Summary
Utvecklingsstudier på mus hämmas av otillgänglighet av embryot under dräktigheten. Att främja långsiktig odling av embryonala hjärtat vid sena stadier av dräktigheten, utvecklade vi ett protokoll där det utskurna hjärtat odlas i ett halvfast, utspädd Matrigel.
Abstract
Utvecklingsstudier på mus hämmas av otillgänglighet av embryot under dräktigheten. Således, för protokoll isolera och kultur enskilda organ av intresse är viktigt att ge en metod för både visualisera förändringar i utvecklingen och möjliggöra strategier nya behandlingsstrategier. Att främja långsiktig odling av embryonala hjärtat vid sena stadier av dräktigheten, utvecklade vi ett protokoll där det utskurna hjärtat odlas i ett halvfast, utspädd Matrigel. Detta substrat ger tillräckligt stöd för att bibehålla den tredimensionella strukturen men är flexibel nog att tillåta fortsatt kontraktion. I korthet, är hjärtan skars ut från embryot och placerades i en blandning av kall Matrigel utspädd 1:1 med tillväxtmedium. Efter den utspädda Matrigel stelnar, är tillväxt medium till kulturen skålen. Hjärtan utskurna så sent som embryonala dag 16,5 var lönsamt för fyra dagar efter dissekering. Analys av koronar plexus visar att denna metod intestöra koronar vaskulär utveckling. Således presenterar vi en ny metod för långsiktig odling av embryonala hjärtan.
Introduction
Under de senaste åren har den transgena musen varit den dominerande modellen för att studera defekter utveckling hjärta. Däremot har andra modellorganismer såsom zebrafisk, visat sig ha betydande fördelar jämfört med musen. Tre stora fördelar med zebrafisk är externa utläggning av ägg, för enkel åtkomst till de embryon, den optisk transparens av embryona, som möjliggör enkel visualisering av hjärt-utveckling, och lättheten att applicera små molekylära behandlingar för att modulera utvecklingen av embryot ett. Sålunda skulle utvecklingen av en kultur teknik som tillät tillväxt ex utero av en embryonal orgel förbi, åtminstone delvis, de begränsningar som för närvarande upplevs av forskare som studerar utvecklingsprocesser hos transgena möss.
Ex vivo hjärt kultur har utvecklats i både brud och musembryo som tillåter behandling med små molekyler och analys av hur DIFka regioner i hjärtat kommunicera 2-6. För hela mushjärta kultur, hjärtan tas från embryon upp till embryonala (E) kan 12,5 av ålder placeras i odlingsmedium med eller utan gungande 2,3,5. Med denna teknik har embryonala hjärtan framgångsrikt inkuberas för att likvärdigheten av E13.5, och hjärtan odlade med gungande har upprätthållits så länge som tre dagar (med början vid E10.5) 3. Dock har inga studier rapporterade framgångsrik kultur av hjärtan från äldre embryon. Likaså har räddnings experiment varit begränsade till att tillämpa det terapeutiska medlet globalt till odlingsmediet 2.
En bit kultur-system, där hjärtan skärs, inbäddade, och snittades med en vibratome, har också använts för både yngre hjärtan, såsom E12.5 mus hjärtan och Hamburger-Hamilton steg 36 (cirka E16 i mus) chick hjärtan 2,4,6 och äldre hjärtan, såsom postnatal och vuxen mus hearts och vuxna människors hjärtan 7,8. Medan de embryonala analyserna har typiskt utnyttjat 150-ìm tjocka sektioner 2,4, kan snittjocklek vara en stor som 500 nm utan tecken på syrebrist 8. Dessa slice kulturer har upprätthållas så länge som två månader i kultur, med de flesta skivor upprätthålla kontraktilitet under hela denna period 9. Jämfört med studier i isolerade hjärtmuskelceller, dessa slice kulturer tillåter samodling av hjärtmuskelceller med sina grannländer celltyper och ger en användbar metod för ex vivo analys. Emellertid dessa kulturer kräver mer genomarbetade ställt upp än att helt enkelt placera ett hjärta i odlingsmedium (t.ex. inbäddning av levande hjärta för sektionering på en vibratom), och någon analys är naturligtvis begränsad till den del av hjärtat inom sektionen.
Med tanke på de begränsningar som beskrivits ovan för odling embryonala mus hjärtan och den rikedom av transgena möss available för studien, utvecklade vi en ex vivo mussystem hjärta kultur liknar en ex vivo lung kultur som utvecklats av Weaver, tillåter et al. 10 Vår kultur systemet långsiktigt kultur och visualisering av ombyggnad kranskärlscirkulation inom hela embryonala mus hjärtan. Dessutom tillåter användning av Matrigel pärlor att hållas på plats nära hjärtat, vilket ger en lokaliserad behandling med terapeutiska medel. Dessa experiment kan utföras vid olika utvecklingsstadier tidpunkter för att jämföra effekten av en viss behandling på en process såsom kransartär bildning. Eftersom små molekyler kan diffundera genom Matrigel, kan denna kultur systemet även användas för att kulturen dissekerade regioner i hjärtat nära varandra för att avgöra om specifika cell-cell kontakter är nödvändiga för vissa utvecklingsprocesser eller om parakrina signalering från en region till en annan är nödvändigt.
Detta odlingssystemär relativt enkel och, till skillnad från den bit kultur-systemet, använder sig av grundläggande kultur reagenser och uppställningar som är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. I korthet, är exciderade embryonala hjärtan odlades i utspädd Matrigel, som ger en semi-fast bärare. Detta stöd är tillräckligt för att bibehålla den tredimensionella morfologi av hjärtat samtidigt som den tillåter hjärtat att dra ihop sig. Med detta system kan hela hjärtan från äldre musembryon (E14.5-E16.5) hållas i odling under upp till fyra dagar. Hela koronar plexus bibehålls, till skillnad mot i slice kulturer, så alla signalering ledtrådar som uppstår från olika regioner av hjärtat förbli närvarande. Vidare kan live-cell fluorescerande färgämnen genomsyrar Matrigel att möjliggöra visualisering av levande hjärta, och protein-konjugerade pärlor kan placeras nära hjärtat för att ge en lokaliserad signalering källa. Tillsammans, dessa fördelar gör denna teknik en idealisk metod för att studera utvecklingsprocesser i Embryonenic mushjärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Excising embryonala Hearts
- Euthanize en tidsanpassad gravid musen på önskad embryonala dag med godkänd dödshjälp teknik. Alla experiment har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of North Carolina at Chapel Hill.
- Liberally spraya hona med 70% etanol före dissektion. Öppna honans bukhåla att hämta och punktskatter livmoderhornet.
- Placera livmoderhornet i en petriskål med kall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skölj efter behov. Skär öppna livmoderhornet via mittlinjen för att exponera de bifogade embryonala säckar.
- Skär upp ett embryo sac och hämta ett embryo. Placera embryot i en andra petriskål med kall PBS. Returnera petriskål med livmoderhornet till is.
- Halshugga embryot att förbättra tillgången till bröstkorgen. Om genotypning är nödvändigt, ta bort och spara svansen i ett Eppendorf-rör placeras på is.
- Med denembryo på ryggen, skära upp bröstkorgen för att visualisera hjärtat och lungorna. Beroende på scenen, får bröstkorgen vara transparent.
- Lyft försiktigt hjärtat med pincett och skär fartygen nedan. Sedan skär över de stora fartygen att befria hjärtat. Om det behövs, ta bort främmande vävnad.
- Placera hjärtat i en brunn på en 24-bra maträtt fylld med kall PBS och placera skålen på is.
- Upprepa föregående steg tills hjärtan har skurits ut från alla embryon.
2. Kultur Set-up
- I ett laminärt huva, kombinera kall Matrigel och den önskade kulturen medium (t.ex. 10% fetalt bovint serum (FBS) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)) i förhållandet 1:1. Gör inte pre-varmt odlingsmedium.
- Att hålla den utspädda Matrigel på is, pipett 500-1000 il av den utspädda lösningen i en brunn i en 24-väl kultur maträtt som också upprätthålls på is.
- I huven, försiktigt plocka upp och placera den utskurnahjärta i en brunn på Matrigel-innehållande kulturen skålen samtidigt som kulturen skålen på is.
- Om orienteringen av den inbäddade hjärta är avgörande: Liberally spraya ett inverterat mikroskop och det omgivande utrymmet med 70% etanol. I huven, placera den utskurna hjärtat i en brunn på Matrigel-innehållande odling plattan samtidigt på is. Sedan, placeras plattan på ett mikroskop och snabbt orientera det utskurna hjärtat som Matrigel börjar stelna.
- Placera odlingsskål i en fuktad 37 ° C inkubator (5% CO2) och låt Matrigel stelna under ca 30 minuter.
- Tillsätt 1 ml förvärmda odlingsmedium till varje brunn innehållande ett hjärta.
- Hjärtan kan förbli i odling under minst fyra dagar. Ändra odlingsmedium varannan dag rekommenderas.
Tre. Fixering och visualisering
- Om så önskas, tillsätt en fluorescerande live-cell färgämne (t.ex. Syto-16) för att visualisera den levande hjärta. Photo kommer att varabegränsad till den sida av hjärtat som är synlig utifrån den position i vilken den var inbäddad.
- Om efter odling analyser (t.ex. hela montera avbildning eller sektionering) kommer att utföras, ta bort odlingsmedium och ersätta med kall 4% formaldehyd. Placera skålen på is i 30 minuter.
- Efter den kalla formaldehyd och is främja upplösning av Matrigel, byt ut fixativ (och Matrigel) med färsk formaldehyd och fixa hjärtan över natten vid 4 ° C.
- Tvätta hjärtan med buffert (t.ex. PBS eller Tris) och förvara vid 4 ° C tills vidare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denna teknik, bibehåller hjärtat dess tredimensionella morfologi och förblir livskraftiga, såsom indikeras av fortsatta sammandragningar (Film 1). Dessa sammandragningar är genomgående mer framträdande i förmaken än i kamrarna. Efter kultur, kan hjärtan fastställas och behandlas för antingen immunohistokemi eller histologi att undersöka specifik markör uttryck eller strukturer. Visar basen av ventriklarna och stora artärer i en embryonal mus hjärta som odlades under 24 timmar, fast Figur 1A, och behandlas för immunohistokemi att märka endotelet. Dessa konfokala micrographs visar att kranskärlen verkar liknar ett hjärta ut från en jämförelsevis åldern embryo som hölls i livmodern (Figur 1B). Men kranskärlen i hjärtat odlade ex vivo förefaller mindre än i hjärtat som hölls i livmodern. I båda hjärtan, the spetsar ventriklarna avlägsnades för att medge bättre åtkomst av antikropparna till vävnaden.
Hematoxylin och eosin (H & E)-analys av hjärtan exciderade vid E16.5 och odlades ex vivo för 4 d visar att den totala morfologi, inklusive väggarna av stora artärer (Figur 2A) och den ventrikulära och interventrikulära septal myokardium (Figur 2B) av hjärtat förblir intakt. Trots bristen på cirkulation, den coronary ostia är uppenbara (Figur 2A). Men DNA-fragmentering, observerade både med H & E (Fig. 2A, 2B) och DAPI (data visas ej), är tydlig i den kompakta myokardiet och kring de stora kärlen. Vidare är hjärtmuskeln mindre tät jämfört med ett hjärta från en E18.5 embryo som utvecklas i livmodern (figurerna 2C, 2D), även om den ex vivo odlade hjärta fortfarande slog. Således, det finns begränsningar med längdentid för eller i vilket skede dessa hjärtan kan upprätthållas.
Denna kultur teknik kan också användas för att fluorescerande märka hjärtan medan i kultur. I detta fall är hjärtan odlas under 48 timmar efter att ha inkuberats med en endotel-specifik fluorescerande färgämne. I detta fall, är visualisering begränsad baserad på orienteringen av hjärtat och opacitet av vävnaden (figurerna 3A, 3B). Emellertid har en del histologiska sektioner genom det ventrikulära myokardium bekräfta att denna fluorescerande molekyl kan penetrera de yttre cellskikten att märka sub-epikardiella fartyg inom ventriklarna (figurerna 3C, 3D), och detta fluorescerande färgämne colocalizes med iso-lektin (figur 3D).
Figur 1. Utvecklingen verkar normalt i ex vivo förhållanden. (A) Efter 24 timmar i kultur, var ex vivo hjärtan från E14.5 embryon fast, märkt med en endotel markör (grön), rensas, och avbildas med konfokalmikroskopi. Den lungartären (PA), aorta (Ao), och basen i hjärtat visas. (B) Hjärtan utskurna från E15.5 embryon som utvecklas i livmodern på samma sätt behandlades. Skala bar, 100 pm.
Figur 2. Morfologi är grovt upprätthålls under ex vivo kultur. (A, B) skars ut från E16.5 embryon och odlade ex vivo i 4 dagar Hearts. Hjärtan var därefter snittades och färgades med hematoxylin och eosin (H & E). (A) En tvärgående snitt som visar inriktningen av aorta (Ao) och pulmonell artär (PA). En av den koronara ostia (pilspets) är synlig. Den myokardium suravrundning aorta är mindre tät än i kontrollgruppen (C), och en del kärn fragmentering (pil) är också närvarande. (B) Den totala morfologi kompakta hjärtmuskeln av kamrarna och kammarskiljeväggen (IVS) verkar normalt, men hjärtmuskeln är mindre tätt än i kontrollgruppen (D), och några nukleära fragmentering (pil) framgår i IVS. (C, D) För jämförelse är frontal H & E-färgade snitt från en E18.5 hjärta visas. (C) En koronarostium observeras intill Ao (pilspets). (D) kammarskiljeväggen väl definierad. Skala bar, 70 pm.
Figur 3. Ex vivo hjärtan fluorescent kan märkas under kultur. (A, B) Efter 48 timmar i kultur, ex vivo hjärtan frånE16.5 embryon inkuberades med Syto 16 (grön) under 1 timme, och fluorescens kunde observeras så sent som 48 timmar efter inkubation. (C, D) Denna fluorescens upprätthölls genom fryst sektionering och kunde observeras i subepicardial epitelceller inom det ventrikulära myokardiet. I D, var sektionen inom ventrikulära hjärtmuskeln co-märkt med iso-lektin (röd). De iso-lektin co-etiketter de gröna Syto 16-positiva celler (pilar) och även etiketter fartyg inom hjärtmuskeln som inte färgades med Syto 16. AB, 4x förstoring, skala bar på CD, 120 nm.
Film 1. Efter ex vivo odling för 30 timmar, visar en hjärta ut från en E14.5 embryo konsekvent kontraktilitet och stimulering mellan förmak och kammare. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande kultur-systemet innebär stora fördelar för embryonala studier mushjärta. Denna kultur systemet bevarar myokardkontraktilitet och koronar plexus, med begränsade tecken på nekros, även efter fyra dagar i odling. Vidare ger den halvfasta matrisen tillräckligt stöd för att bibehålla den tredimensionella morfologi utveckla hjärtat samtidigt som flexibiliteten till avtal och även att hålla belagda kulor på plats under kultur. Trots detta stöd, är denna matris permeabel för fluorescerande färgämnen såsom Syto 16, vilket tillåter fluorescerande analys av levande hjärta.
Slice odlingsmetoder placera hjärtat avsnittet innehåller sin del av koronar plexus, på ett poröst membran vid en luft-vätska gränssnitt för att bibehålla syresättning genom kapillärkraften 7. Däremot tidigare hela hjärtat odlingsmetoder förlitar sig på gungande och begränsade studier på embryonala åldrar innan ett funktionellt koronar vasculature är nödvändigt 2,3,5. Med hjälp av nuvarande teknik är emellertid kan hjärtan lätt odlas efter koronar plexus har bildats utan den ytterligare komplexiteten i en luft-vätske-gränssnitt.
Trots våra farhågor att sena embryonala hjärtan (t.ex. E16.5) skulle bli nekrotisk efter en längre tid i kultur, var endast begränsad nekros observerades efter fyra dagars odling (dvs motsvarande en postnatal dag 1 hjärta). Den ursprungliga protokollet, som utförs med hjälp av embryonala lunga knoppar, anmälde 10 ingen nekros men också utnyttjade lungor från tidigare iscensatt embryon. Således kan nekros undvikas genom att begränsa studierna till tidigare embryonala tidpunkter.
Detta ex vivo kultur-systemet har begränsningar. Efter två dagar i kultur, börjar epikardium sprider sig till matrisen, och inom fyra dagar, fäster epikardium till odlingsskålen. Eftersom epicardial utväxt does inte påverkar visualisering kan dock frågan vara av största vikt för epikardiella studier. Vid stegen analyseras häri (E14.5-E16.5), har epikardium länge sedan omfattade hjärtat 11 och förutsatt signaler till utvecklingsländerna plexus 12, alltså, inte dess utväxt inte verkar ha negativa effekter på hjärt plexus. Vidare, hjärtan i kultur verkar sluta växa större som deras in utero motsvarigheter. En annan begränsning är att den embryonala mus hjärta är inte transparent som zebrafisk embryot. Varje levande visualisering är således begränsad till vad som kan observeras på de yttre skikten av hjärtat. Däremot kan en levande endothelial markör genomsyra tillräckligt hjärtan att märka några av de koronara plexus och är synliga i kulturen.
Trots dessa begränsningar, räknar vi med att denna ex vivo kultur metod kommer att vara användbart för ett antal tillämpningar. Den stora variationen av transgena möss linjer som bilry fluorescerande celltyper kan lätt användas för att bedöma olika aspekter av utveckling med hjälp av time-lapse avbildning. Vidare behandling av embryonala hjärtan ex vivo med små molekylära föreningar, vare sig nya eller redan är i klinisk användning, kommer att vara lätt att åstadkomma och härmar hur läkemedelsbehandlingar tillämpas på människor.
Sammanfattningsvis har vi anpassat en ex vivo metod kultur för embryonala mus hjärta. Denna teknik kommer att ge enkel tillgång till annars oåtkomliga organ, såsom lever eller njure, under utveckling och kommer att möjliggöra manipulering och live-analys av dessa organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Andrea Portbury för kritisk läsning av manuskriptet och NIH (bidrag # R01HL061656) för finansieringsstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
