Summary
Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.
Abstract
Genoom-schaal ondervraging van gen-functie met behulp van RNA interferentie (RNAi) betekent een enorme belofte voor de snelle identificatie van chemisch handelbaar kankercel kwetsbaarheden. De kans dat deze technologie is het onvermogen om snel bakenen de mechanistische basis van fenotypische resultaten en dus stelt de ontwikkeling van moleculair gerichte therapie. We schetsen hier methoden om cellulaire fenotypes geïnduceerd door RNAi-gemedieerde gen-targeting met behulp van multiplex-reporter systemen die de controle op belangrijke kankercel-geassocieerde processen kunnen deconstrueren. Deze high content methode is veelzijdig en kan gemakkelijk worden aangepast voor de screening van andere typen grote moleculaire bibliotheken.
Introduction
Een verscheidenheid van luciferase-gebaseerde reporters voor het bewaken van een uiteenlopende reeks van celbiologische processen zijn in de handel verkrijgbaar. De meerderheid van deze DNA-constructen coderen voor luciferase eiwitten die worden geïnduceerd om te drukken door specifieke cel stimuli of verstoringen. De robuuste transcriptie gebaseerde reporters plaats de expressie van een luciferase-enzym onder de controle van synthetische enhancer elementen of gen promoter regio gevestigde om hun betrouwbaarheid bij het rapporteren een fysiologisch relevante transcriptionele event 1,2. Er zijn ook trans-reporter luciferase systemen die GAL4-UAS gebruiken om luciferase-eiwit expressie rijden. Gal4 is een gist transcriptionele activator en het UAS is een versterker waaraan Gal4 specifiek bindt aan de transcriptie van gensequenties geplaatst stroomafwaarts van het activeren 3. Deze types van luciferase systemen worden typisch door twee DNA plasmiden - een codeert voor het GAL4-eiwit gefuseerd aan de regulatory gedeelte van een eiwit van belang codeert en de tweede een luciferase-eiwit onder de controle van een of meer UAS sequenties geplaatst. Dus de cellulaire luciferase signaal geeft het activiteitsniveau van het eiwit van belang. Een ander algemeen gebruik van luciferase-gebaseerde reporters bewaakt u eiwitstabiliteit waarbij een eiwit van belang gefuseerd aan een luciferase-enzym 4. Ongeacht het type van de reporter wordt een waarschuwing emptor hier genoemd als een van de specificiteit van elk reporter goed te zijn ondervraagd kan dragen. Zo is zorgvuldigheid vereist in de integratie van nieuwe reporter constructen in een onderzoeksstrategie.
De keuze van het luciferase-enzym uitlezing kan net zo belangrijk als de betrouwbaarheid van de DNA elementen die de expressie controleren. Dat vuurvlieg luciferase (FL) is de meest gebruikte enzym in de handel verkrijgbare constructen, de komst van nieuwe luciferase reporter systemen niet behoeft ATP (zoals bijvan FL-based reacties) of die betrekking hebben op meer stabiele enzymen die sterkere signalen uitzenden beloven om de efficiëntie en betrouwbaarheid van dit onderzoek platform te verbeteren. Een belangrijke opmerking met betrekking tot de selectie van luciferase reporters in chemische studies is de gevoeligheid van FL om chemische remming die aanleiding zouden kunnen geven tot valse rapporten. In onze ervaring, andere enzymen zoals Renilla of Gaussia luciferase (RL en GL, respectievelijk) dat coelenterazine gebruiken als een substraat minder gemakkelijk geremd door kleine moleculen 5.
De meest voorkomende formaat voor multiplexing luciferase lees-outs houdt het gebruik van FL en RL grotendeels gezien de beschikbaarheid van eenvoudig te gebruiken kits met de mogelijkheid om sequentieel te meten enzymatische activiteiten van een enkel monster. In de meeste kits worden monsters eerst blootgesteld aan luciferine niveaus van FL activiteit gevolgd door quenching reagens dat gelijktijdig afgezet met coelenterazine een secon leveren onthullendaire RL signaal. Met de toevoeging van andere luciferasen die kunnen worden uitgescheiden, zoals GL of dit gebruik nog een ander substraat zoals Cypridina luciferase (CL), een groter aantal mogelijkheden voor het genereren van een grote hoeveelheid gegevens met luciferasen ontstaan. Een voorbeeld van een genoom-brede RNAi scherm met behulp van deze techniek kan hier 6 te vinden. Deze technologische ontwikkelingen hebben op hun beurt geleid tot de ontwikkeling van specifieke mechanismen om elk type luciferase enzym lessen om overspraak 7 te beperken. In onze handen, merken we een grotere frequentie van "edge effecten" (onverklaarbare trends in de cellulaire activiteit in verband met de rand van een hoge titer cultuur platen), met afgescheiden luciferases zoals GL of CL. Anderzijds, zoals afgescheiden luciferasen bruikbaar voor kinetische analyses zoals zij stellen signaalbemonstering zonder knoeien cellevensvatbaarheid.
Voor ons hier gepresenteerde onderzoek, zullen we tegelijkertijd de activiteit van de drie kanker-relevantcellulaire processen: de p53, Kras, en Wnt signaaltransductie. De reporters opgenomen in onze studie is de pp53-TA-Luc reporter FL van Clontech (hierna aangeduid als p53-FL reporter) 8, een Elk1-GAL4/UAS-CL reportersysteem (voortaan Elk-1 reporter, Agilent), en de 8X TCF RL verslaggever die meerdere synthetische enhancerelementen erkend door de Wnt-pathway transcriptieregulatoren bekend als T-cel-factoren (of TCF) 9-11 bevat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gehele protocol duurt ongeveer 4 dagen.
1. Bereiding van Cellen voor siRNA transfectie en Reporter
We zullen hier de invoering van een protocol voor het ondervragen van siRNA bibliotheken met behulp van een kleine set van siRNA's (384 verschillende siRNA zwembaden array in 96 well formaat met elk zwembad bestaande uit 4x siRNA gericht op een enkel gen) van een genoom-brede siRNA bibliotheek voor illustratieve doeleinden. Voor deze specifieke studie, zullen we HCT116 cellen die afwijkend Wnt en Kras signalering vertonen, en p53-activiteit te exploiteren. De geschikte cellijn studies naar ondervragen andere cellulaire processen plaats moeten worden geïdentificeerd en op dezelfde wijze geëvalueerd.
- Wassen 5 x 10 cm 2 platen van 80-90% confluente HCT116 cellen met PBS vervolgens oogsten cellen door behandeling met trypsine met 1 ml van trypsine oplossing / plaat gevolgd door neutralisatie met 10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 2% fetal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / plaat.
- Overdracht gesuspendeerde cellen een 50 ml conische buis en Centrifugeer bij ~ 130 xg gedurende 5 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% penicilline / streptomycine.
- Tel het aantal cellen met een cel teller, en maak dan een mobiele oplossing met 10 5 cellen / ml, houd 150 ml celsuspensie voor de volgende stap. Plaat 10 4 cellen (100 ui) in elk putje van een 96 putjes celkweekplaat met een Multidrop automatische vloeistof dispenser (voortaan Multidrop). De celsuspensie moet in dit geval voldoende voor plateren 12 x 96 putjes zijn.
- Incubeer de platen met cellen bij 37 ° C in een incubator met 5% CO 2 wanneer het de transfectie mengsel.
2. Voorbereiden van de Verslaggever Construct Stock Solution
- Isoleer hoogwaardige reporterconstruct DNA met behulp van standaard Midiprep kits (NucleoBond Xtra Midi geproduceerd doorClontech) en los het DNA tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml voor elke reporter.
- Bereid 100 ul van reporter construct voorraadoplossing door het combineren van 30 pi p53-FL, 30 gl 8X TCF-RL, 30 gl ELK1-Gal4, 6 pl UAS-CL en 4 ui H2O een DNA mix met verwezenlijken een laatste 1:1:1:0.2 verhouding van de reporters. Uiteindelijke DNA concentratie van dit DNA mix voorraadoplossing is 0,3 mg / ml.
3. Voorbereiden van de siRNA / DNA transfectie Mix
In dit deel van het protocol, zullen we ons voorbereiden siRNA / DNA transfectie mixen die voldoende is voor transfectie 12 x 96 well platen zullen zijn. Voor deze test bibliotheek van 4 x 96 well plaat van siRNA's, zullen we elke siRNA zwembad transfecteren in drievoud. Het transfectie reagens we gebruiken heet Effectene (Qiagen). In onze handen is dit het enige reagens dat werkt voor de gelijktijdige levering van siRNA en DNA in gekweekte cellen.
- Verdun 80 pi van reporter construct voorraad solution in 8 ml buffer EG (Effectene Kit) een DNA-oplossing te bereiken met een eindconcentratie van 3 ug / ml. In het algemeen bereiden genoeg DNA-oplossing mix voor onmiddellijk gebruik.
- Plaat 20 ul van deze DNA-oplossing aan elk putje van een 96 putjes / plaat. Het aantal platen met 96 putjes zal afhangen van hoeveel siRNA zwembaden zullen worden getest. Bijvoorbeeld, in dit geval hebben we 4 x 96 putjes moeten 384 verschillende siRNA pools evalueren.
- De te testen siRNAs moet op een voorraad concentratie van 5 uM. Zo niet, kunnen ze replica uitgeplaat en verdund tot deze concentratie met de aanbevolen verdunning buffer die bij elke library.
- Overdracht van 2 pi van elke 5 uM siRNA voorraad aan de overeenkomstige putje van de PCR-plaat met de verdunde DNA voorraad met een Biomek geautomatiseerde Liquid Handler. Afhankelijk van de omvang van het onderzoek, kan Meerkanaalspipet volstaan.
- Nu zullen we 1 pl Enhancer oplossing (Effectene kit) aan elk putje van de DNA / siRNA plate. Dit weer kan worden bereikt, hetzij met een geautomatiseerde vloeibare handler of multichannel pipet.
- Laat de Enhancer reactie plaatsvinden bij kamertemperatuur gedurende 5 min voeg 3 pl Effectene transfectie reagens aan elk putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende een extra 10 minuten.
- Voor transfectie complexvorming stoppen, voeg 10 ul DMEM / 2% FBS / 1% penicilline / streptomycine aan elk putje van de PCR plaat.
- Breng 10 pl van de transfectiemix aan elk putje van de plaat met 96 putjes bevattende cellen (opgehaald uit de cel incubator). Aangezien elke transfectie wordt uitgevoerd in drievoud, zal hetzelfde mengsel worden aangebracht op twee extra platen met 96 putjes die cellen bevatten.
- Incubeer de cellen met transfectie mengsel toegevoegd bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving met 5% CO2 gedurende 36 uur.
4. Bepaal Luciferase activiteiten van Cell Samples
Na 36 uur, luciferase activiteiten zijn klaar voor de metingin getransfecteerde cellen. Het eindpunt moet worden bepaald op een per-experiment basis. In onze studie, had een 36 uur incubatietijd eerder leverde een voldoende sterk signaal naar betekenis uitkomst bepalen. Aangezien deze studie bevat meerdere reporters (een uitgescheiden in het kweekmedium, en twee andere uitgedrukt in het cytoplasma), zullen we metingen te verkrijgen van zowel kweekmedium als een cellulaire lysaat.
- Detectie van CL-activiteit in het kweekmedium:
- 20 pl kweekmedium is replica-uitgeplaat in een witte ondoorzichtige plaat met 96 putjes (hetzij met behulp van de Biomek Liquid Handler of multichannel pipet).
- Voeg 20 ul van CL assaybuffer (Targeting Systems) aan elk putje.
- Voeg 10 ul van Cypridina luciferin substraat (Targeting Systems) aan elk putje en detecteren CL activiteit met behulp van een lichtmeter (de Pherastar plaataflezer geproduceerd door BMG bijvoorbeeld).
- Detectie van FL en RL activiteit:
- Lyse de cells door eerst het kweekmedium. Dit kan snel worden bereikt door het draaien plaat ondersteboven en gooien medium in een gootsteen. Resterende medium kan worden verwijderd door voorzichtig te tikken op de kop plaat op keukenpapier. Voeg 30 ul van 1X Passief lyseerbuffer (Promega) aan elk putje van cellen met behulp van de multidropbedrijf en plaats op een platform rocker (Bellco is een bedrijf dat maakt deze) een gemiddelde snelheid gedurende 5 minuten bij de RT.
- Voeg 20 ul van het Luciferase Assay Reagent II (deel van het Promega Dual Luciferase Kit) met de Multidrop en meten direct FL activiteit met de luminometer. Voeg vervolgens Stop & Glo reagens (Promega) dat de FL-activiteit zal uitdoven en laten meting van RL-activiteit. Opmerking: tenzij u gebruik maakt van substraat mixen die langere signaalduur (zoals Dual-Glo Luciferase Kits van Promega) toestaan, het gebruik van flash-kits vereist een snelle meting op substraat toevoeging (binnen 5 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ondanks de vooruitgang in kaart brengen van de mutatie-landschap van verschillende vormen van kanker met behulp van enorme genoom sequencing inspanningen 12-14, we nog steeds niet beschikken over een systematische aanpak voor het vertalen van deze observaties in interventiestrategieën. In colorectale kanker (CRC), mutaties die voorspeld bestanddelen drie cellulaire processen beïnvloeden - Wnt / β-catenine, p53, Kras en signalering - worden gevonden in 99% van alle tumoren suggereren zij pijlers van cellulaire transformatie in de darm 13. Zo worden kankergenoom datasets waarschijnlijk verrijkt naar genen die gemeenschappelijke noemer kanker te ondersteunen bevorderen processen, en die kunnen worden benut voor de snelle identificatie van kankercel kwetsbaarheden. Om deze hypothese te onderzoeken, hebben we strategieën ontvankelijk voor high-throughput ondervraging van gen functie naar Wnt / β-catenine, p53 en Kras signalering ontwikkeld. We hebben eerst tonen de specificiteit van elke reporter systeem in enkele reporter test (figuur 1) en aantonen dat deze reporters samen kunnen worden gebruikt om gelijktijdig genactiviteit van deze drie belangrijke cellulaire processen (Figuur 2).
Figuur 1. High-throughput luciferase-gebaseerde testen voor controle Wnt / β-catenine, p53 en Kras / Erk route status zoogdiercellen. De robuustheid van drie verschillende vertoningplatforms werden afzonderlijk onderzocht vóór multiplexing met controle siRNA gericht gevestigde pathway componenten. Aangegeven colorectale kanker cellijnen werden getransfecteerd met de 8X TCF, pp53-TA-Luc of eland-1 vuurvlieg luciferase reporter coderende constructen met pools van siRNAs gericht β-catenine, p53, of Kras respectievelijk. Pathway-relevante genotypes voor elke cellijn worden aangegeven. De sterkte van elke screeningsplatform werd geëvalueerd door de reproduceerbaarheid van deze siRNA-geïnduceerde effecten op het betreffende signaal transductie pathway. De β-catenine siRNA geen effect op 8X TCF reporter activiteit RKO-cellen in tegenstelling tot DLD-1 en HCT-116 cellen die deficiënt zijn in respectievelijk de APC pathway suppressor eiwit expressie en een geactiveerde vorm van β-catenine. hier bekijk grotere afbeelding .
Figuur 2. Multiplexing luciferase gebaseerde verslaggevers voor hoge-gehalte cellulaire analyse van gen-functie. A. Schematische weergave van een strategie voor het gelijktijdig bewaken Wnt / β-cat Enin, p53 en Kras traject activiteiten. FL = vuurvliegluciferase, RL = Renilla luciferase, CL = Cypridina luciferase (uitgescheiden enzym). FL en RL activiteiten in lysaat worden bepaald met behulp van luciferin en coelenterazine substraten. CL activiteit in het kweekmedium gemeten met oxyluciferin. * Andere reporter systemen kunnen in dit protocol worden opgenomen om de inhoud van elk experiment te verhogen. Bijvoorbeeld kan de CytoTox Flour assay gebruikt om cellulaire toxiciteit te bepalen door bemonstering van het niveau van een intracellulaire protease vrij in het kweekmedium. De toevoeging van de assay reagens CytoTox beïnvloedt de activiteit van de reporter CL. B. Identificatie van route-kwetsbaarheden RNAi. Het vermogen van de gemultiplexte luciferase systeem "A" beschreven gen toewijding kwantificeren celfunctie werd getest gebruikmakend van de aangegeven siRNA pools.nk "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende leveranciers van luciferase-gebaseerde reporter systemen (zoals Promega, Targeting Systems, New England Biolabs, en Thermo Fisher) die nuttige middelen on-line bieden voor degenen onderhoudend een high-throughput-scherm voor de eerste keer. Daarnaast moet een aantal uitstekende recensies over het optimaliseren van het gebruik van high-throughput-schermen voor ontdekking van genen en hoe RNAi-gebaseerde screening resultaten kan worden geïntegreerd met andere-omics-methoden verkregen gegevens zijn nuttig 15,16. Werkwijzen voor de selectie van "hits" van high-throughput screens zijn reeds een andere discussie die buiten de reikwijdte van dit rapport. Meerdere beoordelingen over dit onderwerp beschikbaar 17,18. Echter, een belangrijk criterium voor het valideren geselecteerde treffers van beeldschermen gebaseerd op het gebruik van transcriptioneel geactiveerd reporters is de mogelijkheid om dezelfde perturbagen (RNAi-of chemische basis) om hetzelfde effect te hebben op de gevalideerde doelgenen zoals gemeten met RT-PCR, qPCROf microarray analyse. Bovendien, in gedachten houden dat de omvang van de respons, zoals gemeten door de verslaggever is meestal hoger dan de inductie van een endogene reporter gezien het feit dat een kenmerk van een succesvol synthetisch reporter is voor een stabiel signaal te voorzien. Ten slotte is een voordeel van deze co-transfectie strategie is het gemak waarmee men snel monteren verschillende reporter cocktails voor het bewaken van een gewenste reeks van cellulaire activiteiten. Hoewel arbeidsintensiever, zou het gebruik van cellijnen die stabiel het herbergen van de reporters waarschijnlijk toenemen de signaal-ruisverhouding gezien de variabiliteit in respons ondertussen hoofdzakelijk beperkt tot siRNA transfectie efficiëntie alleen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
OK en LL zijn auteurs op een octrooi met betrekking tot multiplex luciferase-technologie.
Acknowledgments
Wij erkennen de steun financieren uit CPRIT (RP100119) en de Welch Foundation (I-1665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. Lum, L. D., Kulak, O. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
