Summary
Utviklingsstudier i musen er hemmet av utilgjengelighet av embryoet i løpet av svangerskapet. Å fremme langsiktig kulturen i embryonale hjertet på sene stadier av svangerskapet, har vi utviklet en protokoll der fjernet hjerte er dyrket i en semi-solid, fortynnet Matrigel.
Abstract
Utviklingsstudier i musen er hemmet av utilgjengelighet av embryoet i løpet av svangerskapet. Således, for å isolere og protokoller kultur enkelte organer av interesse er avgjørende for å tilveiebringe en fremgangsmåte for både å visualisere endringer i utvikling og tillater nye behandlingsstrategier. Å fremme langsiktig kulturen i embryonale hjertet på sene stadier av svangerskapet, har vi utviklet en protokoll der fjernet hjerte er dyrket i en semi-solid, fortynnet Matrigel. Dette substrat gir tilstrekkelig støtte til at vedlikeholde den tredimensjonale struktur, men er fleksibel nok til å tillate fortsatt sammentrekning. I korte trekk, blir hjertene skåret ut fra embryoet og plassert i en blanding av kald Matrigel fortynnet 1:1 med vekstmedium. Etter at den fortynnede Matrigel størkner, blir vekstmedium satt til kulturen fatet. Hjerter skåret så sent som embryonale dag 16.5 var levedyktig for fire dager etter disseksjon. Analyse av koronar plexus viser at denne metoden ikkeforstyrre koronar vaskulær utvikling. Dermed presenterer vi en ny metode for langsiktig kultur av embryonale hjerter.
Introduction
Over de siste årene har den transgene mus vært den dominerende modellsystem for å studere utvikling hjertefeil. Imidlertid har andre modell organismer, slik som zebrafisk, vist seg å ha betydelige fordeler fremfor en mus. Tre store fordeler av sebrafisk er den eksterne legging av egg, for enkel tilgang til embryoene, den optiske åpenhet av embryoene, som gir enkel visualisering av hjerte utvikling, og gleden over å bruke små molekylære behandlinger for å modulere utvikling av embryo en. Dermed vil utviklingen av en dyrkningsteknikk som tillot ex utero vekst av en embryonisk organ bypass, i hvert fall delvis, er begrensningene for tiden oppleves av forskaropphald utviklingsprosesser i transgene mus.
Ex vivo kardiale dyrkingssystemer har blitt utviklet i både kylling og mus embryo som tillater behandling med små molekyler og analyse av hvordan diflige områder av hjertet kommunisere 2-6. For hel mus hjerte kultur, hjertene tatt fra embryoer opp til embryonisk (E) 12.5 av alder kan plasseres i kulturmedium med eller uten vuggende 2,3,5. Ved hjelp av denne teknikken, har embryonale hjerter blitt inkubert til likeverdigheten av E13.5, og hjerter dyrket med rocking har blitt opprettholdt så lenge som tre dager (starter på E10.5) tre. Men, har ingen studier rapporterte vellykket kultur av hjerter fra eldre embryoer. Likeledes har redning eksperimenter vært begrenset til å anvende det terapeutiske midlet globalt til kulturmediet 2..
Et stykke kultur system, der hjerter er fjernet, innebygd, og seksjoneres ved hjelp av en vibratome, har også blitt brukt til både yngre hjerter, for eksempel E12.5 mus hjerter og Hamburger-Hamilton stage 36 (ca. E16 i musen) chick hjerter 2,4,6, og eldre hjerter, slik som post-natal og voksen mus hearts og voksne menneskers hjerter 7,8. Mens de embryonale analyser har typisk benyttes 150-mikrometer tykke seksjoner 2,4, kan snittetykkelsen være en stor som 500 mikrometer uten tegn på oksygenmangel åtte. Disse skive kulturer har blitt opprettholdt så lenge som to måneder i kultur, med de fleste skiver opprettholde kontraktilitet i hele denne perioden 9. Sammenlignet med studier i isolerte kardiomyocytter, disse skive kulturer tillate ko-kulturen av kardiomyocytter med de tilstøtende celletyper og gir en nyttig fremgangsmåte for ex vivo analyse. Men disse kulturer krever mer forseggjort oppsett enn ganske enkelt å plassere et hjerte i kultur medium (f.eks innebygging av levende hjerte for snitting på en vibratome), og en hvilken som helst analyse er åpenbart begrenset til den delen av hjertet innen seksjonen.
Gitt de begrensninger som er beskrevet ovenfor for dyrking embryonale mus hjerter og mangfold av transgene mus available for studien, utviklet vi en ex vivo mus hjerte kultur system som ligner på en ex vivo lunge kultur system utviklet av Weaver, tillater et al. 10. Vår kultur system langsiktig kultur og visualisering av ombygging koronar sirkulasjon i hele embryonale mus hjerter. I tillegg gjør bruken av Matrigel perler til å bli holdt på plass i nærheten av hjertet, noe som gir en lokalisert behandling med terapeutiske midler. Disse eksperimenter kan utføres på forskjellige utviklingsstadier tidspunkter for å sammenligne effekten av en gitt behandling på en prosess som for eksempel koronar formasjon. Fordi små molekyler kan diffundere gjennom Matrigel, kan dette kultursystem også brukes til å kultur dissekert regioner av hjertet nær hverandre for å avgjøre om spesifikke celle-celle-kontakter som er nødvendig for visse utviklingsprosesser eller om parakrine signalering fra en region til den andre er nødvendig.
Denne kulturen systemer relativt enkel og, i motsetning til skive kultur-systemet, gjør bruk av grunnleggende kultur reagenser og set-ups som er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier. I korte trekk, ble skåret ut embryonale hjerter dyrket i fortynnet Matrigel, som gir en semi-fast bærer. Denne støtten er tilstrekkelig til å opprettholde den tredimensjonale morfologi av hjertet samtidig tillater hjertet å trekke seg sammen. Ved hjelp av dette systemet, kan hele hjerter fra eldre mus embryoer (E14.5-E16.5) holdes i kultur i opptil fire dager. Hele koronar plexus opprettholdes, i motsetning til i skive kulturer, slik at eventuelle signaliserer signaler som oppstår fra ulike regioner i hjertet fortsatt til stede. Videre kan leve-celle fluorescerende fargestoffer permeat Matrigel for å tillate visualisering av levende hjerte, og protein-konjugerte perler kan plasseres i nærheten av hjertet for å gi en lokalisert kilde signalering. Sammen utgjør disse fordelene gjør denne teknikken en ideell metode for å studere utviklingsprosesser i embryonic mus hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Excising de embryonale Hearts
- Avlive en tidsstyrt gravid musen på ønsket embryonale dag med en godkjent dødshjelp teknikk. Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of North Carolina at Chapel Hill.
- Liberalt spray kvinne med 70% etanol før disseksjon. Åpne kvinnens bukhulen for å hente og avgiftsdirektoratet livmor horn.
- Plasser uterine horn i en petriskål inneholdende kald 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) og skyll etter behov. Klipp opp livmor horn via midtlinjen for å eksponere de vedlagte embryonale sekker.
- Klipp opp en embryonale sac og hente et embryo. Plasser embryoet i en andre petriskål med kald PBS. Returnere petriskål med livmor horn til is.
- Halshogge embryoet å bedre tilgangen til brystveggen. Hvis genotyping er nødvendig, fjerne og lagre halen i en Eppendorf rør plasseres på is.
- Medembryo på ryggen, kutte åpne brystveggen å visualisere hjertet og lungene. Avhengig av stadium, kan brystveggen være gjennomsiktig.
- Løft forsiktig hjerte med tang og kutte fartøyene under. Deretter kuttet over de store fartøyene å frigjøre hjertet. Eventuelt fjerne overflødig vev.
- Plassere hjertet i en brønn av en 24-brønns tallerken fylt med kald PBS og sett formen på is.
- Gjenta de forrige trinnene til hjerter har blitt fjernet fra alle embryoer.
2. Kultur Set-up
- I en laminær hette, kombiner kald Matrigel og den ønskede kultur medium (f. eks 10% føtalt bovint serum (FBS) i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM)) i forholdet 1:1. Ikke forvarme kultur medium.
- Holde fortynnet Matrigel på is, 500-1000 pipette ul av den fortynnede løsning til en brønn av en 24-brønners dyrkings-tallerken som også opprettholdes på is.
- I panseret, nøye plukke opp og plassere den fjernethjerte i en brønn av Matrigel-holdige kultur tallerken samtidig holde kulturen fatet på is.
- Hvis retningen på den innebygde hjerte er avgjørende: Rikelig spray en invertert mikroskop og det omkringliggende plass med 70% etanol. I panseret, plasserer fjernet hjerte i en brønn på Matrigel-holdig kultur plate mens de fortsatt på is. Deretter plasserer platen på et mikroskop og raskt orientere fjernet hjertet som Matrigel begynner å stivne.
- Plasser kultur tallerken i en fuktet 37 ° C inkubator (5% CO2) og tillate Matrigel å stivne i ca 30 min.
- Tilsett 1 ml forvarmet kulturmedium til hver brønn inneholdende et hjerte.
- Hjerter kan forbli i kulturen i minst fire dager. Endring av kulturmediet annenhver dag anbefales.
3. Fiksering og Visualisering
- Hvis ønskelig, legge til et fluorescerende live-cell fargestoff (f.eks Syto-16) for å visualisere levende hjerte. Fotografering vil værebegrenset til den side av hjertet som er synlig basert på den stilling i hvilken den ble innbygget.
- Hvis post-dyrking analyser (f.eks hele mount avbildning eller seksjonering) vil bli utført, fjern kultur medium og erstatte med kald 4% formaldehyd. Sett fatet på is i 30 min.
- Etter den kalde formaldehyd og is fremme oppløsningen av Matrigel, erstatte bindemiddel (og Matrigel) med frisk formaldehyd og fikse hjerter over natten ved 4 ° C.
- Vask hjertene med buffer (f.eks PBS eller Tris) og oppbevar ved 4 ° C inntil videre analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne teknikken, opprettholder sitt hjerte tredimensjonale morfologi og forblir levedyktig, som indikert av fortsatt sammentrekninger (Movie 1). Disse sammentrekningene er gjennomgående mer fremtredende i atriene enn i ventriklene. Etter kultur, kan hjerter være fast og bearbeidet for histologi eller enten immunhistokjemi for å undersøke ekspresjon spesifikk markør eller strukturer. Figur 1A viser undersiden av ventriklene og store arterier av en embryonisk mus hjertet som ble dyrket i 24 t, fast, og bearbeidet for immunohistokjemi å merke endotelet. Disse konfokale mikrografer viser at koronar blodkar synes ligner på et hjerte skåret ut fra en relativt alderen embryo som ble opprettholdt i fosterlivet (figur 1B). Men koronar fartøy i hjertet kultivert ex vivo gjøre vises mindre enn i hjertet som ble opprettholdt i livmoren. I begge hjerter, the toppunktene av ventriklene ble fjernet for å gi bedre tilgang av antistoffene til vevet.
Hematoxylin og eosin (H & E) analyse av hjerter skåret på E16.5 og kultivert ex vivo for 4 d viser at den samlede morfologi, inkludert vegger i store arterier (Figur 2A) og ventrikulære og interventricular septal hjertemuskelen (figur 2B) av hjertet forblir intakt. Til tross for mangel på sirkulasjon, koronar Ostia er tydelig (Figur 2A). Imidlertid DNA-fragmentering, observert både med H & E (figurene 2A, 2B) og DAPI (data ikke vist), er åpenbart i den kompakte myokardium og rundt de store fartøyene. Videre er myocardium mindre tetthet enn for et hjerte fra en E18.5 embryo som utvikles in utero (figur 2C, 2D), selv om den ex vivo kultivert hjerte ble fortsatt slo. Dermed er det begrensninger på lengdenav tid til eller scenen der disse hjertene kan opprettholdes.
Denne kulturen teknikken kan også brukes til å merke fluorescensmerket hjertene i kultur. I dette tilfellet blir hjertene dyrket i 48 timer etter å ha blitt inkubert med en endotelial-spesifikke fluorescerende fargestoff. I dette tilfellet, er visualisering begrenset basert på retningen på hjertet og tettheten av vev (Tall 3A, 3B). Men senere histologiske snitt gjennom ventrikkel myokard bekrefte at dette fluorescerende molekyl kan trenge gjennom ytre cellelagene å merke sub-epikardiale fartøy innenfor ventriklene (Tall 3C, 3D), og dette fluorescerende fargestoff colocalizes med iso-lektin (Figur 3D).
Figur 1. Utvikling vises normalt i ex vivo forhold. (A) Etter 24 timer på kultur, var ex vivo hjerter fra E14.5 embryoer fast, merket med en endotelial markør (grønn), ryddet, og avbildes med konfokalmikroskopi. Lungearterien (PA), aorta (Ao), og bunnen av hjertet er vist. (B) Hjerter skåret ut fra E15.5 embryo som utviklet seg i livmoren ble likeledes behandlet. Scale bar, 100 mikrometer.
Figur 2. Morfologi er grovt opprettholdes under ex vivo kultur. (A, B) Hjerter ble fjernet fra E16.5 embryoer og kultivert ex vivo for 4 dager. Hjerter ble så seksjonert og farget med hematoksylin og eosin (H & E). (A) et tversgående snitt som viser justeringen av aorta (Ao) og lungearterien (PA). En av koronar Ostia (pilspiss) er synlig. Hjertemuskelen suravrunding aorta er mindre tett enn i kontrollgruppen (C), og noen kjernefysiske fragmentering (pil) er også til stede. (B) Den generelle morfologi av kompakt myokard av ventriklene og septum (IVS) vises normalt, men myokard har mindre tetthet enn i kontrollgruppen (D), og noen nukleær fragmentering (pil) er tydelig i IVS. (C, D) For sammenligning blir frontpartiet H & E-fargede seksjoner fra en E18.5 hjerte vist. (C) En koronar ostium er observert ved siden av Ao (pilspiss). (D) at septum er godt definert. Scale bar, 70 mikrometer.
Figur 3. Ex vivo hjerter kan fluorescensmerkede under kultur. (A, B) Etter 48 timer i kultur, ex vivo hjerter fraE16.5 embryoene ble inkubert med Syto 16 (grønn) i 1 time, og fluorescens kunne observeres så sent som 48 timer etter inkubering. (C, D) Denne fluorescens ble opprettholdt gjennom frosset seksjonering og kunne observeres i de subepicardial epitelceller i ventrikkel myokard. I D ble seksjonen i ventrikkel myokard co-merket med iso-lektin (rød). De iso-lektin co-etiketter grønne Syto 16-positive celler (piler) og også etiketter skip innen hjertemuskelen som ikke ble farget med Syto 16. AB, 4x forstørrelse; skala bar i CD, 120 mikrometer.
Movie 1. Etter ex vivo dyrkning for 30 timer, viser et hjerte skåret ut fra en E14.5 embryo konsekvent kontraktilitet og pacing mellom atriene og ventriklene. Klikk her for å se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende kultur-systemet utgjør betydelige fordeler for embryonale mus hjerte studier. Denne kulturen system bevarer hjertets kontraktilitet og koronar plexus, med begrensede tegn på nekrose, selv etter fire dager i kultur. Videre tilveiebringer den halvfaste matriks tilstrekkelig støtte til at vedlikeholde den tredimensjonale morfologi av utvikling av hjertesykdom, samtidig som fleksibiliteten å trekke seg sammen og også for å holde belagte perler på plass under kultur. Til tross for denne støtte, er denne matrise permeabelt for fluorescerende fargestoffer som Syto 16, slik at fluorescerende analyse av levende hjerte.
Stykke kultur metoder plassere hjertet seksjon, som inneholder dens parti av koronar plexus, på en porøs membran ved en luft-væske-grensesnittet for å opprettholde oksygenering ved kapillærvirkning 7.. I kontrast til tidligere hele hjertet kultur metoder stole på rocka og begrenset studier til embryonale aldre før en funksjonell koronar vasculature er nødvendig 2,3,5. Ved hjelp av den nåværende teknikk, kan imidlertid hjerter lett dyrkes etter koronar plexus har dannet uten den ekstra kompleksitet av en luft-væske-grensesnittet.
Til tross for våre bekymringer at sen embryonale hjerter (f.eks E16.5) skulle bli nekrotisk etter en lengre periode i kultur, ble bare begrenset nekrose observert etter fire dager med kultur (dvs. tilsvarende en post-natal dag en hjerte). Den opprinnelige protokollen, som utføres ved hjelp av embryonale lunge knopper, rapporterte 10 ingen nekrose, men også utnyttes lungene fra tidligere iscenesatt embryoer. Således kan nekrose unngås ved å begrense undersøkelser til tidligere embryonale tidspunkter.
Denne ex vivo kultur Systemet har begrensninger. Etter to dager i kultur, begynner epikardet sprer seg til matriksen, og i løpet av fire dager, festes den epikardet til kultur tallerken. Fordi epicardial utvekst does ikke påvirke visualisering, derimot, kan dette problemet være av sentral betydning for å epikardiale studier. På scenene analysert dette dokumentet (E14.5-E16.5), har epikardet lengst omfattet hjertet 11 og ga signaler til å utvikle plexus 12, derfor gjør sitt utvekst ikke ut til å ha negative effekter på koronar plexus. Videre hjertene i kultur ser ut til å slutte å vokse større som deres i fosterlivet kolleger. En annen begrensning er at den embryonale mus hjerte er ikke gjennomsiktig som sebrafisk embryo. Noen live visualisering er dermed begrenset til det som kan observeres på de ytre lag av hjertet. Imidlertid kan en live endotelial markør tilstrekkelig gjennomsyre hjertet til å merke noe av koronar plexus og er synlig i kultur.
Til tross for disse begrensningene, forventer vi at denne ex vivo kultur metoden vil være nyttig for en rekke programmer. Den bredt utvalg av transgene mus linjer som bilry fluorescensmerkede celletyper kan enkelt brukes til å vurdere ulike sider ved utviklingen ved hjelp av time-lapse imaging. Videre behandling av embryonale hjerter ex vivo med små molekylære forbindelser, enten roman eller allerede er i klinisk bruk, vil være lett å gjennomføre, og etterligner hvordan medikamentell behandling brukes hos mennesker.
Avslutningsvis har vi tilpasset en ex vivo-metode for kulturen den embryoniske mus hjerte. Denne teknikken vil tillate lett tilgang til ellers utilgjengelige organer, slik som lever eller nyre, under utvikling og vil tillate for manipulering og levende analyse av disse organene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Andrea Portbury for kritisk lesing av manuskriptet og NIH (tilskudd # R01HL061656) for finansiering støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
