En Multiplexed Luciferase-baseret Screening Platform for forhører Kræft-associeret signaltransduktion i dyrkede celler
Summary
Opnå et system level forståelse af cellulære processer er et mål for moderne cellebiologi. Vi beskriver her strategier for multiplexing luciferase journalister af forskellige cellulære funktion endepunkter at afhøre genfunktion hjælp genom-skala RNAi biblioteker.
Abstract
Genom-skala afhøring af gen-funktion ved hjælp af RNA-interferens (RNAi) besidder kolossale muligheder for hurtig identifikation af kemisk medgørlige kræftcelle sårbarheder. Begrænsning af mulighederne i denne teknologi er den manglende evne til hurtigt at afgrænse det mekanistiske grundlag af fænotypiske udfald og dermed præge udviklingen af molekylært målrettede terapeutiske strategier. Vi skitserer her metoder til at dekonstruere cellulære fænotyper fremkaldt af RNAi-medieret genmålretning hjælp multiplexede reporter systemer, som muliggør overvågning af centrale kræftcelle-associerede processer. Denne high-indhold screeningmetode er alsidig og kan let tilpasses til at screene for andre typer af store molekylære biblioteker.
Introduction
En række af luciferase-baserede reportere til overvågning af en bred vifte af cellebiologiske processer er kommercielt tilgængelige. De fleste af disse DNA-konstruktionerne koder luciferase proteiner, som induceres til at udtrykke ved hjælp af specifikke celle stimuli eller perturbationer. De mest robuste transskriptionelt baserede journalister placere udtryk for en luciferaseenzymet under kontrol af syntetiske enhancerelementer eller genpromotoren regioner veletablerede for deres pålidelighed i rapporteringen en fysiologisk relevant transcriptional begivenhed 1,2. Der er også trans-reporter luciferase systemer, der udnytter GAL4-UAS at drive luciferase proteinekspression. GAL4 er en gær transkriptionsaktivator og UAS er en enhancer som Gal4 specifikt binder at aktivere transkriptionen af gensekvenser anbragt nedstrøms af det 3.. Disse typer af luciferase systemer er typisk understøttet af to DNA plasmider – en indkoder GAL4-proteinet fusioneret til regulatory del af et protein af interesse, og den anden koder et luciferase protein placeret under kontrol af en eller flere UAS-sekvenser. Således cellulære luciferase signal afspejler aktivitetsniveauet af proteinet af interesse. En anden almindelig anvendelse af luciferase-baserede reportere er til overvågning proteinstabilitet, hvorved et protein af interesse er fusioneret til en luciferaseenzymet 4.. Uanset hvilken type reporter er en caveat her bemærkes, som man ikke kan påtage sig den særlige karakter af enhver journalist at have været godt afhørt. Således er due diligence kræves i indarbejdelse af nye reporter konstruktioner i enhver forskningsstrategi.
Udvælgelsen af luciferaseenzymet udlæsning kan være lige så vigtig som pålideligheden af DNA-elementer, der styrer dets ekspression. Henviser ildflueluciferase (FL) er den mest almindeligt anvendte enzym i kommercielt tilgængelige konstruktioner, fremkomsten af nye luciferase reporter systemer, der ikke kræver ATP (som det er tilfældetaf FL-baserede reaktioner), eller at inkorporere mere stabile enzymer, der udsender stærke signaler lover at forbedre effektiviteten og pålideligheden af denne forskningsplatform. En vigtig bemærkning for udvælgelsen af luciferase journalister i kemiske undersøgelser er modtagelighed FL til kemisk hæmning, der kunne give anledning til falske rapporter. Det er vores erfaring, er andre enzymer såsom Renilla eller Gaussia luciferase (RL og GL, henholdsvis), der anvender coelenterazin som substrat mindre let hæmmet af små molekyler 5.
Det mest almindelige format for multiplexing luciferase udlæsninger indebærer anvendelse af FL og RL vid udstrækning givet tilgængeligheden af let-at-bruge kits med evnen til sekventielt måle enzymatiske aktiviteter fra en enkelt prøve. I de fleste kits, prøverne først udsat for luciferin at afsløre niveauer af FL aktivitet efterfulgt af en quenching reagens, samtidigt deponeret hos coelenterazin til opnåelse af et sekunDary RL signal. Med tilføjelsen af andre luciferaser, der kan udskilles som GL eller at anvende endnu et substrat, såsom Cypridina luciferase (CL), et større antal muligheder for at skabe høje indhold data ved hjælp luciferaser er dukket op. Et eksempel på en genom-dækkende RNAi screen hjælp af denne teknik kan findes her 6. Disse teknologiske fremskridt har igen ansporet til udvikling af specifikke mekanismer til at slukke hver type luciferaseenzymet for at begrænse cross-talk 7.. I vores hænder, bemærker vi en højere frekvens af "kanteffekter" (uforklarlige tendenser i cellulære aktivitet forbundet med kanten af højtiter dyrkningsplader) med udskilte luciferaser såsom GL eller CL. På den anden side er sådanne secernerede luciferaser anvendelige til kinetiske assays som de giver signal prøvetagning uden forfalsket cellelevedygtighed.
For vores undersøgelse præsenteres her, vil vi samtidigt at overvåge aktiviteten af tre cancer-relevantcellulære processer: p53, Kras og Wnt signaltransduktionsbaner. Reporterne indarbejdet i vores undersøgelse er pp53-TA-Luc FL reporter fra Clontech (herefter benævnt p53-FL reporter) 8, en Elk1-GAL4/UAS-CL reporter-system (herefter Elk-1 reporter, Agilent), og 8X TCF RL reporter, der inkorporerer flere syntetiske enhancerelementer anerkendt af de Wnt pathway transskriptionsregulatorer kendt som T-celle faktorer (eller TCFs) 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere leverandører af luciferase-baserede reporter systemer (såsom Promega, Målretning Systems, New England Biolabs og Thermo Fisher), der giver nyttige on-line ressourcer til dem, underholdende en high-throughput screening for første gang. Desuden bør en række fremragende anmeldelser om at optimere brugen af high-throughput skærme til gen-opdagelse og hvordan RNAi-baserede screening resultater kan integreres med andre-omics-baserede dataserier være nyttigt 15,16. Metoder til udvælgelse af &qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender finansiere støtte fra CPRIT (RP100119) og Welch Foundation (I 1665).
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
References
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Lum, L. D., Kulak, O. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- . Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
