En Multiplexed Luciferase-basert screening plattform for avhør kreft-assosiert Signal Transduksjon i dyrkede celler

Summary

Oppnå et system nivå forståelse av cellulære prosesser er et mål for dagens cellebiologi. Vi beskriver her strategier for multipleksing luciferase reportere i ulike cellular funksjon endepunkter å avhøre gen-funksjon ved hjelp av genom-skala RNAi biblioteker.

Abstract

Genom-skala avhør av gen-funksjon ved hjelp av RNA interferens (RNAi) har enorm løftet for rask identifisering av kjemisk medgjørlig kreftcelle sårbarheter. Begrenser potensialet i denne teknologien er manglende evne til raskt å avgrense det mekanistiske grunnlaget for fenotypiske utfall og dermed informere utviklingen av molekylært målrettede terapeutiske strategier. Vi skissere her metoder for å dekonstruere cellulære fenotyper indusert av RNAi-mediert gene targeting bruker multipleksede reporter systemer som tillater overvåking av nøkkelen kreftcelle-tilknyttede prosesser. Dette høye innhold screening-metoden er fleksibel og kan lett tilpasses for screening av andre typer store molekylære bibliotek.

Introduction

En rekke luciferase-baserte journalister for å overvåke et variert utvalg av cellebiologiske prosesser er kommersielt tilgjengelig. De fleste av disse DNA konstruerer kode luciferase proteiner som er overtalt til å uttrykke av bestemte celle stimuli eller forstyrrelsene. Den mest robuste transcriptionally baserte journalister plasserer uttrykk for en luciferase enzymet under kontroll av syntetiske enhancer elementer eller genpromotoren regioner veletablerte for sin pålitelighet i rapporteringen en fysiologisk relevant transkripsjonell hendelsen ^1,2. Det er også trans-reporter luciferase systemer som bruker Gal4-UAS å kjøre luciferase protein uttrykk. Gal4 er en gjær-transkripsjons-aktivator, og UAS er en enhancer som Gal4 spesifikt bindes å aktivere transkripsjon av gensekvenser plassert nedstrøms av den ^tre. Disse typer luciferase systemer er vanligvis støttet av to DNA-plasmider – en koder Gal4 protein smeltet til regulatoriskery del av et protein av interesse, og den andre koder for et protein som luciferase plassert under kontroll av en eller flere av UAS sekvenser. Således reflekterer den cellulære luciferase signal aktiviteten av proteinet av interesse. En annen vanlig bruk av luciferase-baserte reportere er for overvåkning av proteinstabilitet hvorved et protein av interesse er her koblet til en luciferase enzym ^4.. Uavhengig av type reporter, er en forbeholdet emptor bemerket her som man ikke kan anta spesifisitet av noen reporter å ha vært godt avhørt. Dermed er due diligence som kreves i inkorporering av nye reporter konstruksjoner i noen forskningsstrategi.

Valget av luciferase enzymet lese-out kan være like viktig som påliteligheten av DNA-elementer som styrer sitt uttrykk. Mens ildflue luciferase (FL) er den mest brukte enzym i kommersielt tilgjengelige konstruksjoner, framveksten av nye luciferase reporter systemer som ikke krever ATP (som i tilfelletav FL-baserte reaksjoner) eller at innlemme mer stabile enzymer som avgir sterkere signaler lover å forbedre effektiviteten og påliteligheten til denne forskningsplattform. Viktig merknad om valg av luciferase reportere i kjemiske studier er mottakelighet for FL til kjemisk hemming som kan gi opphav til falske rapporter. Vår erfaring er andre enzymer som Renilla eller Gaussia luciferase (RL og GL, henholdsvis) som utnytter coelenterazine som underlag er ikke så lett hemmet av små molekyler ^fem.

Det vanligste formatet for multipleksing luciferase read-outs innebærer bruk av FL og RL i stor grad gitt tilgjengeligheten av lett-å-bruke kits med evnen til fortløpende måle enzymatiske aktiviteter fra en enkelt prøve. I de fleste kits det ut prøver først utsettes for luciferin for å avsløre nivåer av FL aktivitet etterfulgt av en bråkjøling reagens som blir samtidig avsatt med coelenterazine hvorved et s.dary RL signal. Med tillegg av andre luciferases som kan skilles ut som GL, eller at bruken enda et substrat som Cypridina luciferase (CL), et større antall muligheter for å generere høye innhold data ved hjelp luciferases har dukket opp. Et eksempel på et genom-wide RNAi skjermen ved hjelp av denne teknikken kan bli funnet her ^seks. Disse teknologiske fremskritt har i sin tur påvirket utviklingen av spesifikke mekanismer for å slukke hver type luciferase enzym for å begrense krysstale ^7. I våre hender, ser vi en større frekvens av "kanteffekter" (uforklarlige trender i mobilnettet aktivitet forbundet med kanten av høye titer kultur plater), med utskilt luciferases som GL eller CL. På den annen side, slike utskilte luciferases er nyttige for kinetiske analyser som de klargjøringssignalet prøvetaking uten adulterating cellelevedyktighet.

For vår studie presentert her, vil vi samtidig overvåke aktiviteten til tre kreft-relevantcellulære prosesser: p53, Kras, og Wnt signaltransduksjonsveiene. Journalistene innlemmet i vår studie er pp53-TA-Luc FL reporter fra Clontech (heretter kalt p53-FL reporter) ^8, en Elk1-GAL4/UAS-CL reporter system (heretter Elk-1 reporter, Agilent), og 8X TCF RL reporter som inkorporerer flere syntetiske enhancer elementer anerkjent av Wnt veien transcriptional regulatorer som kalles T-celle faktorer (eller TCFs) ^9-11.

Protocol

Hele protokollen tar ca 4 dager. En. Utarbeidelse av celler for siRNA og Reporter Transfection Vi vil introdusere her en protokoll for avhør siRNA bibliotekene ved hjelp av et lite sett med siRNAs (384 forskjellige siRNA bassenger array i 96 godt format med hver pool bestående av 4x siRNAs rettet mot et enkelt gen) fra et genom-wide siRNA bibliotek for veiledende. For denne studien, vil vi utnytte HCT116 celler som viser avvikende Wnt og Kras signalering, og p53 …

Representative Results

Til tross for fremskritt i å kartlegge mutational landskapet av ulike kreftformer med massive genomsekvensering innsats 12-14, har vi fortsatt ikke har på plass en systematisk tilnærming for å oversette disse observasjonene i intervensjon strategier. I tykk-og endetarmskreft (CRC), mutasjoner som er spådd å påvirke komponenter i tre cellulære prosesser – Wnt / β-catenin, p53, og Kras signalering – er funnet i 99% av alle svulster som tyder på at de er sentrale drivere av mobilnettet transformasjon i…

Discussion

Det er flere formidlere av luciferase-baserte reporter systemer (som Promega, målsystemer, New England Biolabs, og Thermo Fisher) som gir nyttige on-line ressurser for de underholdende en høy gjennomstrømming skjermen for første gang. I tillegg bør en rekke gode anmeldelser om å optimalisere bruken av high-throughput skjermer for genet funnet og hvordan RNAi-basert screening resultater kan integreres med andre-omics-baserte datasett være nyttig ^15,16. Metoder for valg av "treff" fra high-thro…

Materials

			REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
			EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490