضر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الأصباغ الفلورية الخلية الحية تتخلل Matrigel للسماح التصور من قلب حي، والخرز البروتين، مترافق يمكن وضعها بالقرب من القلب إلى توفير مصدر إشارات المترجمة. معا، وهذه المزايا تجعل هذه التقنية وسيلة مثالية لدراسة العمليات التنموية في embryonIC قلب فأر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استئصال قلوب الجنينية
- الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل في اليوم الجنينية المطلوب باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل.
- رش تحرري الأنثى مع الايثانول 70٪ قبل تشريح. فتح تجويف البطن الأنثى لاسترداد واستئصال قرن الرحم.
- ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وشطف حسب الحاجة. خفض فتح قرن الرحم عن طريق خط الوسط لفضح الحويصلات الجنينية المرفقة.
- خفض فتح الكيس الجنيني واسترجاع الجنين. وضع الجنين في طبق بيتري الثانية مع برنامج تلفزيوني الباردة. العودة طبق بيتري مع قرن الرحم إلى جليد.
- قطع رأس الجنين لتحسين الوصول إلى جدار الصدر. إذا التنميط الجيني هو ضروري، وإزالة وحفظ الذيل في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
- معالجنين على ظهرها، وقطع فتح جدار الصدر لتصور القلب والرئتين. اعتمادا على المسرح، قد يكون جدار الصدر شفافة.
- رفع بعناية القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ثم، وقطع فوق سفن كبيرة للافراج عن القلب. إذا لزم الأمر، وإزالة الأنسجة الدخيلة.
- وضع القلب في بئر واحدة من طبق 24 أيضا مليئة الباردة برنامج تلفزيوني ووضع الطبق على الجليد.
- كرر الخطوات السابقة حتى يتم استئصاله من قلوب جميع الأجنة.
2. ثقافة مجموعة المتابعة
- في الصفحي هود، والجمع بين Matrigel الباردة والمتوسطة الثقافة المطلوبة (على سبيل المثال 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM)) في نسبة 1:1. لا قبل دافئ ثقافة المتوسط.
- الحفاظ على Matrigel المخفف على الجليد، ماصة 500-1،000 ميكرولتر من محلول مخفف في بئر من صحن الثقافة 24 أيضا أن يتم الحفاظ أيضا على الجليد.
- في غطاء محرك السيارة، واختيار بعناية ووضع رفعهالقلب في بئر من صحن الثقافة التي تحتوي على على Matrigel مع الحفاظ على صحن الثقافة على الجليد.
- إذا التوجه للقلب جزءا لا يتجزأ من الأهمية بمكان: رذاذ متحررا مجهر مقلوب والمساحة المحيطة بها مع الايثانول 70٪. في غطاء محرك السيارة، ضع قلب رفعه في بئر من لوحة الثقافة التي تحتوي على على Matrigel في حين لا يزال على الجليد. ثم، وضع لوحة على المجهر وبسرعة المشرق قلب رفعه كما يبدأ Matrigel لترسيخ.
- مكان الطبق الثقافة في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO 2) والسماح للMatrigel ليصلب لمدة حوالي 30 دقيقة.
- إضافة 1 مل مستنبت قبل تحسنت إلى كل تحتوي أيضا على القلب.
- يمكن أن تبقى القلوب في الثقافة لمدة أربعة أيام على الأقل. ينصح بتغيير ثقافة المتوسط كل يومين.
3. تثبيت والتخيل
- إذا رغبت في ذلك، إضافة صبغة الفلورسنت الخلية الحية (على سبيل المثال Syto-16) لتصور قلب حي. وسوف يكون التصويرتقتصر على جانب القلب الذي مرئيا استنادا إلى الموقف الذي كان جزءا لا يتجزأ منه.
- إذا كان سيتم إجراء تحليلات ما بعد زراعة (على سبيل المثال كله التصوير جبل أو باجتزاء)، وإزالة ثقافة المتوسط واستبدالها مع البرد 4٪ الفورمالديهايد. وضع الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- بعد الفورمالديهايد الباردة والجليد تعزيز حل Matrigel، استبدال تثبيتي (وMatrigel) مع الفورمالديهايد الطازجة وإصلاح القلوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل قلوب مع العازلة (مثل برنامج تلفزيوني أو تريس) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى إجراء المزيد من التحليلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه التقنية، ويحافظ على القلب التشكل لها ثلاثي الأبعاد وتبقى قابلة للحياة، كما يتبين من استمرار انكماش (فيلم 1). هذه الانقباضات هي دائما أكثر وضوحا في الأذينين مما كانت عليه في البطينين. بعد الثقافة، وقلوب يمكن ان تكون ثابتة ومعالجتها إما المناعية أو الأنسجة لدراسة التعبير علامة معينة أو الهياكل. الشكل 1A يظهر قاعدة البطينين والشرايين الكبيرة من قلب الفأر الجنينية التي تم تربيتها لمدة 24 ساعة، ثابتة، ومعالجتها لل المناعية لتسمية البطانة. هذه الميكروسكوب متحد البؤر إثبات أن يظهر الأوعية الدموية التاجية مماثلة لقلب رفعه من جنين عمره نسبيا التي تم الاحتفاظ بها في الرحم (الشكل 1B). ومع ذلك، فإن الأوعية التاجية في القلب مثقف فيفو السابقين قيام تبدو أصغر مما كانت عليه في القلب التي كان يحتفظ في الرحم. في كل القلوب، التم إزالة قمم (ه) من البطينين للسماح بالوصول أفضل من الأجسام المضادة للأنسجة.
يوضح الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تحليل قلوب رفعه في E16.5 ومثقف فيفو السابقين لمدة 4 د أن التشكل الشاملة، بما في ذلك جدران الشرايين الكبيرة (الشكل 2A) والبطين وعضلة القلب بين البطينين الحاجز (الشكل 2B) من يظل القلب سليما. وعلى الرغم من عدم وجود تداول، وأوستيا التاجي واضحة (الشكل 2A). ومع ذلك، الحمض النووي التجزؤ، لاحظت مع كل من H & E (أرقام 2A، 2B) ودابي (لا تظهر البيانات)، هو واضح في عضلة القلب المدمجة وحول الأوعية الدموية الكبرى. علاوة على ذلك، عضلة القلب هو أقل كثافة بالمقارنة مع قلب من E18.5 الجنين التي وضعت في الرحم (أرقام 2C، 2D)، على الرغم من أن القلب فيفو السابقين مثقف كان لا يزال الضرب. وبالتالي، هناك قيود على طولمن وقت لأو المرحلة التي يمكن الحفاظ على هذه القلوب.
ويمكن أيضا هذه التقنية الثقافة استخدامها لتسمية fluorescently قلوب بينما في الثقافة. في هذه الحالة، يتم تربيتها قلوب لمدة 48 ساعة بعد أن حضنت مع صبغة الفلورسنت البطانية محددة. في هذا المثال، يتم التصور محدودة على أساس التوجه للقلب والتعتيم من النسيج (أرقام 3A، 3B). ومع ذلك، المقاطع النسيجية لاحقة من خلال البطين عضلة القلب التأكد من أن هذا الجزيء الفلورسنت يمكن ان تخترق طبقات الخلايا الخارجي لتسمية السفن شبه نخابي داخل البطينات (أرقام 3C، 3D)، وهذه صبغة الفلورسنت colocalizes مع ISO-كتين (الشكل 3D).
الشكل 1. يظهر التطور الطبيعي في ظروف فيفو السابقين. (A) وبعد 24 ساعة في الثقافة، وثبتت قلوب فيفو السابقين من E14.5 الأجنة، المسمى مع علامة البطانية (الأخضر)، وتطهيرها، والتقط مع المجهري متحد البؤر. وتظهر الشريان الرئوي (PA)، الشريان الأورطي (AO)، وقاعدة للقلب. (B) تم تجهيزها وبالمثل قلوب رفعه من E15.5 الأجنة التي وضعت في الرحم. شريط الحجم، 100 ميكرون.
الشكل 2. يتم الحفاظ على التشكل بشكل صارخ خلال الثقافة فيفو السابقين. (A، B) قلوب تم رفعه من E16.5 الأجنة ومثقف فيفو السابقين لمدة 4 أيام. كانت قلوب ثم مقطوع وملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). (أ) المقطع العرضي يظهر المواءمة بين الشريان الأورطي (AO) والشريان الرئوي (PA). واحدة من أوستيا التاجي (رأس السهم) مرئيا. عضلة القلب سورالتقريب الشريان الأورطي هو أقل كثافة مما كانت عليه في التحكم (C)، وبعض تجزئة النووية (السهم) وهذا هو ايضا. (B) يظهر التشكل العام للعضلة القلب المضغوط من البطينين الحاجز بين البطينين و(الحبس الاحتياطي) العادي، ولكن عضلة القلب هو أقل كثافة مما كانت عليه في التحكم (D)، وبعض تجزئة النووية (السهم) هو واضح في الحبس الاحتياطي. (C، D) وعلى سبيل المقارنة، وتظهر أمامي H & E المقاطع الملطخة من E18.5 القلب. (C) ويلاحظ وجود الفوهة التاجية المتاخمة للآو (رأس السهم). (D) هو الحاجز بين البطينين محددة جيدا. شريط النطاق، 70 ميكرومتر.
الشكل (3). السابقين قلوب فيفو يمكن fluorescently المسمى خلال ثقافة (A، B)، وبعد 48 ساعة في الثقافة، وقلوب السابقين فيفو منوحضنت الأجنة E16.5 مع Syto 16 (الأخضر) لمدة 1 ساعة، ويمكن ملاحظة مضان في وقت متأخر من 48 ساعة بعد الحضانة. (C، D) واستمر هذا مضان من خلال باجتزاء المجمدة ويمكن لوحظت في الخلايا الظهارية تحت التأمور داخل البطين عضلة القلب. في D، وقد شارك في تسمية القسم داخل البطين عضلة القلب مع ISO-كتين (الحمراء). وISO-كتين شارك في التسميات على الخلايا Syto 16-الإيجابية الخضراء (الأسهم) وتصف أيضا السفن داخل عضلة القلب التي لم تكن ملطخة Syto 16. AB، التكبير 4X؛ شريط النطاق في مؤتمر نزع السلاح، و 120 ميكرون.
الفيلم 1. بعد زراعة فيفو السابقين لمدة 30 ساعة، وقلب رفعه من E14.5 الجنين يظهر انقباض ثابت وسرعة بين الأذينين والبطينين. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النظام الحالي يشكل ثقافة مزايا هامة لدراسات القلب الماوس الجنينية. هذا النظام يحافظ على ثقافة انقباض عضلة القلب والضفيرة التاجية، مع وجود علامات محدودة من النخر، حتى بعد أربعة أيام في الثقافة. علاوة على ذلك، يوفر مصفوفة شبه صلبة بما فيه الكفاية دعم للحفاظ على مورفولوجيا ثلاثي الأبعاد للقلب النامية بينما تسمح المرونة في التعاقد وأيضا لعقد حبات مغلفة في المكان خلال الثقافة. وعلى الرغم من هذا الدعم، هذه المصفوفة هو نفاذا إلى الأصباغ الفلورية مثل Syto 16، مما يتيح تحليل الفلورسنت من قلب حي.
طرق ثقافة شريحة وضع قسم القلب، والتي تحتوي على الجزء الخاص بها من الضفيرة التاجية، على غشاء مسامي في واجهة الهواء السائل للحفاظ على الأوكسجين من خلال العمل الشعري 7. في المقابل، كلها أساليب الثقافة قلب السابقة تعتمد على دراسات هزاز ومقتصرة على الأعمار الجنينية قبل vasculat التاجي وظيفيةلدى عودتهم من الضروري 2،3،5. باستخدام تقنية الحالي، ومع ذلك، يمكن بسهولة أن يكون المثقف القلوب بعد أن شكلت الضفيرة التاجية دون تعقيد إضافي من واجهة الهواء السائل.
رغم مخاوفنا أن قلوب الجنينية في وقت متأخر (على سبيل المثال E16.5) سوف تصبح نخرية بعد فترة طويلة من الزمن في الثقافة، لوحظ فقط نخر محدودة بعد أربعة أيام من الثقافة (أي ما يعادل ما بعد الولادة يوم 1 القلب). البروتوكول الأصلي، كما يقوم باستخدام براعم الرئة الجنينية، ذكرت 10 لا نخر ولكن أيضا الرئتين استخدمت في وقت سابق من الأجنة على مراحل. وبالتالي، يمكن تجنب نخر عن طريق تقييد الدراسات إلى نقطة زمنية الجنينية في وقت سابق.
هذا النظام الثقافة فيفو السابقين لديها قيود. بعد يومين في الثقافة، والنخاب يبدأ الانتشار في المصفوفة، وخلال أربعة أيام، والنخاب تعلقها على طبق الثقافة. لأن ثمرة نخابي ظبيةو لا يؤثر على التصور، ومع ذلك، قد تكون هذه المسألة من أهمية قصوى للدراسات نخابي. في مراحل تحليلها هنا (E14.5-E16.5)، والنخاب لديه منذ فترة طويلة شملت قلب 11 وقدمت إشارات إلى الضفيرة النامية 12، وبالتالي، لا تظهر ثمرة لها أن يكون لها آثار سلبية على الضفيرة التاجية. علاوة على ذلك، تظهر قلوب في الثقافة لتتوقف عن النمو الكبيرة مثل نظرائهم في الرحم. الحد الآخر هو أن القلب الماوس الجنينية ليست شفافة مثل الجنين الزرد. وبالتالي، أي التصور الحية يقتصر على ما يمكن أن يلاحظ على الطبقات الخارجية من القلب. ومع ذلك، يمكن للعلامة البطانية لايف تتخلل بما فيه الكفاية قلب لتسمية بعض الضفيرة التاجية ويكون مرئيا في الثقافة.
وعلى الرغم من هذه القيود، ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب الثقافة فيفو السابقين سوف يكون مفيدا لعدد من التطبيقات. خطوط متنوعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا تلك السيارةراي أنواع الخلايا fluorescently المسمى يمكن استخدامها بسهولة لتقييم الجوانب المختلفة للتنمية باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير. علاوة على ذلك، علاج قلوب الجنينية خارج الحي مع المركبات الجزيئية الصغيرة، سواء كانت رواية أو بالفعل في الاستخدام السريري، سوف يكون من السهل تحقيقه ويحاكي كيفية تطبيق العلاجات المخدرات في البشر.
وفي الختام، فإننا قد تكيفت وسيلة الثقافة فيفو السابقين للقلب الفأر الجنينية. هذه التقنية سوف تتيح سهولة الوصول إلى الأجهزة التي يتعذر الوصول إليها على خلاف ذلك، مثل الكبد أو الكلى، خلال التنمية، وسوف تسمح للتلاعب وتحليل حية من هذه الأجهزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر اندريا بورتبري لقراءة نقدية للمخطوطة والمعاهد الوطنية للصحة (منحة # R01HL061656) لدعم التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
