Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées
Summary
Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.
Abstract
Interrogation échelle du génome de la fonction des gènes en utilisant l'interférence ARN (ARNi) s'annonce très prometteuse pour l'identification rapide des vulnérabilités de cellules cancéreuses chimiquement traitables. Limiter le potentiel de cette technologie est l'incapacité à définir rapidement la base mécaniste des résultats phénotypiques et ainsi informer le développement de stratégies thérapeutiques moléculaires ciblées. Nous décrivons ici les méthodes de déconstruire phénotypes cellulaires induits par le gène ARNi à médiation visant l'utilisation des systèmes multiplexés journaliste qui permettent le suivi du cancer touche les processus associés à la cellule. Cette méthode de criblage à haut contenu est polyvalent et peut être facilement adapté pour le dépistage d'autres types de grandes bibliothèques moléculaires.
Introduction
Une variété de journalistes luciférase basés pour surveiller un large éventail de processus biologiques cellulaires sont disponibles commercialement. La majorité de ces constructions d'ADN codant pour des protéines luciférase qui sont amenés à exprimer par des stimuli spécifiques de cellules ou de perturbations. Les plupart des journalistes transcription base robuste placent l'expression d'une enzyme luciférase sous le contrôle des éléments activateurs synthétiques ou régions du promoteur du gène bien établies pour leur fiabilité en rapporter un événement 1,2 transcriptionnelle physiologiquement pertinents. Il existe également des systèmes trans-rapporteur de la luciférase qui utilisent GAL4 UAS pour conduire l'expression de la protéine luciférase. Gal4 de levure est un activateur de la transcription et de l'UAS est un activateur de Gal4 qui se lie spécifiquement à activer la transcription des séquences de gènes placés en aval de celui-ci 3. Ces types de systèmes luciférase sont généralement pris en charge par deux plasmides d'ADN – on encode la protéine GAL4 fusionné à la regulatory partie d'une protéine d'intérêt, et le deuxième code pour une protéine luciférase placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences d'UAS. Ainsi, le signal luciférase cellulaire reflète le niveau d'activité de la protéine d'intérêt. Une autre utilisation courante de journalistes luciférase à base est de surveiller la stabilité des protéines par lequel une protéine d'intérêt est fusionnée à une enzyme luciférase 4. Quel que soit le type de journaliste, un caveat emptor est à noter ici que l'on ne peut assumer la spécificité de tout journaliste aurait été bien interrogé. Ainsi, la diligence raisonnable est nécessaire dans l'intégration des nouvelles constructions rapporteurs dans toute stratégie de recherche.
Le choix de l'enzyme luciférase lecture peut être aussi important que la fiabilité des éléments d'ADN qui contrôlent son expression. Alors que la luciférase de luciole (FL) est l'enzyme la plus couramment utilisée dans les constructions disponibles dans le commerce, l'avènement de nouveaux systèmes de rapporteur de la luciférase qui ne nécessitent pas l'ATP (comme dans le casdes réactions FL-based) ou qui intègrent des enzymes plus stables qui émettent des signaux forts promettre d'améliorer l'efficacité et la fiabilité de cette plate-forme de recherche. Une remarque importante concernant la sélection des journalistes luciférase dans des études chimiques est la sensibilité des FL à l'inhibition chimique qui pourrait donner lieu à de faux rapports. Dans notre expérience, d'autres enzymes telles que Renilla ou Gaussia luciférase (RL et GL, respectivement) qui utilisent coelentérazine comme substrat sont moins facilement inhibé par des petites molécules 5.
Le format le plus courant pour le multiplexage luciférase read-out implique l'utilisation de FL et RL largement donné la disponibilité de fonctions faciles à utiliser kits avec la capacité à mesurer de manière séquentielle des activités enzymatiques à partir d'un seul échantillon. Dans la plupart des ensembles, les échantillons sont d'abord exposées à la luciférine pour révéler les niveaux d'activité FL suivis d'un réactif d'extinction qui est simultanément déposés avec coelentérazine pour donner une secondesignal de RL Dary. Avec l'ajout d'autres luciferases qui peuvent être sécrétés comme GL ou que l'utilisation encore un autre substrat comme Cypridina luciférase (CL), un plus grand nombre de possibilités pour générer des données à haute teneur en utilisant luciferases ont émergé. Un exemple d'un écran ARNi du génome entier en utilisant cette technique peut être trouvée ici 6. Ces avancées technologiques ont à leur tour stimulé le développement de mécanismes spécifiques pour étancher chaque type d'enzyme luciférase pour limiter la diaphonie 7. Dans nos mains, nous constatons une plus grande fréquence des «effets de bord» (tendances inexplicables dans l'activité cellulaire associée au bord de plaques de culture à titre élevé), avec luciferases sécrétées telles que GL ou CL. D'autre part, ces luciferases sécrétées sont utiles pour les essais cinétiques, car elles permettent d'échantillonnage du signal sans dénaturer la viabilité cellulaire.
Pour notre étude présentée ici, nous allons surveiller simultanément l'activité de trois cancer pertinentesprocessus cellulaires: la p53, Kras, et les voies de transduction du signal Wnt. Les journalistes intégrés dans notre étude sont le FL journaliste PP53-TA-Luc de Clontech (ci-après dénommé le journaliste p53-FL) 8, un système de journaliste Elk1-GAL4/UAS-CL (ci-Elk-1 journaliste, Agilent), et le 8X TCF RL journaliste qui intègre de multiples éléments activateurs synthétiques reconnus par la voie Wnt régulateurs de transcription connus comme des facteurs de lymphocytes T (ou FCT) 9-11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs fournisseurs de systèmes rapporteurs luciférase (telles que le Promega, systèmes de ciblage, New England Biolabs, et Thermo Fisher) qui fournissent des ressources en ligne utiles pour ceux divertir un écran à haut débit pour la première fois. En outre, un certain nombre d'excellentes critiques concernant l'optimisation de l'utilisation d'écrans à haut débit pour la découverte de gènes et comment l'ARNi basée sur les résultats du dépistage peuvent être intégrés au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien financier du CPRIT (RP100119) et la Fondation Welch (I-1665).
Materials
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 |
References
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