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Biology

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Abstract

Arginina-vasopressina (AVP), facilita a reabsorção de água por renal coletando células principais do duto e, assim, afina corpo homeostase da água. AVP se liga aos receptores de vasopressina V2 (V2R) na superfície das células e, assim, induz a síntese de cAMP. Este estimula a processos de sinalização intracelular que conduzem a alterações na fosforilação do canal de água aquaporina-2 (AQP2). Proteína cinase A phoshorylates AQP2 gerando assim a translocação de AQP2 de vesículas intracelulares para a membrana plasmática facilitar a reabsorção de água a partir da urina primária. Aberrações de libertação da AVP sinalização pituitária ou AVP-activado em células principais podem causar insipidus nefrogénica centrais ou diabetes, respectivamente, um nível elevado de AVP plasma sanguíneo está associada com doenças cardiovasculares, tais como insuficiência cardíaca crónica e síndroma de secreção inapropriada de hormona antidiurética.

Aqui, apresentamos um protocolo para cultivatino de rato principal coletor medular interno células do duto (IMCD), que expressa V2R e AQP2 endogenamente. As células são adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes ao controlo das AQP2 e, portanto, para descobrir novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da reabsorção de água mediada por AVP. IMCD células são obtidas a partir de ratos medulas interior renal e são utilizados em experiências de seis a oito dias após a semeadura. IMCD células podem ser cultivadas em placas de cultura de células normais, frascos e placas de micro-titulação de formatos diferentes, o procedimento requer apenas algumas horas, e é apropriado para laboratórios de cultura de células padrão.

Introduction

Na recolha de células renais de condutas principais, a arginina-vasopressina (AVP) controla a reabsorção de água, estimulando a inserção do canal de água aquaporina-2 (AQP2) na membrana plasmática. AVP se liga à proteína acoplada vasopressina tipo-2, receptor de G (V2R) estimular a adenilil ciclase e assim a formação de AMPc. Iniciação desta cascata de sinalização conduz à activação da proteína quinase A (PKA). PKA fosforila AQP2 na serina 256 (S256), que é o factor chave para a sua redistribuição intracelular de vesículas na membrana plasmática. A inserção da membrana facilita a reabsorção de água ao longo de um gradiente osmótico e afina corpo homeostase da água.

Desregulação da reabsorção de água AVP-mediada, devido a aberrações da secreção de AVP ou causas sinalização AVP ativados ou está associada a doenças graves. Diminuição da reabsorção de água causada por mutações de V2R ou AQP2 leva a diabetes insípido nefrogênico, enquanto um elevnível AVP plasma sanguíneo decido está associada a reabsorção excessiva de água em doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca crônica ea síndrome da secreção do hormônio antidiurético inapropriado (SIADH).

O significado da reabsorção de água mediada por AVP resulta não só a partir da sua implicação na doença. A translocação AVP induzida por vesículas AQP2-rolamento e fusão com a membrana plasmática representa um processo exocitica estritamente cAMP-dependente, o que atualmente não é bem compreendida. Outros exemplos de um exocitose dependente de AMPc são a secreção de renina a nível renal, secreção de H + no estômago. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares que regulam a AQP2-translocação em células renais principais não só ajuda a compreender os processos moleculares semelhantes em outros tipos de células, mas também pode abrir o caminho para novas terapias para o tratamento de doenças associadas a distúrbios da reabsorção de água mediada por AVP .

Elucidating AQP2 mecanismos de controle requer a coleta principais modelos de células do duto. Por isso, uma série de diferentes linhas de células de rim de mamífero estão disponíveis. No entanto, estes modelos têm vários inconvenientes. Em muitos sistemas de célula o nível de proteína AQP2 é baixa (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, outros ectopicamente superexpressam humanos (MCD4, WT10) ou 11,12 rato (CD8) 13 AQP2. Em MCD4 e células COS-7 do receptor V2 não é expresso. Para o nosso conhecimento, não há linha de células permanente como um modelo disponível, que é derivada da recolha da medula renal conduta interior, a parte do rim onde AQP2 expressão é mais abundante, mas a partir da conduta de recolha cortical 1,11,13-16 . Tais modelos de células são por exemplo os mpkCCD imortalizada utilizada (por exemplo, 17) ou os mTERT CCD 14 linhas de células recentemente estabelecidas. Ambas as linhas de células endogenamente AQP2 expressa e V2R, mas uma vez que eles são derivados daduto coletor cortical provavelmente conter um proteoma diferente em relação ao coletor medular interno células do duto (IMCD). Eles devem, por exemplo, expressar diferente Na + sistemas de transporte.

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura de células primárias IMCD expressando V2R e AQP2 endogenamente. Este modelo, portanto, representa mais de perto a situação fisiológica no ducto coletor renal. Como estabelecer a cultura exige apenas padrão de laboratório, equipamento de outros laboratórios podem facilmente adotar essa abordagem.

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Protocol

1. Preparação

  1. Preparar os pratos de cultura
    1. Descongelar colagénio Tipo IV O / N a 4 ° C e dissolvem-se em 0,1% de ácido acético estéril. O volume a ser usado depende do tipo e número de pratos em que as células estão a ser semeadas. Use 2 mg / cm 2.
    2. Incubar pratos, pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com água destilada (A. tridest).
    3. Permitir que os pratos para secar adequadamente.
  2. A suplementação do meio de
    1. Aumento do nível de glicose de até 4,5 g / l através da adição de 1,75 g de glicose a 500 ml de meio. Para ajustar o meio a 600 mosmol, adicionar NaCl 100 mM e 100 mM de ureia, para aumentar a osmolaridade de 200 mosmol e 100 mOsmol, respectivamente.
    2. Adicionar 1% de ácidos aminados não essenciais, 1% ultroser, dbcAMP 500 uM, 20 U / ml nistatina e 0,25 ug / ml de gentamicina (diluição 1:200 de uma solução de estoque com uma concentração de 50 ug / ml) a 600 mosmol meio DMEM frescos no dia da preparação.
    Solução de enzima
    1. Adicionar 1 mg / ml de hialuronidase e 2,2 mg / ml de colagenase de DPBS contendo 0,25 ug / ml de gentamicina e nistatina. Prepare 1 ml desta solução de enzimas para a digestão de 2 rim medulas interior. A solução deve ser esterilizada por filtração e armazenada em tubos Falcon de 50 ml.

2. Cultivo de Rat primária ducto coletor medular interno (IMCD) Células

Todos os procedimentos de manuseio de animais devem ser realizadas em conformidade com a legislação local e federal.

  1. Anestesiar ratos em CO 2 (numa caixa saturado com CO 2) e isoflurano (U-400 Anestesia unidade, Univentor Ltd., de Malta, fluxo de ar de 350-400 ml / min, com 2-2,5% de isoflurano). Decapitar os animais para o sangramento, que permite a detecção exata da fronteira entre a esbranquiçada interior ea medula externa mais escura. Além disso, a hemorragia minimiza o número de eritrócitos isolados. Remover e rinslavá-los em DPBS estéril suplementado com gentamicina e nistatina (ver acima) em gelo. Todas as outras etapas devem ser realizadas em condições bancada limpa estéreis.
  2. Transferir os rins a partir da solução de DPBS para uma compressa esterilizada para remover o líquido em excesso. Retire a cápsula renal graxos com uma pinça e tesouras estéreis.
  3. Tendo o rim ainda fixado na compressa, cortar ligeiramente ao lado do eixo longitudinal do lado exterior (cortical). Certifique-se de não cortar completamente, mas para deixá-lo em uma peça, conectado na pelve renal.
  4. Com tesoura curva dissecar cuidadosamente o medulas interior esbranquiçada, que está cercado pela rosé cintilante medula externa. Recolhe-los em DPBS contendo gentamicina e nistatina em uma placa de cultura de 60 milímetros em gelo.
  5. Uma vez que todos medulas são isoladas e recolhidas em gelo, reduzir o volume de DPBS para um nível em que são cobertos apenas com tampão. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar o medulas em cubos de 53 mm.
  6. Derreta e volta a ponta de uma pipeta Pasteur estéril, segurando-o brevemente em uma chama. Certifique-se que a pipeta é resfriado antes de continuar.
  7. Transferir a suspensão de tecido para os tubos Falcon de 50 ml contendo solução de enzima esterilizada preparados com hialuronidase e colagenase (ver 1.3.1), usando o arredondado pipeta Pasteur. Fechar hermeticamente a tampa e incubar a 37 ° C, sob agitação contínua (220 rpm) num banho de água de mesa regular para 1,5-2 horas.
  8. Por trituração da suspensão, pipetar a mistura para cima e para baixo várias vezes, com a pipeta de Pasteur rodada (veja acima) até a suspensão se tornar homogénea turva.
  9. Centrifugar a suspensão durante 5 min a 300 xg e 16 ° C. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o pellet cuidadosamente em DPBS contendo gentamicina e nistatina e centrifugar novamente. Repetir esta etapa de lavagem uma vez.
  10. Ressuspender as células em meio totalmente completada e semente-los em cultura pratos e / ou chapas de microtitulação assim. A preparação de 2 medulas (1 animal) irá produzir células suficientes para um prato de cultura de 60 mm.
  11. Após 24 horas, lave as células duas vezes com 600 mosmol DMEM e adicione meio fresco. Durante a semana seguinte as células deverão ser lavadas 2-3 vezes (Figura 1). 6-8 dias após a sementeira, as células IMCD pode ser utilizado para experiências. Recorde incubar em meio sem dbcAMP e nistatina durante 24 horas antes de começar a experiência. Caso contrário AQP2 será exclusivamente localizado na membrana de plasma.

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Representative Results

O sucesso do cultivo de células primárias de rato IMCD resultará numa monocamada confluente de 6-8 dias após a sementeira (Figura 2). Por 60 milímetros prato de cultura há aproximadamente 6 x 10 6 células. As células firmemente aderir às placas de cultura, uma vez que estes foram revestidos com colagénio do tipo IV, um componente da membrana basal 18. Portanto, as células IMCD não irá separar mesmo durante vários procedimentos de lavagem cuidadosa. Até 80% das células cultivadas expressam endogenamente e V2R AQP2. Estas são as células principais, enquanto que as células com falta AQP2 são consideradas células intercaladas, células não-IMCD derivados de membros finos da ansa de Henle, vasa recta ou células medulares intersticiais interiores. Como já mostrado anteriormente, a osmolaridade média de 600 mosmol impede down-regulação da AQP2 19. Além disso, a expressão AQP2 é mantida, completando o meio com o cAMP de membrana permeável ao análogo dbcAMP. Para reduzir o plasma memb AQP2expressão Rane, favorecendo assim a sua localização intracelular IMCD as células devem ser mantidas sem dbcAMP aproximadamente 24 hr antes de experimentos. Se a maioria dos AQP2 está localizada na membrana plasmática em condições de controlo, o tempo de cultivo dbcAMP livre deve ser prolongada. Lise de células cultivadas em placas de 60 mm de cultura nos buffers padrão produz 1,5 mg de proteína de 10.

Por estimulação de curto prazo (30 minutos) com AVP ou forscolina, um activador directo de adenilil-ciclase, AQP2 transloca de vesículas intracelulares para a membrana plasmática (Figura 2). Além disso, a expressão em células AQP2 IMCD aumenta após um desafio de 30 minutos com AVP ou forscolina (Figura 3) 10. O aumento na abundância AQP2 é independente de transcrição e tradução melhorada. Forscolina ou estimulação AVP conduz à inibição da p38 mitogen-activated-proteína-cinase (p38-MAPK), que está associado com uma diminuição do nível de phosphorylation em serina 261 de AQP2 e uma redução na sua poli-ubiquitinação. Assim, o aumento da abundância AQP2 após estimulação é atribuído a uma diminuição da degradação proteossômica 10. Tomadas em conjunto, as células IMCD permitir investigar os mecanismos que controlam AQP2.

Linha celular Organismo Número ou referência ATCC
Caki Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et ai. De 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 11, 2007
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et ai., 1999 15, Hasler et al. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al., 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et ai. De 1997 12

Tabela 1. Linhas de células de rim de mamífero para os estudos de AQP2 mecanismos de controlo. Células caki, mpkCCD e mTERT-CCD expressar AQP2 endogenamente. Nas células COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 e linhas de células MDCK, AQP2 é dificilmente detectável. CD8, MCD4 e WT10 células overexpress AQP2 ectópica.


Figura 1. Representação esquemática do procedimento para o estabelecimento de culturas de células IMCD. Indicados são a ordem das etapas experimentais e os dias da semana preferido para os experimentos. IMCD células primárias de rato são semeadas no dia 0 e 1 semana mais tarde, são usadas para experimentos. Os números entre parênteses referem-se às respectivas etapas experimentais descritas no "Protocolo".

Figura 2
Figura 2. AQP2 insere na membrana do plasma após estimulação com AVP ou forscolina. IMCD células foram deixadas em condições de controlo, ou seja estimuladas com AVP 100 nM ou 10 fiM de forscolina durante 30 min a 37 ° C. As células foram analisadas por microscopia de imunofluorescência como described antes (LSM 710, Carl Zeiss microfilmagem, Jena, Alemanha) 10. Núcleos foram visualizados com DAPI, AQP2 foi detectado com um anticorpo custom-made (vermelho; anticorpo H27) 20,21. O painel superior, XY scans; painel inferior, XZ scans. Barras de escala, 20 mM.

Figura 3
Figura 3. AQP2 proteínas de abundância aumenta com a estimulação com vasopressina (AVP) e forscolina. IMCD células foram deixadas sem tratamento (UTR) ou estimuladas quer com 100 nM de AVP (A) ou 10 pM de forscolina (F), durante 30 min a 37 ° C. As células foram lisadas e complexo glicosilada (AQP2 cg), manose elevada (AQP2 hm) e não glicosilada AQP2 (AQP2 ng) foi detectado por imunotransf erência usando anticorpos específicos contra AQP2 (sc-9882, SantaCruz), conforme descrito anteriormente 10. Como um controlo de carregamento foi detectado α-tubulina (CP06, Calbiochem). É mostrado um resultado representativo de> 3-Experiments. Os pesos moleculares são indicados (kDa).

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Discussion

Nós apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e cultivo de células IMCD primárias de rato. A abordagem rende até 21 cm 2 de células de um rato 20. O ensaio requer um equipamento padrão de cultura de células e pode ser realizada por uma única pessoa dentro de aproximadamente 6 horas. Por conseguinte, esta abordagem é adequada como um método padrão de laboratório.

IMCD células primárias de rato podem ser semeadas em placas de cultura de diferentes tamanhos, que vão desde placas de 96 poços de placas de 60 mm. No entanto, para o crescimento em 384 formato bem o procedimento requer otimização. Nós evitar o uso de pratos maiores de 60 mm, o crescimento desacelerou. As células são adequadas para uma variedade de ensaios, tais como transferência Western, imunoprecipitação, o ADN / ARN de isolamento, microscopia de imunofluorescência, Ca 2 + e imagiologia electrofisiologia 10,22,23.

A cerca de 6 a 8 dias após a sementeira, as células são cultivadas IMCD primárias a um confluent monocamada (Figura 2). A altura da pilha é 3-5 mM, em média, 24, e as células são bem presas e manter um elevado nível de expressão endógeno AQP2. Imunofluorescência de detecção microscópica AQP2 indica que até 80% das células representam células principais AQP2-positivos (Figura 3; 10,20). Morfologicamente, as células são caracterizados por longas bordas retas celulares, um núcleo embutido no citoplasma com um a três nucléolos e vários grânulos citoplasmáticos destacados 20. A identidade dos restantes 20% de células AQP2-negativas, a cultura não tenha sido inequivocamente definido. Maric et al. Realizada microscopia de contraste de fase e microscopia de imunofluorescência de junções apertadas para visualizar os limites da célula 20. Em células AQP2 negativos observaram fronteiras celulares curvas com recortes e invaginações para suas células vizinhas e um núcleo saliente com um nucléolo. Based nesta morfologia que é distinta da de células AQP2-positivas, Maric et ai. sugeriu que a maioria das células AQP2-negativos são células intercaladas. Além disso, a cultura contém aparentemente alguns fibroblastos 20. Eles só se tornam evidentes se as culturas são crescidas durante mais de 10 dias, quando essas células começam cobrindo os principais células. De acordo com a nossa cultura de fibroblastos condição não exibem uma aparência típica de fibroblastos. Em linha, Gonzalzez et al. Encontraram células intersticiais em culturas de células IMCD primárias semelhantes 5-8 dias após a semeadura 25.

Culturas de células primárias IMCD preparado de maneiras ligeiramente diferentes, mas que possuem propriedades semelhantes como os descritos acima são utilizados noutros laboratórios. Por exemplo, Chou et ai. Semente células IMCD primários em superfícies de plástico que não são revestidos com colagénio 26. As células IMCD primárias preparadas de acordo com qualquer um dos protocolos de alta qualidade parece semelhantecomo, por exemplo, ambos são adequados para a intracelular de Ca 2 + medições 22,23,26. Listas completas de mRNAs e proteínas expressas em células IMCD primários foram obtidos a partir de perfis de transcrição usando tecnologia Affimetrix 27 e análise proteômica por espectrometria de massa 28 (ver também http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Limitações de células IMCD primários, como para muitas pilhas, incluem a baixa taxa de transfecção (≈ 1% 29). Assim, a superexpressão de proteínas é quase só é possível se os plasmídeos que codificam as proteínas ou os mesmos estão microinjectado (por exemplo 30). Uma outra limitação é a ausência de polaridade celular adequada de células IMCD primários. Em resposta a AVP, AQP2 transloca predominantemente na membrana do plasma basolateral (Figura 2). Nossos ensaios para induzir a polaridade correta, ou seja,

Tomadas em conjunto, as células primárias, IMCD estabelecidos, tal como descrito acima, não possuem a maquinaria para controlar AQP2 e são, por conseguinte, um modelo adequado para estudar AQP2 regulação. No entanto, a sua utilização exige que os animais e, portanto, deve ser limitada a experiências que não podem ser realizadas em outros sistemas de modelos estabelecidos (ver acima) e a validação dos resultados que foram obtidos em outros sistemas de modelos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL e KL 1415/3-2 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

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Enno Klussman

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Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

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