Summary
Udviklingsmæssige studier i mus er hæmmet af den manglende adgang til embryo under svangerskabet. At fremme den langsigtede kultur embryonale hjerte på sene stadier af drægtighed, udviklede vi en protokol, hvor det udskårne hjerte dyrkes i en halvfast, fortyndet Matrigel.
Abstract
Udviklingsmæssige studier i mus er hæmmet af den manglende adgang til embryo under svangerskabet. Således, at protokoller isolere og kultur enkelte organer af interesse er afgørende for at tilvejebringe en metode til både visualisering ændringer i udviklingen og giver nye behandlingsstrategier. At fremme den langsigtede kultur embryonale hjerte på sene stadier af drægtighed, udviklede vi en protokol, hvor det udskårne hjerte dyrkes i en halvfast, fortyndet Matrigel. Dette substrat giver tilstrækkelig støtte til at opretholde den tredimensionale struktur, men er fleksibel nok til at tillade fortsat sammentrækning. Kort fortalt er hjerter udskåret fra embryoner og anbringes i en blanding af kold Matrigel fortyndet 1:1 med vækstmedium. Efter den fortyndede Matrigel størkner, er vækstmedium tilsættes til kulturen skålen. Hearts udskåret så sent som embryonale dag 16.5 var levedygtige i fire dage efter dissektion. Analyse af koronar plexus viser, at denne metode ikkeforstyrre koronar vaskulær udvikling. Således præsenterer vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til langvarig kultur af embryonale hjerter.
Introduction
I de seneste år har den transgene mus været den altovervejende modelsystem til at studere udviklingen hjertefejl. Imidlertid har andre modelorganismer, såsom zebrafisk, vist sig at have betydelige fordele i forhold til mus. Tre store fordele ved zebrafisk er den eksterne udlægning af æg, for at lette adgangen til de embryoner, den optisk transparens af embryonerne, der giver let visualisering af hjertets udvikling, og den lethed for at anvende små molekylære behandlinger til at modulere udviklingen af embryo 1.. Således vil udviklingen af en kultur teknik, der tillod ex utero vækst af en embryonisk organ bypass, i det mindste delvist, i øjeblikket de begrænsninger opleves af forskere studerer udviklingsprocesser i transgene mus.
Ex vivo kardielle kultur systemer er blevet udviklet i både kylling og museembryo der tillader behandling med små molekyler og analyse af hvordan DIFskellige områder af hjertet kommunikere 2-6. For hele mus hjerte kultur, taget hjerter fra fostre op til embryonale (E) 12.5 alder kan placeres i dyrkningsmedium med eller uden rokkende 2,3,5. Ved hjælp af denne teknik, er embryonale hjerter blevet inkuberet med ækvivalente E13.5 og hjerter dyrket med vuggende blevet opretholdt, så længe tre dage (starter ved E10.5) 3.. Imidlertid har ingen undersøgelser rapporteret en vellykket kultur af hjerter fra ældre embryoner. Ligeledes er rednings forsøg været begrænset til anvendelsen af det terapeutiske middel globalt til dyrkningsmediet 2..
Et udsnit kultur system, hvor hjerterne udskæres, indlejret og snit med en vibratome, er også blevet anvendt til både yngre hjerter, såsom E12.5 mus hjerter og Hamburger-Hamilton stage 36 (ca. E16 i mus) chick hjerter 2,4,6, og ældre hjerter, såsom post-natal og voksne mus hearts og voksne menneskelige hjerter 7,8. Mens embryonale analyser typisk har udnyttet 150-um tykke sektioner 2,4 kan snittykkelsen være en stor som 500 um uden tegn på iltmangel 8.. Disse skivekulturer er blevet opretholdt så længe som to måneder i kultur med de fleste skiver opretholdelse kontraktilitet i hele denne periode 9.. Forhold til undersøgelser på isolerede cardiomyocytter giver disse skivekulturer co-kultur af cardiomyocytter med deres tilstødende celletyper og give en nyttig metode til ex vivo-analyse. Men disse kulturer kræver mere omfattende opsætning end blot at placere et hjerte i dyrkningsmedium (fx indlejring levende hjerte for sektionering på en vibratome), og enhver analyse er naturligvis begrænset til den del af hjertet i den sektion.
I betragtning af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor til dyrkning embryonale mus hjerter og det væld af transgene mus available til undersøgelse, har vi udviklet en ex vivo mus hjerte kultur system svarende til en ex vivo lunge kultur udviklet af Weaver, et al. 10. Vores kultur system giver langvarig kultur og visualisering af ombygningen koronar omsætning i hele embryonale mus hjerter. Desuden giver brugen af Matrigel perler at blive holdt på plads nær hjertet, hvilket giver en lokalbehandling med terapeutiske midler. Disse eksperimenter kan udføres på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter at sammenligne effekten af en given behandling på en proces, såsom koronar dannelse. Fordi små molekyler kan diffundere gennem Matrigel, kan denne kultur systemet også bruges til kultur dissekerede områder af hjertet nær hinanden for at afgøre, hvorvidt specifikke celle-celle-kontakter er nødvendige for visse udviklingsprocesser eller om parakrine signalering fra en region til den anden er nødvendigt.
Dette dyrkningssystemer relativt enkel og i modsætning til skive kultur-system, der gør brug af de grundlæggende kultur reagenser og set-ups, som er let tilgængelige i de fleste laboratorier. Kort fortalt er udskåret embryonale hjerter dyrket i fortyndet Matrigel, hvilket giver et halvfast støtte. Denne støtte er tilstrækkelig til at opretholde den tredimensionale morfologi af hjertet samtidig mulighed for hjertet til at trække. Med dette system kan hele hjerter fra ældre mus embryoner (E14.5-E16.5) opretholdes i kultur i op til fire dage. Hele koronar plexus opretholdes, i modsætning til de skivekulturer, så enhver signalering tidskoder, der opstår fra forskellige regioner i hjertet være til stede. Endvidere kan levende celle fluorescerende farvestoffer permeat Matrigel at tillade visualisering af levende hjerte, og protein-konjugerede perler kan placeres nær hjertet for at tilvejebringe en lokal signalering kilde. Tilsammen udgør disse fordele gør denne teknik en ideel metode til at studere udviklingsprocesser i embryonic mus hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udtagelse den embryonale Hearts
- Aflive en tidsbestemt gravid musen på den ønskede embryonale dag ved hjælp af en godkendt eutanasi teknik. Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug udvalg ved University of North Carolina i Chapel Hill.
- Liberalt sprøjte kvinde med 70% ethanol før dissektion. Åbn den kvindelige bughulen hente og punktafgifter uterushornet.
- Placer uterushornet i en petriskål indeholdende kold 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og skylles efter behov. Skar livmoderhorn via midterlinjen at blotlægge de vedlagte embryonale sække.
- Skær åbne en embryonale sac og hente et foster. Placer embryo i en anden petriskål med kold PBS. Retur petriskålen med livmoderhorn til is.
- Halshugge embryonet at forbedre adgangen til brystvæggen. Hvis genotypebestemmelse er nødvendigt, fjerne og gemme halen i et Eppendorf-rør anbragt på is.
- Medfoster på ryggen, skar brystvæggen at visualisere hjertet og lungerne. Afhængigt af scenen, kan brystvæggen være gennemsigtigt.
- Løft forsigtigt hjertet ved hjælp af pincet og skære skibene nedenfor. Derefter skæres over de store skibe at frigøre hjertet. Hvis det er nødvendigt, fjernes uvedkommende væv.
- Placer hjerte i en brønd i en 24-godt fad fyldt med kold PBS og placer fadet på is.
- Gentag de forrige trin, indtil hjerte er blevet skåret fra alle embryoner.
2.. Kultur Set-up
- I en laminar hætte, kombinere kold Matrigel og den ønskede dyrkningsmedium (fx 10% kalvefosterserum (FBS) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)) i forholdet 1:1. Må ikke pre-varm dyrkningsmediet.
- At den fortyndede Matrigel på is, pipette 500-1.000 pi af den fortyndede opløsning i en brønd af en 24-brønds dyrkningsplade, der også opretholdes på is.
- I hætten, pick omhyggeligt op og placere det udskårnehjerte i en brønd i Matrigel-holdige dyrkningsskål samtidig holde dyrkningsskålen på is.
- Hvis orienteringen af den indlejrede hjertet er afgørende: rigeligt sprøjte et omvendt mikroskop og det omgivende rum med 70% ethanol. I hætten, placere det udskårne hjerte i en brønd i Matrigel-holdige kultur plade mens stadig på is. Derefter placeres pladen på et mikroskop og hurtigt orientere den udskårne hjerte som Matrigel begynder at størkne.
- Placer dyrkningsskålen i en befugtet 37 ° C inkubator (5% CO 2) og tillade Matrigel at størkne i ca 30 minutter.
- Tilsæt 1 ml forvarmet dyrkningsmedium til hver brønd indeholdende en hjerte.
- Hjerter kan forblive i kultur i mindst fire dage. Ændring af dyrkningsmediet hver to dage anbefales.
3.. Fiksering og Visualisering
- Hvis det ønskes, tilsættes et fluorescerende live-cell farvestof (f.eks syto-16) for at visualisere den levende hjerte. Fotografering vil værebegrænset til den side af hjertet, der er synlig baseret på den position, hvor den var indlejret.
- Hvis post-dyrkning analyser (f.eks hel mount imaging eller sektionering) blive udført, fjernes dyrkningsmediet og erstatte med koldt 4% formaldehyd. Sæt fadet på is i 30 min.
- Efter den kolde formaldehyd og is fremmer opløsning af Matrigel, udskifte fikservæske (og Matrigel) med frisk formaldehyd og fastsætte hjerter natten over ved 4 ° C.
- Vask hjerter med buffer (f.eks PBS eller Tris) og opbevares ved 4 ° C indtil yderligere analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denne teknik, hjertet fastholder sin tredimensionale morfologi og forbliver levedygtige, som indikeret ved fortsatte sammentrækninger (film 1). Disse sammentrækninger er konsekvent mere fremtrædende i hjertets forkamre end i hjertekamrene. Efter kultur, kan hjerterne fastsættes og behandles til enten immunohistokemi eller histologi at undersøge specifik markør udtryk eller strukturer. Figur 1A viser bunden af hjertekamrene og store arterier ved en embryonale mus hjerte, der blev dyrket i 24 timer, fikseret, og forarbejdet til immunhistokemi at mærke endotel. Disse konfokale mikrografier viser, at koronar vaskulaturen synes tilsvarende et hjerte udskåret fra et sammenligneligt alderen embryon, der blev opretholdt i livmoderen (figur 1B). Men koronarkar i hjertet kulturperler ex vivo gør synes mindre end i hjertet, der blev opretholdt i livmoderen. I begge hjerter, the spidserne af hjertekamrene blev fjernet for at tillade bedre adgang af antistofferne til vævet.
Hematoxylin og eosin (H & E) analyse af hjerter udskåret ved E16.5 og dyrkes ex vivo for 4 d viser, at den samlede morfologi, herunder væggene i de store arterier (figur 2A) og den ventrikulære og Interventrikulær septal myokardiet (figur 2B) af hjertet forbliver intakt. Trods den manglende omsætning, er koronar Ostia tilsyneladende (figur 2A). Men DNA-fragmentering, observeret både med H & E (2a, 2b), og DAPI (data ikke vist), er tydelig i den kompakte myokardiet og omkring de store fartøjer. Endvidere myokardiet er mindre tæt sammenlignet med et hjerte fra en E18.5 embryo, der er udviklet i livmoderen (figur 2C, 2D), selvom ex vivo dyrkede hjerte stadig slår. Der er således begrænsninger til længdenaf tid til eller den fase, hvor disse hjerter kan opretholdes.
Denne kultur teknik kan også anvendes til fluorescens mærke hjerter mens i kultur. I dette tilfælde er hjerter dyrket i 48 timer efter at være blevet inkuberet med en endotel-specifik fluorescerende farvestof. I dette tilfælde er visualisering begrænset baseret på orienteringen af hjertet og opaciteten af væv (figur 3A, 3B). Men efterfølgende histologiske snit gennem ventrikulære myocardium bekræfte, at denne fluorescerende molekyle kan trænge de ydre cellelag at mærke sub-epikardielle fartøjer inden hjertekamrene (figur 3C, 3D), og dette fluorescerende farvestof colocalizes med iso-lectin (figur 3D).
Figur 1. Udviklingen fremtræder normal i ex vivo. (A) Efter 24 timer i kultur blev ex vivo hjerter fra E14.5 embryoer fast, mærkes med en endotel markør (grøn), ryddet og filmede med konfokal mikroskopi. Lungepulsåren (PA), aorta (Ao), og bunden af hjertet er vist. (B) Hjerter udskåret fra E15.5 embryoer som udviklede i livmoderen blev ligeledes behandlet. Scale bar, 100 um.
Figur 2. Morfologi groft opretholdes under ex vivo kultur. (A, B) Hjerter blev udskåret fra E16.5 embryoer og dyrkes ex vivo i 4 dage. Hjerter blev derefter snittet og farvet med hematoxylin og eosin (H & E). (A) et tværsnit der viser tilpasningen af aorta (Ao) og lungepulsåren (PA). En af koronar Ostia (pilespids) er synlig. Myokardiet surafrunding aorta er mindre tæt end i kontrolgruppen (C), og nogle nuklear fragmentering (pil) er også til stede. (B) den overordnede morfologi af den kompakte myocardium af hjertekamrene og interventricular septum (IVS) synes normale, men myokardiet er mindre tæt end i kontrolgruppen (D), og nogle nuklear fragmentering (pil) er tydelig i IVS. (C, D) Til sammenligning frontal H & E-farvede snit fra en E18.5 hjerte vist. (C) En coronarostium er observeret siden af Ao (pilespids). (D) interventricular septum er veldefineret. Scale bar, 70 um.
Figur 3.. Ex vivo hjerter kan fluorescensmærkede under dyrkning. (A, B) Efter 48 timer i kultur, ex vivo hjerter fraE16.5 embryoer blev inkuberet med syto 16 (grøn) i 1 time, og fluorescens kunne observeres så sent som 48 timer efter inkubation. (C, D) Denne fluorescens blev opretholdt gennem frossen sektionering og kunne iagttages i de subepicardial epitelceller inden for ventrikulære myocardium. I D blev sektion i ventrikulære myocardium co-mærket med iso-lectin (rød). De iso-lektin co-etiketter de grønne syto 16-positive celler (pile) samt etiketter fartøjer inden myokardiet, der ikke blev farvet med syto 16. AB, 4x forstørrelse, Målestokken i CD, 120 um.
Movie 1. Efter ex vivo dyrkning i 30 timer, viser et hjerte skåret ud af en E14.5 embryo konsistent kontraktilitet og pacing mellem forkamre og hjertekamre. Klik her for at se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende kultur-systemet indebærer betydelige fordele for embryonale mus hjerte studier. Dette dyrkningssystem bevarer myokardial kontraktilitet og koronar plexus med begrænsede tegn på nekrose, selv efter fire dage i kultur. Endvidere halvfaste matrice giver tilstrækkelig støtte til at opretholde den tredimensionale morfologi udvikle hjerte samtidig giver fleksibilitet til kontrakt og også at holde coatede perler på plads under kultur. Trods denne støtte, er denne matrix permeabel for fluorescerende farvestoffer, såsom syto 16, tillader fluorescerende analyse af den levende hjerte.
Slice dyrkningsmetoder placere hjertet afsnittet indeholdende sin del af koronar plexus, på en porøs membran ved en luft-væske-grænsefladen for at opretholde iltning via kapillarvirkning 7.. I modsætning hertil er afhængige tidligere hele hjertet dyrkningsmetoder på vuggende og begrænsede undersøgelser til embryonale aldre før en funktionel koronar vasculatUre er nødvendig 2,3,5. Brug af nuværende teknik kan imidlertid hjerter nemt dyrkes efter koronar plexus har dannet uden yderligere kompleksitet af en luft-væske-grænsefladen.
På trods af vores bekymringer, sent embryonale hjerter (f.eks E16.5) ville blive nekrotiske efter en længere periode i kultur, blev der kun begrænset nekrose observeret efter fire dages kultur (dvs. svarende til en post-natal dag 1 hjerte). Den oprindelige protokol, som udføres ved hjælp af embryonale lunge knopper, 10 rapporterede intet nekrose, men også udnyttede lunger fra tidligere iscenesat embryoner. Således kan nekrose undgås ved at begrænse undersøgelser til tidligere embryonale tidspunkter.
Denne ex vivo kultur-system har dog begrænsninger. Efter to dage i kultur, begynder epicardiet breder sig til matrixen, og efter fire dage lægger epicardiet til dyrkningsskålen. Fordi epicardial udvækst does ikke påvirke visualisering, kan dog dette spørgsmål være af største betydning for epikardielle studier. På de faser analyseres heri (E14.5-E16.5), epicardiet længst har omfattet hjerte 11 og forudsat signaler til udviklingslandene plexus 12, og dermed har sin udvækst ikke ud til at have negative virkninger på den koronare plexus. Endvidere hjerter i kultur synes at stoppe voksende større ligesom deres In Utero modstykker. En anden begrænsning er, at embryonale mus hjertet ikke er gennemsigtig ligesom zebrafisk foster. Alle levende visualisering er således begrænset til hvad der kan observeres på de ydre lag af hjertet. Dog kan en levende endotel markør tilstrækkelig gennemtrænge hjertet at mærke nogle af koronar plexus og er synlig i kulturen.
På trods af disse begrænsninger, forventer vi, at denne ex vivo dyrkningsmetode vil være nyttigt for en række applikationer. Den brede vifte af transgene mus linjer, bilry fluorescensmærkede celletyper kunne nemt bruges til at vurdere forskellige aspekter af udviklingen ved hjælp af time-lapse billeddannelse. Yderligere behandling af embryonale hjerter ex vivo med små molekylære forbindelser, hvad enten nye eller allerede er i klinisk anvendelse, vil være let at udføre og efterligner hvordan lægemiddelbehandlinger anvendes i mennesker.
Sammenfattende har vi tilpasset en ex vivo kultur metode til embryonale mus hjerte. Denne teknik giver nem adgang til ellers utilgængelige organer, såsom lever eller nyre, under udvikling og vil give mulighed for manipulation og levende analyse af disse organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Andrea Portbury for kritisk læsning af manuskriptet og NIH (tilskuddet # R01HL061656) til finansiering support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
