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Biology

Culture primaire Rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginine-vasopressine (AVP) contrôle fine-tuning de l'homéostasie de l'eau du corps en facilitant la réabsorption de l'eau par les cellules rénales principales. Ici, nous présentons un protocole pour la culture de la médullaire interne de rat primaire recueillir les cellules des canaux appropriés pour l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la réabsorption de l'eau AVP-médiation.

Abstract

Arginine-vasopressine (AVP) facilite la réabsorption de l'eau par une insuffisance rénale prélèvement de cellules principaux conduits et ainsi peaufine l'homéostasie de l'eau. AVP se lie à des récepteurs V2 de la vasopressine (V2R) sur la surface des cellules et induit ainsi la synthèse de l'AMPc. Ceci stimule les processus de signalisation cellulaires conduisant à des changements dans la phosphorylation de la chaîne aquaporine-2 de l'eau (AQP2). Protéine kinase A phoshorylates AQP2 et déclenche ainsi la translocation de AQP2 de vésicules intracellulaires dans la membrane plasmique de faciliter la réabsorption d'eau à partir de l'urine primaire. Aberrations de l'AVP libération de la signalisation hypophyse ou AVP activé dans les cellules principales peuvent causer le diabète insipide central ou néphrogénique, respectivement, un taux sanguin AVP plasmatique élevé est associé aux maladies cardiovasculaires comme l'insuffisance cardiaque chronique et le syndrome de sécrétion inappropriée d'hormone antidiurétique.

Ici, nous présentons un protocole pour cultivatisur des médullaire interne de rat primaire recueillir les cellules des canaux (PCIME), qui expriment V2R et AQP2 endogène. Les cellules sont appropriés pour l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le contrôle des AQP2 et ainsi de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de maladies associées à une dérégulation de la réabsorption de l'eau AVP-médiation. IMCD cellules sont obtenues à partir rat rénale moelles intérieure et sont utilisés pour des expériences de six à huit jours après le semis. IMCD cellules peuvent être cultivées dans des plats réguliers de culture cellulaire, des flacons et des plaques de micro-titrage de différents formats, la procédure ne nécessite que quelques heures, et est approprié pour les laboratoires de culture cellulaire standard.

Introduction

Lors de la collecte des cellules rénales de conduits principaux, de l'arginine-vasopressine (AVP) commande la réabsorption de l'eau par la stimulation de l'insertion de l'eau canal aquaporine-2 (AQP2) dans la membrane plasmique. AVP se lie à la protéine de type à couplage de la vasopressine-2 récepteur du G (V2R) la stimulation de l'adénylate cyclase et donc la formation de cAMP. L'initiation de cette cascade de signalisation conduit à l'activation de la protéine kinase A (PKA). PKA phosphoryle AQP2 à la sérine 256 (S256), qui est le déclencheur clé pour sa redistribution de vésicules intracellulaires dans la membrane plasmique. L'insertion de la membrane facilite la réabsorption de l'eau le long d'un gradient osmotique et peaufine l'homéostasie de l'eau.

Dysrégulation de la réabsorption de l'eau AVP-dépendante, due à des aberrations de la sécrétion AVP ou les causes de signalisation AVP activés ou est associée à des maladies graves. Diminution de la réabsorption de l'eau causée par des mutations du V2R ou AQP2 conduit à un diabète insipide néphrogénique, alors qu'un AscATED plasma AVP niveau sanguin est associé à la réabsorption d'eau excessive dans les maladies cardiovasculaires telles que l'insuffisance cardiaque chronique et le syndrome de sécrétion inappropriée d'hormone antidiurétique (SIADH).

L'importance de la réabsorption de l'eau AVP-médiation découle non seulement de son implication dans la maladie. La translocation AVP-induite de vésicules AQP2 portant à la fusion et à la membrane plasmique représente un processus d'exocytose strictement dépendante de l'AMPc, qui n'est actuellement pas bien compris. D'autres exemples d'une exocytose dépendante de l'AMPc sont sécrétion de rénine dans le rein et H + sécrétion dans l'estomac. Par conséquent, l'élucidation des mécanismes moléculaires qui régissent le AQP2-translocation dans les cellules principales rénales permet non seulement de comprendre les processus moléculaires similaires dans d'autres types de cellules, mais peut aussi ouvrir la voie à de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies associées à des troubles de la réabsorption de l'eau AVP-médiation .

Elucidating mécanismes AQP2 contrôle nécessite la collecte des modèles cellulaires conduits principaux. Pour cela, un certain nombre de différentes lignées cellulaires de reins de mammifères sont disponibles. Cependant, ces modèles présentent plusieurs inconvénients. Dans de nombreux systèmes cellulaires niveau de la protéine de AQP2 est faible (tableau 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, d'autres ectopique surexpriment l'homme (MCD4, WT10) 11,12 ou rat (CD8) 13 AQP2. En MCD4 et les cellules COS-7 du récepteur V2 n'est pas exprimé. À notre connaissance, il n'existe pas de ligne de la cellule permanente comme un modèle disponible, qui est dérivé du conduit rénal collecteur médullaire interne, cette partie du rein où AQP2 expression est la plus abondante, mais à partir du canal collecteur cortical 1,11,13-16 . Ces modèles cellulaires sont par exemple le immortalisé mpkCCD largement utilisé (par exemple 17) ou les 14 lignées cellulaires mTERT-CCD récemment établis. Les deux lignées cellulaires de façon endogène express AQP2 et V2R mais depuis ils sont issus de latube collecteur cortical contient probablement un protéome différent par rapport à collecteur médullaire interne les cellules des canaux (PCIME). Ils doivent par exemple exprimer différent Na + systèmes de transport.

Ici, nous présentons un protocole pour la culture des cellules IMCD primaires exprimant V2R et AQP2 endogène. Ce modèle représente donc plus près la situation physiologique dans le tube collecteur rénal. En instituant la culture ne nécessite que étalons de laboratoire équipement d'autres laboratoires peuvent facilement adopter cette approche.

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Protocol

1. Préparation

  1. Préparation des boîtes de culture
    1. Dégel collagène de type IV O / N à 4 ° C et le dissoudre dans l'acide acétique stérile de 0,1%. Le volume à utiliser dépend du type et du nombre de plats dans lesquels les cellules doivent être ensemencées. Utilisation 2 ug / cm 2.
    2. Incuber plats au moins pendant 1 heure à température ambiante et laver deux fois avec de l'eau distillée (A. tridest).
    3. Les laisser sécher correctement.
  2. La supplémentation en moyenne
    1. Augmentez le niveau de glucose à 4,5 g / L en ajoutant 1,75 g de glucose à moyen de 500 ml. Pour ajuster le milieu à 600 mosmol, ajouter du NaCl 100 mM et 100 mM d'urée, pour augmenter l'osmolarité de 200 mosmoles et 100 mOsmol, respectivement.
    2. Ajouter 1% d'acides aminés non essentiels, 1% Ultroser, 500 um DBcAMP, 20 U / ml nystatine et 0,25 pg / ml de gentamicine (1:200 dilution de la solution mère avec une concentration de 50 ng / ml) à 600 DMEM mosmol fraîchement le jour de la préparation.
    solution enzymatique
    1. Ajouter 1 mg / ml d'hyaluronidase et 2,2 mg / ml de collagénase à DPBS contenant 0,25 mg / ml de gentamicine et la nystatine. Préparer 1 ml de cette solution enzymatique pour la digestion des 2 reins moelles intérieure. La solution doit être stérilisée par filtration et est stocké dans des tubes Falcon 50 ml.

2. La culture du primaire Rat canal collecteur médullaire interne (IMCD) Cellules

Toutes les procédures de manipulation des animaux doivent être réalisées dans le respect de la législation locale et fédérale.

  1. Anesthésier les rats de CO 2 (dans une boîte saturée de CO 2) ou à l'isoflurane (U-400 appareil d'anesthésie, Univentor Ltd, Malte, le débit d'air de 350-400 ml / min avec 2-2,5% d'isoflurane). Décapiter les animaux de saignement qui permet la détection précise de la frontière entre l'intérieur blanchâtre et la médullaire externe plus sombre. En outre, le saignement réduit le nombre de globules rouges isolés. Retirer les reins etlavez-les dans du DPBS stérile additionné de gentamicine et la nystatine (voir ci-dessus) sur la glace. Toutes les autres étapes doivent être réalisées dans des conditions de banc propre stériles.
  2. Transfert reins de la solution DPBS sur une compresse stérile pour enlever le liquide excessif. Retirez la capsule rénale gras avec pinces et de ciseaux stériles.
  3. Ayant le rein encore fixé dans la compresse, coupé légèrement à côté de l'axe longitudinal de la face externe (cortex). Veillez à ne pas couper à travers complètement, mais de le laisser dans une seule pièce, connecté dans le bassinet du rein.
  4. Avec des ciseaux courbes disséquer soigneusement le moelles interne blanchâtre, qui sont entourés par la médullaire externe chatoyant rosé. Collectionnez-les dans du DPBS, contenant de la gentamicine et la nystatine dans une boîte de culture de 60 mm sur la glace.
  5. Une fois tous les moelles sont isolés et recueillis sur la glace, réduire le volume de DPBS à un niveau où ils sont simplement recouverts de tampon. Utilisez une lame de rasoir stérile pour couper le moelles en cubes de 53 mm.
  6. Fondre et arrondir l'extrémité pointue d'une pipette Pasteur stérile en maintenant brièvement dans une flamme. Assurez-vous que la pipette est refroidi avant de poursuivre.
  7. Transférer la suspension de tissu à des tubes Falcon de 50 ml contenant une solution enzymatique stérile fraîchement préparée avec de la hyaluronidase et de la collagénase (voir 1.3.1) à l'aide de la pipette Pasteur arrondie. Fermer le couvercle hermétiquement et incuber à 37 ° C sous agitation continue (220 rpm) dans un bain-marie de table ordinaire de 1,5 - 2 heures.
  8. Par trituration de la suspension, une pipette le mélange de haut en bas plusieurs fois avec le tour pipette Pasteur (voir ci-dessus) jusqu'à ce que la suspension devient homogène trouble.
  9. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 300 g et 16 ° C. Éliminer le surnageant, remettre le culot en détail dans DPBS, contenant de la gentamicine et la nystatine et centrifuger à nouveau. Répétez cette étape de lavage une fois.
  10. Remettre en suspension les cellules dans un milieu entièrement complété et épépiner en cplats de ulture et / ou des plaques et micro-titrage. La préparation des deux médullaires (1 animale) donnera suffisamment de cellules pour une boîte de culture de 60 mm.
  11. Après 24 h, se laver les cellules deux fois avec 600 mosmol DMEM et ajouter du milieu frais. Au cours de la semaine prochaine, les cellules doivent être lavés 2-3 fois (Figure 1). 6-8 jours après l'ensemencement, les cellules IMCD peuvent être utilisés pour des expériences. N'oubliez pas de les incuber dans un milieu sans DBcAMP et nystatine pendant 24 heures avant de commencer l'expérience. Sinon AQP2 sera situé exclusivement dans la membrane plasmique.

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Representative Results

La culture réussie des cellules IMCD primaires de rat se traduira par une monocouche confluente 6-8 jours après le semis (figure 2). Par boîte de 60 mm de la culture, il ya environ 6 x 10 6 cellules. Les cellules étroitement adhèrent aux boîtes de culture, car elles ont été recouvertes de collagène de type IV, un composant de la membrane basale 18. Par conséquent, les cellules IMCD ne se détache pas, même pendant plusieurs procédures approfondies de lavage. Jusqu'à 80% des cellules en culture expriment V2R endogène et AQP2. Ce sont les cellules principales, tandis que les cellules dépourvues AQP2 sont considérés cellules intercalaires, les cellules non-IMCD issus de branches minces de l'anse de Henle, vasa recta ou cellules interstitielles médullaires internes. Comme nous l'avons montré précédemment, l'osmolarité moyenne de 600 mosmol empêche la régulation négative de AQP2 19. En outre, l'expression AQP2 est maintenu en complétant le support avec le camp membrane perméable analogue DBcAMP. Afin de réduire les memb plasma AQP2Rane expression et de favoriser ainsi sa localisation intracellulaire des cellules IMCD doivent être conservés sans DBcAMP environ 24 heures avant les expériences. Si la plupart des AQP2 est localisé dans la membrane plasmique dans des conditions de contrôle, le temps de la culture DBcAMP-libre doit être prolongée. La lyse des cellules cultivées dans des boîtes de culture de 60 mm dans les tampons standards cède 1,5 mg de protéine 10.

Lors de la stimulation à court terme (30 min) avec AVP ou la forskoline, un activateur direct de l'adénylcyclase, AQP2 translocation des vésicules intracellulaires vers la membrane plasmique (Figure 2). En outre, AQP2 expression dans les cellules IMCD augmente à un défi de 30 minutes avec AVP ou la forskoline (figure 3) 10. L'augmentation AQP2 abondance est indépendante du renforcement de transcription et de traduction. La forskoline ou la stimulation AVP conduit à l'inhibition de la p38 activée par le mitogène-protéine-kinase (MAPK p38), qui est associée à une diminution du niveau de phosphorylation à sérine 261 de AQP2 et une réduction de sa poly-ubiquitination. Ainsi, l'augmentation de AQP2 abondance lors de la stimulation est attribuée à la dégradation par le protéasome diminué de 10. Pris ensemble, les cellules IMCD permettent l'étude des mécanismes de contrôle AQP2.

Lignée cellulaire Organisme Nombre ATCC ou Référence
CAKI Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al., 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus . 2002 16 Bens et al. 1999, 15, Hasler et al
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al., 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12

Tableau 1. Des lignées de cellules de reins de mammifères pour l'étude des mécanismes de contrôle AQP2. Cellules CAKI, mpkCCD et mTERT-CCD expriment AQP2 endogène. En COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 et des lignées cellulaires MDCK, AQP2 est difficilement détectable. CD8, MCD4 et WT10 cellules surexpriment AQP2 ectopique.


Figure 1. Représentation schématique de la procédure d'établissement des cultures cellulaires IMCD. Indiquées sont de l'ordre de mesures expérimentales et les jours de la semaine préféré pour les expériences. Cellules IMCD primaires de rat sont ensemencées au jour 0 et 1 semaine plus tard, sont utilisés pour des expériences. Les chiffres entre parenthèses renvoient aux étapes expérimentales respectifs décrits sous la rubrique «Protocole».

Figure 2
Figure 2. AQP2 s'insère dans la membrane plasmique lors de la stimulation à AVP ou la forskoline. IMCD cellules ont été laissés dans des conditions de contrôle ou soit stimulées avec 100 nM AVP ou forskoline 10 uM pendant 30 min à 37 ° C. Les cellules ont été analysées par immunofluorescence comme described avant (LSM 710; Carl Zeiss, Jena, Allemagne) 10. Les noyaux ont été visualisés avec DAPI, AQP2 a été détectée avec un anticorps sur mesure (rouge; anticorps H27) 20,21. Panneau supérieur, balayages xy; panneau inférieur, scans xz. barres d'échelle, 20 um.

Figure 3
Figure 3. AQP2 protéines abondance augmente lors de la stimulation avec la vasopressine (AVP) et la forskoline. Cellules IMCD n'ont pas été traités (UTR) ou soit stimulées avec 100 nM AVP (A) ou 10 uM de forskoline (F) pendant 30 min à 37 ° C. Les cellules ont été lysées et complexe glycosylée (AQP2 cg), haute mannose (AQP2 hm) et non AQP2 glycosylée (AQP2 ng) a été détectée par immunoblot utilisant des anticorps spécifiques contre AQP2 (sc-9882, SantaCruz) comme décrit précédemment 10. Comme un contrôle de chargement α-tubuline (CP06, Calbiochem) a été détectée. Montré est un résultat représentatif de> 3 eXperiments. Les poids moléculaires sont indiqués (kDa).

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Discussion

Nous présentons un protocole détaillé pour la préparation et la mise en culture de cellules IMCD primaires de rat. L'approche donne jusqu'à 21 cm 2 de cellules provenant d'un rat 20. L'expérience nécessite un équipement de culture cellulaire standard et peut être réalisé par une seule personne au sein d'environ 6 heures. Par conséquent, cette approche est appropriée comme une méthode de laboratoire standard.

Cellules IMCD primaires de rat peuvent être ensemencées dans des boîtes de culture de différentes tailles, allant de plaques à 96 puits dans des boîtes de 60 mm. Cependant, la croissance dans 384 format bien la procédure nécessite une optimisation. Nous évitons en utilisant des antennes de plus de 60 mm que la croissance s'est ralentie. Les cellules sont adaptés à une variété d'expériences telles que Western blot, immunoprécipitation, l'isolement d'ADN / ARN, immunofluorescence, Ca 2 + imagerie et d'électrophysiologie 10,22,23.

Environ 6 à 8 jours après l'ensemencement, les cellules IMCD primaires sont cultivées à un confluent monocouche (Figure 2). La hauteur de la cellule est le 3 - 5 microns en moyenne 24 ans, et les cellules sont étroitement liés et de maintenir un haut niveau d'expression endogène AQP2. Détection microscopique par immunofluorescence de AQP2 indique que jusqu'à 80% des cellules représentent les cellules principales AQP2-positifs (Figure 3; 10,20). Morphologiquement les cellules sont caractérisées par des frontières longues lignes droites de la cellule, un noyau intégré dans le cytoplasme de un à trois nucléoles, et plusieurs granules cytoplasmiques éminents 20. L'identité des 20% de cellules AQP2 négatifs restants dans la culture n'a pas clairement été défini. Maric et al. Réalisée microscopie à contraste de phase et des analyses microscopiques immunofluorescence des jonctions serrées de visualiser les limites des cellules 20. Dans les cellules AQP2 négatifs qu'ils ont observé les bordures de cellules incurvées avec des indentations et invaginations à leurs cellules voisines et un noyau en saillie avec un nucléole. Based sur cette morphologie qui est distinct de celui des cellules AQP2-positifs, Maric et al. suggère que la majorité des cellules AQP2-négatifs sont des cellules intercalé. En outre, la culture contient apparemment quelques fibroblastes 20. Ils ne deviennent apparents que si les cultures sont cultivées depuis plus de 10 jours où ces cellules commencent envahissement des cellules principales. En vertu de notre culture état fibroblastes ne pas afficher une apparence typique des fibroblastes. En ligne, Gonzalzez et al. Trouvé cellules interstitielles dans des cultures de cellules primaires similaires IMCD 5-8 jours après le semis 25.

Des cultures de cellules primaires IMCD préparés de façon légèrement différente, mais qui possèdent des propriétés similaires à celles décrites ci-dessus sont utilisés dans d'autres laboratoires. Par exemple, Chou et al. Semences cellules IMCD primaires sur les surfaces en plastique qui ne sont pas recouvertes de collagène 26. Les cellules IMCD primaires préparées selon deux protocoles semblent de qualité similairecomme par exemple les deux sont adaptés pour Ca 2 + intracellulaire mesures 22,23,26. Des listes complètes des ARNm et des protéines exprimées dans les cellules IMCD primaires ont été obtenus à partir de profilage transcriptionnel utilisant la technologie Affimetrix 27 et l'analyse protéomique par spectrométrie de masse 28 (voir aussi http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Limitations de cellules IMCD primaires, comme pour de nombreuses cellules primaires, notamment le faible taux de transfection (≈ 1% 29). Ainsi, la surexpression de protéines est presque possible que si les plasmides codant pour les protéines ou sont eux-mêmes microinjectés (par exemple 30). Une autre limite est l'absence de polarité cellulaire adéquate de cellules IMCD primaires. En réponse à AVP, AQP2 translocation principalement dans la membrane plasmique basolatérale (Figure 2). Nos essais pour induire la bonne polarité, soit

Pris ensemble, les cellules IMCD primaires, établis comme décrit ci-dessus, possèdent les mécanismes de contrôle AQP2 et sont donc un modèle approprié pour l'étude de la réglementation AQP2. Cependant, leur utilisation exige que les animaux et doit donc être limitée à des expériences qui ne peuvent pas être réalisées dans d'autres systèmes modèles établis (voir ci-dessus) et à la validation des résultats qui ont été obtenus dans d'autres systèmes modèles.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL 1415/3-2 1415/4-2 et KL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

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Enno Klussman

Culture primaire Rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux
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Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

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