Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Multiplexed Luciferase-baseret Screening Platform for forhører Kræft-associeret signaltransduktion i dyrkede celler

doi: 10.3791/50369 Published: July 3, 2013

Summary

Opnå et system level forståelse af cellulære processer er et mål for moderne cellebiologi. Vi beskriver her strategier for multiplexing luciferase journalister af forskellige cellulære funktion endepunkter at afhøre genfunktion hjælp genom-skala RNAi biblioteker.

Abstract

Genom-skala afhøring af gen-funktion ved hjælp af RNA-interferens (RNAi) besidder kolossale muligheder for hurtig identifikation af kemisk medgørlige kræftcelle sårbarheder. Begrænsning af mulighederne i denne teknologi er den manglende evne til hurtigt at afgrænse det mekanistiske grundlag af fænotypiske udfald og dermed præge udviklingen af ​​molekylært målrettede terapeutiske strategier. Vi skitserer her metoder til at dekonstruere cellulære fænotyper fremkaldt af RNAi-medieret genmålretning hjælp multiplexede reporter systemer, som muliggør overvågning af centrale kræftcelle-associerede processer. Denne high-indhold screeningmetode er alsidig og kan let tilpasses til at screene for andre typer af store molekylære biblioteker.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En række af luciferase-baserede reportere til overvågning af en bred vifte af cellebiologiske processer er kommercielt tilgængelige. De fleste af disse DNA-konstruktionerne koder luciferase proteiner, som induceres til at udtrykke ved hjælp af specifikke celle stimuli eller perturbationer. De mest robuste transskriptionelt baserede journalister placere udtryk for en luciferaseenzymet under kontrol af syntetiske enhancerelementer eller genpromotoren regioner veletablerede for deres pålidelighed i rapporteringen en fysiologisk relevant transcriptional begivenhed 1,2. Der er også trans-reporter luciferase systemer, der udnytter GAL4-UAS at drive luciferase proteinekspression. GAL4 er en gær transkriptionsaktivator og UAS er en enhancer som Gal4 specifikt binder at aktivere transkriptionen af gensekvenser anbragt nedstrøms af det 3.. Disse typer af luciferase systemer er typisk understøttet af to DNA plasmider - en indkoder GAL4-proteinet fusioneret til regulatory del af et protein af interesse, og den anden koder et luciferase protein placeret under kontrol af en eller flere UAS-sekvenser. Således cellulære luciferase signal afspejler aktivitetsniveauet af proteinet af interesse. En anden almindelig anvendelse af luciferase-baserede reportere er til overvågning proteinstabilitet, hvorved et protein af interesse er fusioneret til en luciferaseenzymet 4.. Uanset hvilken type reporter er en caveat her bemærkes, som man ikke kan påtage sig den særlige karakter af enhver journalist at have været godt afhørt. Således er due diligence kræves i indarbejdelse af nye reporter konstruktioner i enhver forskningsstrategi.

Udvælgelsen af ​​luciferaseenzymet udlæsning kan være lige så vigtig som pålideligheden af ​​DNA-elementer, der styrer dets ekspression. Henviser ildflueluciferase (FL) er den mest almindeligt anvendte enzym i kommercielt tilgængelige konstruktioner, fremkomsten af ​​nye luciferase reporter systemer, der ikke kræver ATP (som det er tilfældetaf FL-baserede reaktioner), eller at inkorporere mere stabile enzymer, der udsender stærke signaler lover at forbedre effektiviteten og pålideligheden af ​​denne forskningsplatform. En vigtig bemærkning for udvælgelsen af ​​luciferase journalister i kemiske undersøgelser er modtagelighed FL til kemisk hæmning, der kunne give anledning til falske rapporter. Det er vores erfaring, er andre enzymer såsom Renilla eller Gaussia luciferase (RL og GL, henholdsvis), der anvender coelenterazin som substrat mindre let hæmmet af små molekyler 5.

Det mest almindelige format for multiplexing luciferase udlæsninger indebærer anvendelse af FL og RL vid udstrækning givet tilgængeligheden af ​​let-at-bruge kits med evnen til sekventielt måle enzymatiske aktiviteter fra en enkelt prøve. I de fleste kits, prøverne først udsat for luciferin at afsløre niveauer af FL aktivitet efterfulgt af en quenching reagens, samtidigt deponeret hos coelenterazin til opnåelse af et sekunDary RL signal. Med tilføjelsen af andre luciferaser, der kan udskilles som GL eller at anvende endnu et substrat, såsom Cypridina luciferase (CL), et større antal muligheder for at skabe høje indhold data ved hjælp luciferaser er dukket op. Et eksempel på en genom-dækkende RNAi screen hjælp af denne teknik kan findes her 6. Disse teknologiske fremskridt har igen ansporet til udvikling af specifikke mekanismer til at slukke hver type luciferaseenzymet for at begrænse cross-talk 7.. I vores hænder, bemærker vi en højere frekvens af "kanteffekter" (uforklarlige tendenser i cellulære aktivitet forbundet med kanten af ​​højtiter dyrkningsplader) med udskilte luciferaser såsom GL eller CL. På den anden side er sådanne secernerede luciferaser anvendelige til kinetiske assays som de giver signal prøvetagning uden forfalsket cellelevedygtighed.

For vores undersøgelse præsenteres her, vil vi samtidigt at overvåge aktiviteten af ​​tre cancer-relevantcellulære processer: p53, Kras og Wnt signaltransduktionsbaner. Reporterne indarbejdet i vores undersøgelse er pp53-TA-Luc FL reporter fra Clontech (herefter benævnt p53-FL reporter) 8, en Elk1-GAL4/UAS-CL reporter-system (herefter Elk-1 reporter, Agilent), og 8X TCF RL reporter, der inkorporerer flere syntetiske enhancerelementer anerkendt af de Wnt pathway transskriptionsregulatorer kendt som T-celle faktorer (eller TCFs) 9-11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hele protokol tager cirka 4 dage.

1.. Udarbejdelse af celler for siRNA og Reporter transfektion

Vi vil introducere her en protokol for afhøre siRNA biblioteker ved hjælp af et lille sæt af siRNAs (384 forskellige siRNA pools array i 96 godt format med hver pulje bestående af 4x siRNAs rettet mod en enkelt gen) fra en genom-dækkende siRNA bibliotek for illustrative formål. Til netop denne undersøgelse vil vi udnytte HCT116 celler, der udviser afvigende Wnt og Kras signalering og p53 aktivitet. Den passende cellelinje i undersøgelser med henblik på afhører andre cellulære processer af interesse skal identificeres og vurderes på en lignende måde.

  1. Vask 5 x 10 cm 2 plader af 80-90% konfluente HCT116 celler med PBS derefter høst celler ved trypsinbehandling under anvendelse af 1 ml trypsinbehandling opløsning / plade efterfulgt af neutralisering med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 2% fetal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / plade.
  2. Overførsel suspenderede celler til en 50 ml konisk rør og centrifugatet ved ~ 130 xg i 5 minutter, fjerne supernatanten, og resuspender cellepelleten i 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% penicillin / streptomycin.
  3. Tæl celle nummer med en celle tæller, og derefter foretage en celle løsning med 10 5 celler / ml, holde 150 ml cellesuspension til det næste trin. Plate 10 4 celler (100 ul) i hver brønd i en 96 brønds cellekultur plade med en Multidrop automatiseret væskedispenser (fremover Multidrop). Cellesuspensionen bør være tilstrækkeligt i dette tilfælde for udpladning 12 x 96 brønde.
  4. Inkubér pladerne med cellerne ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO 2, mens fremstilling af transfektion blandingen.

2.. Forberedelse af Reporter Construct Stock Solution

  1. Isoler høj kvalitet reporter konstruere DNA ved hjælp af standard midiprep kits (NucleoBond Xtra Midi produceret afClontech) og fortyndes DNA til en slutkoncentration på 1 mg / ml for hver reporter.
  2. Forbered 100 ul reporter konstruere stamopløsning ved at kombinere 30 ul af p53-FL, 30 pi 8X TCF-RL, 30 pi Elk1-Gal4, 6 pi UAS-CL og 4 pi H 2 O til at opnå en DNA blandes med en endelig 1:1:1:0.2 forholdet mellem journalister. Endelige DNA koncentration af dette DNA blandes stamopløsning er 0,3 mg / ml.

3.. Forberedelse af siRNA / DNA Transfection Mix

I denne del af protokollen, vil vi forberede siRNA / DNA transfektion blandinger, der vil være tilstrækkelig til transfektion 12 x 96 brønds plader. Til denne test bibliotek af 4 x 96-brønds plade af siRNAs, vil vi transficere hver siRNA pool i tre eksemplarer. Transfektion reagens vil vi benytter kaldes Effectene (Qiagen). I vores hænder dette er det eneste reagens, der virker for samtidig levering af siRNA og DNA i dyrkede celler.

  1. Fortynd 80 pi reporter konstruktion stock solution i 8 ml EC buffer (Effectene Kit) for at opnå en DNA-opløsning med en endelig koncentration på 3 ug / ml. I almindelighed, forberede nok DNA løsning mix for øjeblikkelig brug.
  2. Plade 20 pi af denne DNA-opløsning til hver brønd på en 96 brønds / plade. Antallet af plader med 96 brønde vil afhænge af, hvor mange siRNA pools vil blive testet. For eksempel har vi i dette tilfælde har brug for 4 x 96 brønde til at evaluere 384 forskellige siRNA puljer.
  3. De siRNAs der skal testes, bør være i en stamkoncentration på 5 uM. Hvis ikke, kan de være replika udpladet og fortyndet til denne koncentration vha. den anbefalede fortyndingsbuffer forbundet med hvert bibliotek.
  4. Overfør 2 ul af hver 5 uM siRNA materiel til den tilsvarende brønd af PCR pladen med den fortyndede DNA materiel med en Biomek Automated Liquid Handler. Afhængigt af omfanget af undersøgelsen, kan en multikanals pipette tilstrækkelig.
  5. Nu vil vi tilføje 1 pi Enhancer opløsning (Effectene kit) til hver brønd af DNA / siRNA PLAte. Dette kan igen udføres enten med en automatiseret væskehåndteringsudstyr eller multikanal pipette.
  6. Tillad Enhancer reaktionen foregå ved stuetemperatur i 5 minutter og derefter tilsættes 3 ul Effectene transfektion reagens til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i yderligere 10 min.
  7. At stoppe transfektion kompleks dannelse, tilsættes 10 pi DMEM / 2% FBS / 1% penicillin / streptomycin til hver brønd på PCR-pladen.
  8. Overfør 10 ul af transfektion blandes til hver brønd på 96 brønds plade indeholdende cellerne (hentet fra cellen inkubator). Da hver transfektion vil blive udført i tre eksemplarer, vil den samme blanding anvendes til to ekstra plader med 96 brønde indeholdende celler.
  9. Inkubér cellerne med transfektion blandinger tilsat ved 37 ° C i en fugtig miljø med 5% CO2 i 36 timer.

4.. Bestem Luciferaseaktiviteter fra celleprøver

Efter 36 timer, er Luciferaseaktiviteter klar til målingi transficerede celler. Den endpoint bør fastsættes på en per-eksperiment basis. I vores undersøgelse, havde en 36 hr inkubationstid tidligere givet et tilstrækkeligt robust signal efter mening udfald beslutsomhed. Da denne undersøgelse omfatter flere reportere (én udskilles i dyrkningsmediet, og to andre udtrykkes i cellen cytoplasma), vil vi få målinger fra både dyrkningsmedium samt et cellulært lysat.

  1. Påvisning af CL aktivitet i dyrkningsmediet:
    1. 20 ul dyrkningsmedium er replica-forgyldt i en hvid uigennemsigtig plade med 96 brønde (enten ved hjælp af Biomek Liquid Handler eller multikanal pipette).
    2. Tilsæt 20 ul CL assaypuffer (Målretning Systems) til hver brønd.
    3. Tilsæt 10 ul Cypridina luciferin substrat (Målretning Systems) til hver brønd og afsløre CL aktivitet under anvendelse af et luminometer (den Pherastar pladelæser produceret af BMG for eksempel).
  2. Påvisning af FL og RL aktivitet:
    1. Lyse calen ved først at fjerne dyrkningsmediet. Dette kan opnås hurtigt ved at vende pladen hovedet og kastede medium i en vask. Resterende medium kan fjernes ved forsigtigt at banke på hovedet plade på papirservietter. Tilsæt 30 ul 1X Passive Lysis Buffer (Promega) til hver brønd af celler ved hjælp af Multidrop og sted på en platform rocker (Bellco er én virksomhed, der gør disse) indstille en medium hastighed i 5 min ved RT.
    2. Tilsæt 20 ul af Luciferase Assay Reagent II (del af Promega Dual Luciferase Kit) ved hjælp af Multidrop og straks måle FL aktivitet ved hjælp af luminometer. Dernæst tilsættes Stop & Glo Reagent (Promega), som vil standse FL aktivitet og tillade måling af RL aktivitet. Bemærk: medmindre du bruger substrat mix, der giver forlænget signal varighed (såsom Dual-Glo Luciferase Kits fra Promega), brug af flash kits kræver hurtige målinger på substrat tilsætning (indenfor 5 min).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trods fremskridt inden kortlægning mutational landskab af forskellige kræftformer ved hjælp af massive genomsekvensering indsats 12-14, vi stadig ikke har på plads en systematisk tilgang for at omsætte disse observationer til intervention strategier. I colorectal cancer (CRC), mutationer, der forventes at påvirke dele af tre cellulære processer - Wnt / β-catenin, p53 og Kras signalering - findes i 99% af alle tumorer tyder de er centrale drivkræfter for cellulær transformation i tarmen 13.. Således er kræft genom datasæt sandsynligvis beriget efter gener, der understøtter fællesnævner kræft fremme processer, og at der kunne udnyttes til hurtig identifikation af kræftcelle sårbarheder. At undersøge denne hypotese har vi udtænkt strategier underkastes high-throughput forhør af genfunktioner med hensyn til Wnt / β-catenin, p53, og Kras signalering. Vi først demonstrere specificiteten af ​​hver reporter systemet i single reporter test (fig. 1) og derefter give bevis for, at disse reportere kunne anvendes sammen til samtidige målinger af genaktivitet af disse tre vigtige cellulære processer (figur 2).

Figur 1
Figur 1. High-throughput luciferase-baserede assays til overvågning Wnt / β-catenin, p53 og Kras / Erk pathway status i pattedyrsceller. Robustheden af tre forskellige screening platforme blev individuelt vurderet før multiplexing bruger kontrol siRNAs målretning veletablerede pathway komponenter. Indikerede kolorektal cancer cellelinjer blev transficeret med 8X TCF, pp53-TA-Luc eller Elk-1 ildflueluciferase-kodning reporter konstruerer sammen med puljer af siRNAs målrettet β-catenin, p53 eller Kras, hhv. Pathway-relevante genotyper for hver cellelinie er angivet. Styrken af ​​hvert screening platform blev vurderet af reproducerbarhed af disse siRNAs-inducerede virkninger på det relevante signaltransduktionsvejen. De β-catenin siRNAs har ingen virkning på 8X TCF reporter aktivitet i RKO celler i modsætning til DLD-1 og HCT-116 celler, der er henholdsvis mangelfuld i APC vej suppressor protein og udtrykker en aktiveret form af β-catenin. Klik her se større figur .

Figur 2
Figur 2. Multiplexing luciferase baserede reportere til high-indhold cellulær analyse af genfunktion. A. Skematisk fremstilling af en strategi for samtidig overvågning Wnt / β-cat Enin, p53, og Kras pathway aktiviteter. FL = ildflueluciferase, RL = Renilla-luciferase, CL = Cypridina luciferase (secerneret enzym). FL og RL aktiviteterne i lysat bestemmes ved hjælp af luciferin og coelenterazin substrater. CL aktivitet i dyrkningsmediet måles ved anvendelse oxyluciferin. * Andre reportersystemer kan indarbejdes i denne protokol til at øge indholdet af hvert forsøg. For eksempel kan CytoTox Mel assayet anvendes til at overvåge cellulær toksicitet ved prøveudtagning niveauet af en intracellulær protease frigives i dyrkningsmediet. Tilføjelsen af CytoTox assayreagens påvirker ikke aktiviteten af CL reporter. B. Identifikation af sti-specifikke sårbarheder hjælp RNAi. Evne multiplex luciferase-systemet beskrives i "A" for at kvantificere genet engagement til cellulær funktion blev testet under anvendelse af de angivne siRNA pools.nk "> Klik her for at se større figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Der er flere leverandører af luciferase-baserede reporter systemer (såsom Promega, Målretning Systems, New England Biolabs og Thermo Fisher), der giver nyttige on-line ressourcer til dem, underholdende en high-throughput screening for første gang. Desuden bør en række fremragende anmeldelser om at optimere brugen af high-throughput skærme til gen-opdagelse og hvordan RNAi-baserede screening resultater kan integreres med andre-omics-baserede dataserier være nyttigt 15,16. Metoder til udvælgelse af "hits" fra high-throughput skærme er genstand for en anden diskussion, som er uden for rammerne af denne rapport. Flere anmeldelser om dette emne er til rådighed 17,18. Men et vigtigt kriterium for validering udvalgte hits fra skærme baseret på anvendelse af transkriptionelt aktiverede reportere er evnen til samme perturbagen (RNAi-eller kemisk baseret) at inducere den samme virkning på validerede målgener som målt ved anvendelse af RT-PCR, qPCREller microarray analyse. Desuden huske på, at størrelsen af ​​respons som målt ved reporter typisk er højere end induktionen af ​​et endogent reporter eftersom en del af et succesfuldt syntetisk reporter er at tilvejebringe et robust signal. Endelig er en fordel ved denne co-transfektion strategi er den lethed, hvormed man kan hurtigt samle forskellige reporter cocktails til overvågning af en ønsket sæt af cellulære aktiviteter. Selvom mere arbejdskrævende, vil brugen af ​​cellelinier stabilt huser reportere sandsynligvis øge signal til støj-forholdet givet variabiliteten i respons er nu primært begrænset til siRNA transfektionseffektivitet alene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

OK, og LL er forfattere på en verserende patent vedrørende multiplex luciferase teknologi.

Acknowledgments

Vi anerkender finansiere støtte fra CPRIT (RP100119) og Welch Foundation (I 1665).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System Agilent Technologies Inc. 219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector Clontech Lab Inc. 631914
Effectene Transfection Reagent Qiagen Inc. 301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega Corp. E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent Targeting Systems VLAR-1
HCT116 cells ATCC CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay Promega Corp. G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser Labsystems Inc. Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter Inc. A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader BMG Labtech Inc. 0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers Hausser Scientific Company 1490

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
  2. Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
  3. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
  4. Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
  5. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
  6. Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
  7. Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. Lum, L. D., Kulak, O. (2012).
  8. Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
  9. DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
  10. Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
  11. Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
  12. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
  13. Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. (2012).
  14. Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
  15. Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
  16. Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
  17. Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
  18. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
En Multiplexed Luciferase-baseret Screening Platform for forhører Kræft-associeret signaltransduktion i dyrkede celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulak, O., Lum, L. A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (77), e50369, doi:10.3791/50369 (2013).More

Kulak, O., Lum, L. A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (77), e50369, doi:10.3791/50369 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter