Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginine-vasopressine (AVP) regelt fine-tuning van het lichaam van het water homeostase door het vergemakkelijken waterherabsorptie door renale opdrachtgever cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de teelt van primaire rat binnenste medullaire verzamelen duct cellen die geschikt zijn voor de opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen AVP-gemedieerde water reabsorptie.

Abstract

Arginine-vasopressine (AVP) faciliteert waterherabsorptie door renale opvangbuis voornaamste cellen en daardoor verfijnt lichaam waterhomeostase. AVP bindt aan vasopressine V2-receptoren (V2R) op het oppervlak van de cellen en daardoor leidt tot de vorming van cAMP. Dit stimuleert cellulaire signalering processen die leiden tot veranderingen in de fosforylering van het waterkanaal aquaporin-2 (AQP2). Proteïne kinase A phoshorylates AQP2 en daarmee het startsein voor de translocatie van AQP2 van intracellulaire blaasjes in de plasmamembraan faciliteren waterherabsorptie uit primaire urine. Aberraties van AVP vrijlating uit de hypofyse of AVP-geactiveerde signalering in hoofdsom cellen kunnen verzwakking van het centrale of nefrogene diabetes insipidus, respectievelijk een verhoogde bloedplasma AVP wordt in verband gebracht met hart-en vaatziekten, zoals chronisch hartfalen en het syndroom van inadequate secretie van antidiuretisch hormoon.

Hier, een protocol voor cultivati ​​presenteren weop van de primaire rat binnenste medullaire verzamelbuis (IMCD) cellen, die uitdrukkelijk V2R en AQP2 endogeen. De cellen zijn geschikt voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die de controle AQP2 en aldus nieuwe targets voor de behandeling van ziekten geassocieerd met ontregeling van AVP-gemedieerde waterreabsorptie ontdekken. IMCD cellen worden verkregen van rat nier binnenste medullae en worden gebruikt voor experimenten zes tot acht dagen na het zaaien. IMCD cellen kunnen worden gekweekt in normale celcultuurschalen, flacons en micro-titer platen van verschillende formaten, de procedure vereist slechts een paar uur, en is geschikt voor standaard celkweek laboratoria.

Introduction

In renale verzamelbuis OG cellen, arginine-vasopressine (AVP) regelt waterherabsorptie door bevordering van de insertie van het waterkanaal aquaporin-2 (AQP2) in de plasmamembraan. AVP bindt de G-eiwit-gekoppelde vasopressine-type-2 receptor (V2R) adenylylcyclase stimuleren en daardoor vorming van cAMP. Inleiding van deze signalering cascade leidt tot activatie van proteïne kinase A (PKA). PKA fosforyleert AQP2 op serine 256 (S256), die de belangrijkste trigger voor de herverdeling van intracellulaire blaasjes in de plasmamembraan. Het membraan inbrengen vergemakkelijkt waterherabsorptie langs een osmotische gradiënt en verfijnt het lichaam water homeostase.

Ontregeling van AVP-gemedieerde water reabsorptie, als gevolg van afwijkingen van AVP secretie of AVP-geactiveerde signalering oorzaken of gepaard gaat met ernstige ziekten. Verminderde waterherabsorptie veroorzaakt door mutaties van V2R of AQP2 leidt tot nefrogene diabetes insipidus, terwijl een elevated bloedplasma AVP niveau wordt geassocieerd met overmatig water reabsorptie in cardiovasculaire ziekten zoals chronisch hartfalen en het syndroom van inadequate secretie van antidiuretisch hormoon (SIADH).

De betekenis van de AVP-gemedieerde waterherabsorptie komt niet alleen voort uit zijn betrokkenheid bij ziekte. De AVP-geïnduceerde translocatie van AQP2-dragende blaasjes en fusie met de plasmamembraan is strikt cAMP-afhankelijke exocytose-proces, dat nog niet goed begrepen. Andere voorbeelden van een cAMP-afhankelijke exocytose zijn renine secretie in de nier en H + secretie in de maag. Daarom opheldering van de moleculaire mechanismen die AQP2-translocatie in renale belangrijkste cellen helpt niet alleen soortgelijke moleculaire processen te begrijpen in andere celtypes, maar kan ook tot aan nieuwe therapieën voor de behandeling van ziekten die geassocieerd zijn met afwijkingen in AVP-gemedieerde waterreabsorptie effenen .

Elucidating mechanismen die AQP2 vereist opvangbuis hoofdsom cell modellen. Hiervoor is een aantal verschillende zoogdiercellen nier cellijnen beschikbaar. Echter, deze modellen hebben een aantal nadelen. In veel mobiele systemen het eiwitgehalte van AQP2 is laag (tabel 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, anderen ectopisch overexpressie menselijke (MCD4, WT10) 11,12 of rat (CD8) 13 AQP2. In MCD4 en COS-7 cellen de V2 receptor niet tot expressie. Voor zover bekend geen permanente cellijn als model beschikbaar, die is afgeleid van de nier binnenste medullaire verzamelbuis, dat deel van de nier waar AQP2 expressie meest voorkomende, maar van de corticale verzamelbuis 1,11,13-16 . Dergelijke celmodellen zijn bijvoorbeeld de veelgebruikte geïmmortaliseerde mpkCCD (bijv. 17) of de recent opgerichte mTERT-CCD 14 cellijnen. Beide cellijnen endogeen uitdrukkelijke AQP2 en V2R maar omdat ze zijn afgeleid van decorticale collecting duct bevatten hoogstwaarschijnlijk een andere proteoom vergeleken met innerlijke medullaire verzamelbuis (IMCD) cellen. Zij moeten bijvoorbeeld uiten verschillende Na + transportsystemen.

Hier presenteren we een protocol om cultuur primaire IMCD cellen die V2R en AQP2 endogeen. Dit model vormt derhalve het meest de fysiologische toestand in de renale verzamelen duct. Zoals oprichting van de cultuur vereist enige standaard laboratoriumapparatuur andere laboratoria kunnen gemakkelijk deze aanpak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding

  1. Voorbereiden van de cultuur gerechten
    1. Ontdooi Collageen Type IV O / N bij 4 ° C en oplossen in steriele 0,1% azijnzuur. Het volume is afhankelijk van het soort en aantal schotels waarin de cellen worden gezaaid. Gebruik 2 ug / cm 2.
    2. Incubeer gerechten tenminste gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en twee keer wassen met gedestilleerd water (A. tridest).
    3. Laat de gerechten goed drogen.
  2. Suppletie van middelgrote
    1. Verhoging van het glucosegehalte tot 4,5 g / L door het toevoegen van 1,75 g glucose tot 500 ml medium. Aan het medium tot 600 mosmol passen, voeg 100 mM NaCl en 100 mM ureum, aan de osmolariteit te verhogen met 200 mosmol en 100 mOsmol, respectievelijk.
    2. Voeg 1% niet-essentiële aminozuren, 1% ultroser, 500 uM dbcAMP, 20 U / ml nystatine en 0,25 ug / ml gentamicine (1:200 verdunning van voorraad-oplossing met een concentratie van 50 ug / ml) tot 600 mosmol DMEM medium vers op de dag van bereiding.
    Enzymoplossing
    1. Voeg 1 mg / ml hyaluronidase en 2,2 mg / ml collagenase aan DPBS-dat 0,25 ug / ml gentamicine en nystatine. Bereid 1 ml van de enzymoplossing voor de vertering van 2 nieren binnen medullae. De oplossing moet worden gesteriliseerd door filtratie en bewaard in 50 ml Falcon buizen.

2. Teelt van primaire Rat Inner Medullair Verzamelen Duct (IMCD) Cells

Alle procedures voor de behandeling van dieren in overeenstemming moeten worden uitgevoerd met de lokale en federale regelgeving.

  1. Verdoven ratten in CO 2 (in een doos verzadigd met CO 2) of isofluraan (U-400 Anesthesie-eenheid, Univentor Ltd, Malta; luchtstroom 350-400 ml / min met 2-2,5% isofluraan). Onthoofden de dieren voor bloedingen die precieze detectie van de grens tussen de witachtige binnenste en de donkere buitenste medulla toelaat. Bovendien minimaliseert de bloeding het aantal geïsoleerde erytrocyten. Verwijder nieren enwas ze in steriele DPBS aangevuld met gentamicine en nystatine (zie boven) op ijs. Alle verdere stappen worden onder steriele clean bench omstandigheden worden uitgevoerd.
  2. Overdracht van nieren van de DPBS oplossing op een steriel kompres om overmatige vloeistof te verwijderen. Verwijder het vet niercapsule met steriele pincet en een schaar.
  3. Nadat de nier nog in het kompres vastgesteld gesneden iets naast de lengteas van de buitenste (corticaal) zijde. Zorg ervoor dat niet te snijden door middel van volledig, maar om het te verlaten in een stuk, verbonden in het nierbekken.
  4. Met gebogen schaar zorgvuldig ontleden de witachtige innerlijke medullae, die worden omgeven door de rose glinsterende buitenste medulla. Verzamel ze in DPBS, met gentamicine en nystatine in een 60 mm cultuur schotel op ijs.
  5. Zodra alle medullae worden geïsoleerd en op ijs verzameld, zet het volume van DPBS tot een niveau waarop ze gewoon zijn bedekt met buffer. Gebruik een steriel scheermesje om de medullae snijd ze in blokjes van 53 mm.
  6. Smelt en rond het scherpe uiteinde van een steriele Pasteur pipet door het houden van deze kort in een vlam. Zorg ervoor dat de pipet wordt voordat u verder afgekoeld.
  7. Overdracht van het weefsel schorsing aan de 50 ml Falcon buizen met vers bereide steriele enzymoplossing met hyaluronidase en collagenase (zie 1.3.1) met behulp van de afgeronde Pasteur pipet. Sluit het deksel stevig en incubeer bij 37 ° C onder continu roeren (220 rpm) in een regelmatig tafelblad waterbad gedurende 1,5 - 2 uur.
  8. Voor fijnwrijving van de schorsing, pipet het mengsel op en neer meerdere malen met de ronde Pasteur pipet (zie boven) totdat de schorsing wordt homogeen troebel.
  9. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 300 g en 16 ° C. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet grondig in DPBS, met gentamicine en nystatine en centrifuge opnieuw. Herhaal deze wasstap eenmaal.
  10. Resuspendeer de cellen in volledig aangevuld medium en zaad ze in cULTUUR gerechten en / of micro-titer well platen. De bereiding van 2 medullae (1 dier) voldoende cellen opleveren voor een 60 mm cultuur schotel.
  11. Na 24 uur, wassen cellen tweemaal met 600 mosmol DMEM en voeg vers medium. Gedurende de volgende week de cellen 2-3 keer (figuur 1) worden gewassen. 6-8 dagen na het zaaien, kan IMCD cellen worden gebruikt voor experimenten. Vergeet niet om ze broeden in medium zonder dbcAMP en nystatine voor 24 uur voor aanvang van het experiment. Anders AQP2 zullen uitsluitend worden gevestigd in de plasmamembraan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De succesvolle kweken van primaire rat IMCD cellen zal resulteren in een confluente monolaag 6-8 dagen na het zaaien (figuur 2). Per 60 mm cultuur schotel zijn er ongeveer 6 x 10 6 cellen. De cellen strak houden aan de cultuur gerechten, zoals deze werden bekleed met collageen type IV, een basale membraan component 18. Daarom IMCD cellen zullen niet eens gedurende enkele grondige wasprocedures los. Tot 80% van de gekweekte cellen brengen endogeen V2R en AQP2. Dit zijn de belangrijkste cellen, terwijl de cellen ontbreekt AQP2 worden beschouwd ingelaste cellen, niet-IMCD cellen, afkomstig van dunne ledematen van de lus van Henle, vasa recta of binnenste medullaire interstitiële cellen. Zoals we eerder hebben aangetoond, het medium osmolariteit van 600 mosmol voorkomt down-regulatie van AQP2 19. Bovendien wordt AQP2 expressie gehandhaafd door daaraan medium met het membraan-permeabele cAMP analoog dbcAMP. Om de AQP2 plasma memb verminderenrane expressie, en zodoende haar intracellulaire lokalisatie van de IMCD cellen gunst mag zonder dbcAMP ongeveer 24 uur worden gehouden voor experimenten. Indien de meeste AQP2 is gelokaliseerd in het plasmamembraan onder controle omstandigheden, moet de tijd van dbcAMP-vrije teelt worden verlengd. Lysis van cellen gekweekt in 60 mm cultuur gerechten in standaard buffers levert 1,5 mg eiwit 10.

Op korte termijn stimulatie (30 min) met AVP of forskoline, een directe activator van adenylylcyclase, AQP2 translokeert van intracellulaire vesikels naar de plasmamembraan (Figuur 2). Bovendien AQP2 expressie in IMCD cellen verhoogt bij een 30 min uitdaging AVP of forskoline (Figuur 3) 10. De toename AQP2 overvloed is onafhankelijk van verbeterde transcriptie en translatie. Forskolin of AVP stimulatie leidt tot remming van p38 mitogeen geactiveerde proteïne-kinase (p38-MAPK), die wordt geassocieerd met een daling van het niveau van phosphorylation op serine 261 van AQP2 en een vermindering van de poly-ubiquitinering. Aldus wordt de toename van AQP2 overvloed na stimuleren toegeschreven aan verminderde proteasomale afbraak 10. Samen genomen, IMCD cellen laten onderzoeken van de mechanismen die de AQP2.

Cellijn Organisme ATCC nummer of Reference
Caki Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al., 1996 13.
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al.., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et al.., 1999 15, Hasler et al.. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al.. 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12.

Tabel 1. Zoogdieren nier cellijnen voor studies van AQP2 controlemechanismen. Caki, mpkCCD en mTERT-CCD-cellen brengen AQP2 endogeen. In COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 en MDCK cellijnen, AQP2 is nauwelijks waarneembaar. CD8, MCD4 en WT10 cellen overexpressie AQP2 ectopisch.


Figuur 1. Schematische weergave van de procedure voor het vaststellen van IMCD celculturen. Aangegeven zijn aan de orde van de experimentele stappen en de weekdagen voorkeur voor de experimenten. Primaire rat IMCD cellen worden gezaaid op dag 0 en 1 week later worden gebruikt voor experimenten. Getallen tussen haakjes verwijzen naar de desbetreffende experimentele stappen beschreven onder "Protocol".

Figuur 2
Figuur 2. AQP2 voegt in het plasmamembraan na stimulatie met forskoline en AVP. IMCD cellen bleven onder controle omstandigheden of gestimuleerd met ofwel 100 nM AVP of 10 uM forskoline gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Cellen werden geanalyseerd door immunofluorescentie microscopie described vóór (LSM 710; Carl Zeiss microimaging, Jena, Duitsland) 10. Kernen werden gevisualiseerd met DAPI, werd AQP2 gedetecteerd met een op maat gemaakte antilichaam (rood; antilichaam H27) 20,21. Bovenste paneel, xy scans; onderste paneel, xz scans. Schaalbalken 20 urn.

Figuur 3
Figuur 3. AQP2 eiwitgehalte toe na stimulatie met vasopressine (AVP) en forskoline. IMCD cellen werden onbehandeld gelaten (UTR) of gestimuleerd met ofwel 100 nM AVP (A) of 10 uM forskoline (F) gedurende 30 min bij 37 ° C. Cellen gelyseerd en complexe geglycosyleerd (AQP2 cg), hoog mannose (AQP2 hm) en niet geglycosyleerd AQP2 (AQP2 ng) werd gedetecteerd door immunoblot met gebruikmaking van specifieke antilichamen tegen AQP2 (sc-9882, SantaCruz) zoals eerder beschreven 10. Als een laad controle α-tubuline (CP06, Calbiochem) werd gedetecteerd. Getoond wordt een representatief resultaat van> 3 experiments. Molecuulgewichten zijn aangegeven (kDa).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We presenteren een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en het kweken van primaire rat IMCD cellen. De aanpak levert tot 21 cm2 van cellen van een rat 20. Het experiment vereist standaard celkweek apparatuur en kan door slechts een persoon binnen ca. 6 uur worden uitgevoerd. Daarom is deze benadering geschikt als standaard laboratoriummethode.

Primaire rat IMCD cellen worden gezaaid in kweekplaten van verschillende grootte, variërend van 96 well platen 60 mm schalen. Echter, voor de groei in 384 goed formaat de procedure vereist optimalisatie. We vermijden het gebruik schotels groter dan 60 mm als de groei vertraagd. De cellen zijn geschikt voor diverse experimenten zoals Western blotting, immunoprecipitatie, DNA / RNA-isolatie, immunofluorescentie microscopie, Ca 2 + imaging en elektrofysiologie 10,22,23.

Ongeveer 6-8 dagen na het zaaien worden primaire IMCD cellen gekweekt tot een conflicterenuent monolaag (Figuur 2). De cel hoogte is 3 - 5 micrometer gemiddeld 24, en de cellen worden stevig vastgemaakt en handhaven van een hoog niveau van endogene AQP2 meningsuiting. Immunofluorescentie microscopische detectie van AQP2 aangeeft dat tot 80% van de cellen zijn AQP2-positieve principal cellen (Figuur 3, 10,20). De cellen worden morfologisch gekenmerkt door lange, rechte celranden een kern ingebed in cytoplasma met 1-3 nucleoli en verschillende prominente cytoplasmatische korrels 20. De identiteit van de resterende 20% AQP2-negatieve cellen in de cultuur niet eenduidig ​​gedefinieerd. Maric et al.. Uitgevoerde fase-contrast microscopie en immunofluorescentie microscopische analyses van de krappe kruispunten aan celgrenzen visualiseren 20. In AQP2-negatieve cellen waargenomen ze gebogen cel grenzen met inkepingen en invaginations hun naburige cellen en een uitstekende kern met een nucleolus. Based op deze morfologie die verschilt van die van AQP2-positieve cellen, Maric et al.. gesuggereerd dat de meeste AQP2-negatieve cellen worden ingelast cellen. Bovendien bevat de kweek blijkbaar weinig fibroblasten 20. Ze alleen duidelijk worden wanneer de kweken worden gekweekt voor meer dan 10 dagen wanneer deze cellen beginnen overgrowing de OG cellen. Onder onze cultuur staat fibroblast heb een typisch fibroblast verschijning niet weergeven. In de rij, Gonzalzez et al.. Gevonden interstitiële cellen in dergelijke primaire IMCD celculturen 5-8 dagen na het zaaien 25.

IMCD primaire celkweken bereid op een iets andere wijze maar vergelijkbare eigenschappen hebben als hierboven beschreven die worden gebruikt in andere laboratoria. Bijvoorbeeld, Chou et al.. Zaad primaire IMCD cellen op kunststof oppervlakken die niet zijn bekleed met collageen 26. De primaire IMCD cellen bereid volgens een protocol lijken van dezelfde hoge kwaliteitzoals bijvoorbeeld zowel geschikt zijn voor intracellulaire Ca2 + metingen 22,23,26. Uitgebreide lijsten van mRNA en eiwitten uitgedrukt in primaire IMCD cellen werden verkregen van transcriptionele profiling behulp Affimetrix technologie 27 en massaspectrometrische proteoom analyse 28 (zie ook http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Beperkingen van primaire IMCD cellen, zoals voor veel primaire cellen, onder de lage transfectie tarief (≈ 1% 29). Aldus overexpressie van eiwitten vrijwel alleen mogelijk als de coderende plasmiden of de eiwitten zelf geinjecteerde (bijv. 30). Een andere beperking is het ontbreken van een goede cellulaire polariteit van primaire IMCD cellen. In reactie op AVP, AQP2 translokeert voornamelijk in de basolaterale plasmamembraan (Figuur 2). Onze proeven om de juiste polariteit, dwz induceren

Tezamen primaire IMCD cellen, vastgesteld zoals hierboven beschreven, de machinerie bevatten voor het regelen AQP2 en derhalve een geschikt model voor het bestuderen AQP2 regelgeving. Echter, het gebruik vereist dieren dient dan ook beperkt tot experimenten die niet in andere modelsystemen vastgesteld (zie hierboven) en validatie van de resultaten die werden verkregen in andere modelsystemen kunnen worden uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL 1415/3-2 en KL 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Tags

Cellular Biology Biotechniek genetica moleculaire biologie biochemie biomedische technologie geneeskunde farmacologie Intercellulaire Signalering peptiden en eiwitten Exocytosis signaaltransductie Tweede Messenger Systems Calcium Signalering Hart-en Vaatziekten Hormonen Hormoon Wissels en Hormoon antagonisten Life Sciences (General) water reabsorptie nieren belangrijkste cellen vasopressine cyclisch AMP aquaporin diermodel celkweek

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter