संवर्धित कोशिकाओं में कैंसर से जुड़े सिग्नल transduction पूछताछ के लिए एक multiplexed luciferase आधारित स्क्रीनिंग प्लेटफार्म
Summary
सेलुलर प्रक्रियाओं के एक सिस्टम स्तर समझ हासिल आधुनिक दिन कोशिका जीव विज्ञान के एक लक्ष्य है. हम यहाँ विभिन्न सेलुलर समारोह के बहुसंकेतन luciferase पत्रकारों के लिए रणनीति का वर्णन अंत अंक जीनोम पैमाने आरएनएआई पुस्तकालयों का उपयोग जीन समारोह से पूछताछ की.
Abstract
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) का उपयोग जीन समारोह का जीनोम पैमाने पूछताछ रासायनिक विनयशील कैंसर सेल कमजोरियों की तेजी से पहचान के लिए जबरदस्त वादा है. इस तकनीक की क्षमता को सीमित तेजी प्ररूपी परिणामों की यंत्रवत आधार चित्रित करना और इस प्रकार molecularly लक्षित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सूचित करने की अक्षमता है. हम कुंजी कैंसर सेल जुड़े प्रक्रियाओं की निगरानी की अनुमति है कि मल्टिप्लेक्स संवाददाता प्रणाली का उपयोग को लक्षित आरएनएआई की मध्यस्थता जीन से प्रेरित सेलुलर phenotypes deconstruct करने के लिए यहां के तरीकों की रूपरेखा. यह उच्च सामग्री स्क्रीनिंग पद्धति बहुमुखी है और आसानी से बड़ी आणविक पुस्तकालयों के अन्य प्रकार की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक विविध सरणी की निगरानी के लिए luciferase आधारित पत्रकारों की एक किस्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. इन डीएनए के बहुमत विशेष सेल उत्तेजनाओं या perturbations द्वारा व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं कि luciferase सांकेतिक शब्दों में प्रोटीन निर्माण करती है. सबसे मजबूत transcriptionally आधारित संवाददाताओं सिंथेटिक बढ़ाने तत्वों या जीन प्रमोटर क्षेत्रों एक physiologically प्रासंगिक ट्रांसक्रिप्शनल घटना 1,2 रिपोर्टिंग में उनकी विश्वसनीयता के लिए अच्छी तरह से स्थापित के नियंत्रण में एक luciferase एंजाइम की अभिव्यक्ति जगह है. Luciferase प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव GAL4-यूएएस उपयोग उस पार संवाददाता luciferase सिस्टम भी कर रहे हैं. Gal4 एक खमीर ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक है और यूएएस Gal4 यह विशेष रूप से 3 की डाउन स्ट्रीम रखा जीन दृश्यों के प्रतिलेखन सक्रिय करने के लिए बांधता है, जो करने के लिए एक बढ़ाने है. Luciferase प्रणालियों के इन प्रकार के आम तौर पर दो डीएनए plasmids से समर्थन कर रहे हैं – एक regulato के लिए जुड़े हुए GAL4 प्रोटीन encodesry के हित के एक प्रोटीन का भाग है, और दूसरा एक या एक से अधिक यूएएस दृश्यों के नियंत्रण में रखा एक luciferase प्रोटीन encodes. इस प्रकार, सेलुलर luciferase संकेत ब्याज की प्रोटीन की गतिविधि के स्तर को दर्शाता है. Luciferase आधारित संवाददाताओं के एक अन्य आम उपयोग के लिए ब्याज की एक प्रोटीन एक luciferase एंजाइम 4 से जुड़े हुए है जिससे प्रोटीन स्थिरता की निगरानी के लिए है. एक अच्छी तरह से पूछताछ की गई है करने के लिए किसी भी पत्रकार की विशिष्टता नहीं मान सकते हैं के रूप में भले ही रिपोर्टर के प्रकार के, एक चेतावनी emptor यहाँ उल्लेख किया है. इस प्रकार, परिश्रम के कारण किसी भी अनुसंधान रणनीति में नया संवाददाता निर्माणों का समावेश जरूरी है.
luciferase एंजाइम पढ़ने के लिए बाहर का चयन अपनी अभिव्यक्ति को नियंत्रित कि डीएनए तत्वों की विश्वसनीयता के रूप में महत्वपूर्ण हो सकता है. जुगनू luciferase (FL) के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निर्माणों में सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइम है जबकि, (मामले में एटीपी की आवश्यकता नहीं है कि नए luciferase संवाददाता सिस्टम के आगमनFL आधारित प्रतिक्रियाओं के) या कि इस शोध मंच की दक्षता और विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए वादा मजबूत संकेत फेंकना कि अधिक स्थिर एंजाइमों शामिल. रासायनिक पढ़ाई में luciferase पत्रकारों के चयन के बारे में एक महत्वपूर्ण सूचना झूठी रिपोर्ट को जन्म दे सकता है कि रासायनिक अवरोध को FL की संवेदनशीलता है. हमारे अनुभव में, एक के रूप में सब्सट्रेट coelenterazine उपयोग कि ऐसे Renilla या Gaussia luciferase (क्रमश: आर एल और जीएल,) के रूप में अन्य एंजाइमों कम आसानी से छोटे अणुओं 5 से हिचकते हैं.
बहुसंकेतन luciferase पढ़ने के बहिष्कार के लिए सबसे आम स्वरूप काफी हद तक क्रमिक रूप से एक भी नमूना से enzymatic गतिविधियों को मापने की क्षमता के साथ आसान करने के लिए उपयोग किट की उपलब्धता को देखते हुए FL और आर एल के उपयोग की जरूरत पर जोर देता. सबसे किट में, नमूने पहले एक साथ एक secon उपज को coelenterazine साथ जमा किया जाता है कि एक शमन अभिकर्मक द्वारा पीछा FL गतिविधि के स्तर को प्रकट करने के लिए luciferin को उजागर कर रहे हैंdary आरएल संकेत. ऐसे जीएल या कि उपयोग ऐसे Cypridina luciferase (सीएल), luciferases का उपयोग करते हुए उच्च सामग्री डेटा उभरा है पैदा करने के लिए संभावनाओं की एक बड़ी संख्या के रूप में अभी तक एक सब्सट्रेट के रूप में स्रावित किया जा सकता है कि अन्य luciferases के अलावा के साथ. इस तकनीक का उपयोग कर एक जीनोम चौड़ा आरएनएआई स्क्रीन का एक उदाहरण यहां 6 पाया जा सकता है. इन तकनीकी विकास की बारी में है पार बात 7 को सीमित करने के क्रम में luciferase एंजाइम के प्रत्येक प्रकार बुझाने के लिए विशेष तंत्र के विकास को प्रेरित किया. हमारे हाथ में है, हम ऐसे जीएल या सीएल के रूप में स्रावित luciferases साथ, "बढ़त प्रभाव" (उच्च टिटर संस्कृति प्लेटों की बढ़त के साथ जुड़े सेलुलर गतिविधि में भरी प्रवृत्तियों) का अधिक से अधिक आवृत्ति ध्यान दें. वे सेल व्यवहार्यता adulterating बिना संकेत नमूना सक्षम के रूप में दूसरी ओर, इस तरह के स्रावित luciferases गतिज assays के लिए उपयोगी होते हैं.
यहाँ प्रस्तुत हमारे अध्ययन के लिए, हम एक साथ तीन कैंसर प्रासंगिक की गतिविधि की निगरानी करेंगेसेलुलर प्रक्रियाओं: p53, क्रास, और Wnt संकेत पारगमन मार्ग. ,, हमारे अध्ययन में शामिल पत्रकारों Clontech से pp53-टीए ल्यूक FL रिपोर्टर (अब p53-FL के संवाददाता के रूप में) 8, एक Elk1-GAL4/UAS-CL संवाददाता प्रणाली (Agilent के आगे से एल्क -1 पत्रकार हैं) और टी सेल कारकों (या TCFs), 9-11 के रूप में जाना जाता Wnt मार्ग transcriptional नियामकों द्वारा मान्यता प्राप्त कई सिंथेटिक बढ़ाने तत्वों को शामिल किया गया है कि 8X खरब घन फुट आरएल संवाददाता.
Protocol
Representative Results
Discussion
पहली बार के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन मनोरंजक उन लोगों के लिए उपयोगी ऑन लाइन संसाधन उपलब्ध कराने कि luciferase आधारित रिपोर्टर सिस्टम के कई पैरोकार (जैसे Promega के रूप में, लक्ष्य निर्धारण प्रणाली, न्यू इंग्लैंड Biola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम CPRIT (RP100119) और वेल्श फाउंडेशन (मैं-1665) से अनुदान सहायता को स्वीकार करते हैं.
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
References
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