Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء التجارب لأداء الإسفار
Abstract
مضان التهجين في الموضع (FISH) أسلوب يسمح احد للكشف عن الأحماض النووية في البيئة الخلوية المحلية. ونحن هنا نقدم بروتوكول لاستخدام الأسماك لتحديد عدد خلايا الخميرة في mRNAs واحد. يمكن زراعتها الخلايا في أي حالة من الفائدة ومن ثم إصلاح وجعل نفاذية. وفي وقت لاحق، وتستخدم متعددة deoxyoligonucleotides الذين تقطعت بهم السبل واحد مترافق إلى الأصباغ الفلورية لتسمية وتصور mRNAs و. وكميا مضان الحيود محدودة من جزيئات الرنا واحد باستخدام خوارزمية بقعة الكشف لتحديد وحساب عدد mRNAs ولكل خلية. في حين أن أساليب القياس الكمي أكثر القياسية من البقع الشمالية، RT-PCR وميكروأرس التعبير الجيني تقديم معلومات عن متوسط mRNAs والسكان في الجزء الأكبر، FISH يسهل كل من العد وتوطين هذه mRNAs وفي الخلايا واحد في قرار جزيء واحد.
Introduction
باستخدام تقنيات قياس السائبة، وأنه ليس من الممكن لفحص عدد من النصوص أو النشاط النسخي داخل الخلايا واحد 1. ويمكن استخدام البروتينات الفلورية يقودها المروجين من الفائدة للصحفيين في التعبير الجيني معالجة هذه المسألة إلى حد ما، ولكن الوقت اللازم لالبروتينات الفلورية إلى أضعاف يحجب ديناميكية في وقت مبكر. البروتينات الفلورية طويلة الأجل أيضا لا يمكن أن يقدم تقريرا أعمار مرنا. طريقة FISH يمكن استخدامها لفحص مرنا خلال دورة الحياة الكاملة، من بدء النسخ في النواة إلى النضج اللاحقة والاضمحلال في الخلايا واحدة، مع قرار جزيء واحد.
النص الأصلي التجارب في الموقع لتصور الأحماض النووية المستخدمة تحقيقات RNA رديولبلد لبحث عناصر الحمض النووي. وشملت هذه تصور الحمض النووي الريباسي في المبيضين من الضفدع القيطم المورق 2 والحمض النووي القمر الصناعي في الأنسجة الماوس 3. أول الفلورسنت خبرة في الموقعتستخدم iment جزيء RNA ملحوظ مع fluorophore للتحقيق خاصة تسلسل الحمض النووي 4. وكان أول تطبيق لتحقيقات الفلورسنت لتصور الحمض النووي الريبي في الموقع التصور من الأكتين التعبير الجيني في عضلة الدجاج زراعة الأنسجة 5. وفي الآونة الأخيرة، في الخميرة في مهدها، وقد استخدمت FISH للتحقيق التذبذبات في النسخ خلال دورة التمثيل الغذائي الخميرة 6، واضمحلال mRNAs وخلال دورة الخلية تطور 7، وتوطين المكانية من النصوص مرنا أثناء الانقسام 8. وقد استخدمت الأسماك في الخميرة لإظهار أن تقلبات غير مترابطة في الجينات المحولة بشكل جوهري، التي تشكل أكثر من نصف جميع جينات الخميرة، تنشأ من غير مترابطة بدء النسخ 9. في الأنواع غير الخميرة، وقد استخدمت FISH لتحديد علامات الخلايا الجذعية في الأمعاء الماوس 10 و لتحديد أن انتفاذ غير مكتملة من مصائر خلية يمكن أن تنجم عن التقلبات العشوائية التعبير الجيني في C.الأجنة ايليجانس 11.
طريقة FISH الموصوفة هنا يعمل عن طريق التهجين صبغ المسمى، تحقيقات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد لمرنا الرسائل. يتم تصوير الخلايا ويتم حساب mRNAs وباستخدام خوارزمية للكشف عن بقعة. يمكن أن تتولد تحقيقات واحد الذين تقطعت بهم السبل مع المزج الحمض النووي ومن ثم المسمى (المشار إليها هنا كما تحقيقات المغني) أو أمر تجاريا باسم تحقيقات ما قبل المسمى (تحقيقات ستيلاريس) 12،13. وهناك فرق كبير بين المغني وستيلاريس تحقيقات هو أن تحقيقات المغني هي أطول (~ 50 BP) ومتعددة وصفت في حين أن تحقيقات ستيلاريس قصيرة (~ 20 BP) مع تسمية واحدة فقط لكل التحقيق، كما وصفها راج وآخرون 14. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم نهج ستيلاريس العديد من تحقيقات في الجين من ذلك من المغني (~ 30 مقابل 5 تحقيقات في الجينات، على التوالي). أدناه ونحن نقدم البروتوكول الذي يصف استخدام أي نوع من التحقيق. في القسم 2، ونحن نقدم بروتوكول لوصفها الأميني الآليل تحقيقات التي تحتوي على ثيميدين-Wإيث صبغة قبرصي الذي تم اختياره. وتقدم لمحة عامة عن الخطوات الحسابية المطلوبة لتحديد اماكن مرنا واحد في القسم 7.
Protocol
الشكلان 1 و 2 هي الخطط للإجراءات التجريبية FISH وخطوط الأنابيب تحليل الصور المستخدمة لقياس الصور FISH.
1. حلول لإعداد
* الحلول أدناه هي للاستخدام مع تحقيقات مغنية. إذا باستخدام مجسات ستيلاريس، يستعاض عن عبارة "الفورماميد 40٪" مع "الفورماميد 10٪" في كل العازلة التهجين والعازلة غسل. تغييرات إضافية العازلة التهجين عند استخدام مجسات ستيلاريس هي (1) إضافة 1 غ كبريتات ديكستران و (2) لا تشمل 10 ملغ ssDNA.
العازلة B
8 مل 1 M KH 2 PO 4
41.5 مل 1M K 2 هبو 4
109.3 ز السوربيتول
الواق Spheroplasting
890 ميكرولتر العازلة B
100 VRC ميكرولتر
10 ميكرولتر 25،000 U / مل Lyticase
2 ميكرولتر β-المركابتويثانول
<STRONG> العازلة التهجين (10 مل، الحجم النهائي)
10 ملغ E. القولونية الحمض الريبي النووي النقال
10 ملغ ssDNA *
100 ميكرولتر 200 ملي الأسهم VRC
40 ميكرولتر من 50 ملغ / مل BSA
1 مل 20X SSC
4 مل 40٪ الفورماميد *
المياه مجانا nuclease (إلى 10 مل الحجم النهائي)
1 غرام كبريتات ديكستران *
يجوز إبقاء * العازلة التهجين في 0.5 مل aliquots في -20 درجة مئوية لمدة الراحة.
غسل العازلة (50 مل، الحجم النهائي)
5 مل 20X SSC
20 مل 40٪ الفورماميد *
المياه مجانا nuclease (إلى 50 مل الحجم النهائي)
وضع العلامات العازلة
1.06 غرام كربونات الصوديوم
100 مل DEPC المياه
الرقم الهيدروجيني 9
2. مسبار وضع العلامات (المسابر المغني فقط)
نحصل على هذه التحقيقات عن طريق التخليق في المنزل باستخدام قليل النوكليوتيد جهاز التوليف ABI. مثال او نموذجحليف، وقد تم تجميع 4-5 ~ 50 [أليغنوكليوتيد BP التي هي مثلي إلى الجينات في المصالح، استبدال ثيميدين الأميني الآليل لعدة thymidines متباعدة لا يقل عن 8، ويفضل 10 + بي بي بعيدا. بسبب حساسيتها للأوزون، ونحن نعمل في منشأة خالية من الأوزون عند استخدام الأصباغ قبرصي.
- الحصول ~ 5 تحقيقات و resuspend في 100 ميكرولتر المياه - تركيزات الاختيار على معمل NanoDrop.
- اعتمادا على كيفية العديد من تحقيقات / الجينات، والجمع بين ما مجموعه 10 أليغنوكليوتيد] ميكروغرام / الجين (على سبيل المثال إذا لديك 5 تحقيقات / الجينات، ثم تريد 2 ميكروغرام / التحقيق).
- استخدام الأعمدة QIAquick لتنقية تحقيقات وفقا لQIAquick النوكليوتيدات بروتوكول كيت إزالة.
- إضافة 10 وحدات التخزين الاحتياطي PN إلى الحجم الكلي للتحقيقات المشتركة والمزيج.
- تطبيق نموذج لعمود QIAquick - إذا كان إجمالي حجم أكبر من 750 ميكرولتر، وتدور باستمرار مرتين باستخدام نصف حجم في كل دورة
- اسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي 1 دقيقة في 6،000 دورة في الدقيقة.
- يغسل مع 750 ميكرولتر PE العازلة.
- نبذ1 دقيقة في 6،000 دورة في الدقيقة.
- التخلص من التدفق من خلال وعمود إعادة الدوران لمدة 1 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة لتجف.
- عمود QIAquick مكان في أنبوب microcentrifuge جديدة والحمض النووي أزل مع 50 ميكرولتر H 2 O - تأكد من H 2 O قياس pH ضمن 7.0 و 8.5 ويتم وضعها مباشرة على الغشاء.
- اسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13،000 دورة في الدقيقة لأزل الحمض النووي.
- يجفد الحمض النووي في 45 درجة مئوية.
- بيليه resuspend في 10 ميكرولتر العازلة وضع العلامات وإضافة إلى أنبوب الصبغة دون لمس صبغ.
- كرر مع 10 ميكرولتر العازلة وسم آخر.
- وتدور الدوامة أسفل أنبوب من صبغ والحمض النووي.
- تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في الظلام في RT O / N إلى التسمية.
- كرر QIAquick النوكليوتيدات بروتوكول كيت إزالة. أداء مع اثنين من الاختلافات:
- إضافة 200 ميكرولتر العازلة PN إلى تحقيقات ووضع مجسات وصفت من خلال أعمدة 2X.
- القيام 3 يغسل مع العازلة PE من أجل يغسل أي صبغة غير مرتبط قبل شطف. - AFثالثا شطف الحصول على تركيز عن طريق معمل NanoDrop. كفاءة وضع العلامات هو عادة ~ 0.25 بمول / نانوغرام من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد.
3. ساترة التحضير
- مكان coverslips على على الشرائح في البلازما تأنق فراغ غرفة ( http://www.plasmapreen.com/ ) (وأقرب إلى مركز أفضل).
- وضع فراغ الغرفة في الميكروويف وتأكد من اغلاق ذلك.
- بدوره على مضخة أولا ثم تشغيل فراغ مرة واحدة فقط والتي المضخة.
- بدوره على ميكروويف، ووقف 5 ثوانى بعد البلازما مرئيا.
- إيقاف فراغ ثم ضخ.
- سحب فراغ الغرفة وإزالة coverslips على بالملقط (تلك التي وقعت تحتاج إلى تنظيفها مرة أخرى).
- مكان coverslips على الجانب تنظيف في لوحات ال 12 جيدا.
4. إجراء التثبيت
- تنمو الخميرة إلى OD 600 من حوالي 0.1-0.2 في وسائل الإعلام الحد الأدنى. 10 مل من الخلايا ينتج ما يكفي FOR ~ 10 التهجين منفصلة.
- إضافة حجم 1/10 37٪ الفورمالديهايد مباشرة الى وسائل الاعلام النمو (10 مل من ثقافة + 1 مل 37٪ فورمالدهيد) وترك الجلوس لمدة 45 دقيقة.
- غسل 2X مع 1 مل الجليد العازلة B الباردة في أنبوب microcentrifuge (يمكن أن تدور في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة).
- إضافة 1 مل من العازلة spheroplasting.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تحقق الخلايا كل بضع دقائق تحت المجهر حتى معظم الخلايا هم من السود (أي ليست مرحلة مشرق).
- غسل 2X مع الثلج الباردة العازلة B، الغزل على سرعة منخفضة (~ 3،500 دورة في الدقيقة).
- إضافة 1 مل من 70٪ ETOH، resuspend بلطف وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (يمكن تخزين أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية).
5. إجراء التهجين
- إعداد الحل التهجين: ل100 ميكرولتر من العازلة التهجين، إضافة 1-3 ميكرولتر من التحقيق، ثم دوامة وأجهزة الطرد المركزي. تحقيقات المغني استخدام 8-10 إجمالي نانوغرام لكل مجموعة التحقيق (أي في الجينات). لقد التقط تصل إلى 3 جينات في وقت واحد مع 3 DIFيحدد مختلفتين المسبار المسمى.
تأكد لتدفئة حل التهجين إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتحه.
لتحقيقات ستيلاريس، فمن المستحسن أن تبدأ 4 ردود الفعل تهجين منفصلة عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من كل 1:10، 1:20، 1:50 و 1:100 التخفيفات عمل تحقيقات لمعرفة أي واحد هو الأمثل. يتم إعداد التخفيفات عمل تحقيقات في ستيلاريس العازلة التهجين.
- أجهزة الطرد المركزي (لجميع الخطوات اللاحقة؛ 3،500 دورة في الدقيقة؛ 5 دقائق) الخلايا الثابتة (على سبيل المثال 200 ميكرولتر) ونضح بعيدا الإيثانول.
- resuspend بلطف في 1 مل العازلة يغسل الذي يحتوي على نفس النسبة الفورماميد كما العازلة التهجين. اسمحوا الوقوف لمدة 2-5 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة وغسل العازلة نضح، ثم يضاف محلول التهجين. احتضان في الظلام مع الهز لطيف، O / N عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: الإجراء التالي هو لتطبيق الخلايا / التصوير coverslips على. لثashing / خلايا التصوير في لوحات 96 جيدا، بما في ذلك البديل أنواع الاكسجين التفاعلية زبال حل انظر http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.
- في اليوم التالي، أو في وقت مبكر، نظيفة (انظر الداخلي) وعلاج ينزلق الغطاء مع 150 ميكرولتر 0.01٪ بولي-L-يسين لمدة 5 دقائق. نضح، اسمحوا الجافة، وغسل 3X مع DH 2 O واسمحوا الجافة.
- في الصباح، إضافة 1 مل من غسل العازلة للعينة، resuspend بلطف، الطرد المركزي ونضح، ثم في resuspend 1 مل أخرى من غسل العازلة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- غسل 2X مع SSC + 0.1٪ تريتون X-100 في RT 15 دقيقة على شاكر.
- اتخاذ تصاعد المتوسطة من الفريزر لتمكينه من الخروج إلى RT قبل التركيب.
- غسل مع 1X SSC في RT 15 دقيقة على شاكر.
- تمييع دابي في برنامج تلفزيوني (0.1 ميكروغرام / مل النهائي) والخلايا resuspend في 150 ميكرولتر.
- مكان حل على تنظيفها / بولي اليس الفضلاتيد تغطية زلات في صفيحة ال 12 جيدا؛ لا يقل عن 30 دقيقة دون عائق.
- إزالة الحل (قد وضعه على زلة غطاء الغيار على سبيل الاحتياط) وغسل 3x مع 1 مل 1X PBS.
- ضع 3 ميكرولتر من إطالة الذهب المتوسطة المتزايدة على شريحة (إينفيتروجن P36934). تفعل هذا واحد في وقت واحد إذا كان لديك عدة زلات غطاء لتجنب تجفيف تصاعد المتوسطة.
- إضافة ~ 0.5 مل ايثانول إلى ساترة في صفيحة ال 12 جيدا، وإزالة الغطاء زلة والهواء الجاف في حين عقد مع ملاقط.
- ضع تغطية زلة الجانب الخلية أسفل على تصاعد المتوسطة والسماح تتصلب عدة ساعات أو O / N في الظلام.
- ختم حواف مع طلاء الأظافر، والشروع في التصوير.
6. التصوير من الخلايا مع أوليمبوس IX-81 مقلوب نظرة عامة مجهر
- لاقتناء صورة نستخدم Slidebook (ذكي imaging.com) البرامج و100X، 1.45 NA، الهدف النفط TIRFM. لGFP المسلسل، ودابي، CY3، Cy3.5 وCy5 التصوير: مجموعات فلتر كروما (انظر الكواشف).
- استخدام مرشح دابيلإيجاد وتركيز الخلايا.
- تعيين هذا كنقطة مرجعية.
- اتخاذ Z-كومة من الصور حول نقطة مرجعية حيث المسافة إجمالية تبلغ 5 ميكرومتر مع 0.2 ميكرومتر حجم (25 طائرات). كرر لكل قناة صبغ (أي مجموعة كل التحقيق).
- تصدير باعتبارها TIFF 16 بت لتحليل الصور.
7. تحليل الصور نظرة عامة (المسابر المغني)
سوف نقدم فيما يلي الخطوط العريضة للطرق الحسابية التي نستخدمها لتحليل الصور FISH في MATLAB. وبين قوسين وظائف MATLAB ذات الصلة المستخدمة على اليمين. يتم ضبطها الخوارزميات وعتبات حاليا للبيانات من تحقيقات نمط المغني. وسوف تستخدم أسلوب تحقيقات ستيلاريس تتطلب بعض التعديل، لا سيما إلى الخطوة تصفية النهائية (7.8).
تحديد الخلية 15
- خلايا منفصلة عن الخلفية باستخدام عتبة العالمية على دابي الصور 16 [graythresh].
- تحديد نوى باستخدام وظيفة ممتدة ماكسيما [IMextendedmax].
- الخلايا باستخدام قطعة نوى كما البذور لخوارزمية مستجمعات المياه [مستجمعات المياه].
العثور على بقع في كل قناة مضان
- أداء التحول tophat لتطبيع الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء [bwmorph].
- البحث ماكسيما لتحديد طبقة في التركيز (في Z-طائرة) لكل بقعة [imregionalmax].
- تحديد اماكن المحتملة باستخدام هذا النموذج مناسبا خطية إلى التدرج شعاعي.
كثافة بقعة قياس وإشارات واحد مقابل متعددة مرشح التحقيق
- تناسب التمويه الشخصي 2D الى مكان الحادث في طبقة التي سبق تحديدها في التركيز وتقدير كثافة 17.
- تصفية نقاط الضعف باستخدام عتبة (استنادا إلى الرسم البياني). لنوع سنجر تحقيقات هذا هو المهم، ولكن هو أقل من ذلك للتحقيقات ستيلاريس.
- عد اماكن في كل خلية.
Representative Results
ويبين الشكل 3 رسوم بيانية نموذجي حسابها من الصور FISH وتستخدم لتحديد عدد mRNAs وموجودة في الخلايا واحد. ومن المزايا المهمة لالمجهري القائم على القياس الكمي RNA هو أن واحدة يمكن الحصول على معلومات عن توطين النصوص. على سبيل المثال، استخدمنا FISH لتحديد mRNAs وفي الخلايا واحد مع محرض CBF1 أليل (الشكل 4). لأن العديد من الجزيئات مرنا موجودة في موقع النسخ، ونحن قادرون على تحديد وجود وموقع من مواقع النسخ داخل النواة.
من خلال الاستفادة من الأصباغ المختلفة لmRNAs والتسمية من جينات مختلفة، يمكن للمرء تحديد الأنواع مرنا متعددة في نفس الخلايا. لإثبات هذا، وحضنت خلايا الخميرة في وجود α عامل والسوربيتول. هو فعل FUS1 النسخ (Quasar670 صبغ والأحمر) بواسطة α عامل. هو فعل النسخ STL1 (النجم الفلكي البعيد 570 صبغ والأخضر) من خلال الزيادات في الأسمولية خارج الخلية (
الشكل 1. التخطيطي من الأسماك الإجراء التجريبي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. التخطيطي من خط أنابيب تحليل الصور. يتم تحديد اماكن النهائي في الشكل الموجود في أقصى اليمين.
الشكل (3). الرسم البياني من شدة بقعة لجين معين باستخدام مجسات سنجر
الشكل 4. ممثل النتائج الداخلي FISH مغنية. في هذه التجربة، يتم تنشيط CBF1 النسخ مع المروج محرض 18. هي ملطخة النوى مع دابي الأزرق. والموسومة mRNAs وCBF1 مع تحقيقات CY3 المسمى. السهام البيضاء تسليط الضوء على وجود CBF1 مواقع النسخ في النواة. النصوص مرنا واحدة واضحة في السيتوبلازم.
الشكل 5. ممثل النتائج الداخلي FISH ستيلاريس. تعرضت خلايا الخميرة ماتا في وقت واحد إلى 30 نانوغرام / مل α عامل و 0.75 M السوربيتول لمدة 10 دقيقة وجرى التحقيق في وقت واحد لFUS1 (النجم الفلكي البعيد 670، أحمر) وSTL1 (النجم الفلكي البعيد 570 والأخضر) النصوص. في مربع الضوء، يمكننا أن نرى خلية واحدة فقط الاستجابة لفرمون (FUS1 موقع البداية، أحمر) وآخر في الغالب الاستجابة لالسوربيتول (موقع بداية STL1 والأخضر).
Discussion
حتى الآن، وقد تم FISH في المقام الأول وسيلة الإنتاجية المنخفضة. استخدام CY3، Cy3.5، والأصباغ Cy5 يحد من عدد من الجينات يمكن لأحد أن التحقيق في الخلايا واحد إلى ثلاثة في وقت واحد. وقد وضعت بعض تحقيقات إضافية (ستيلاريس) ولكن عدد من تحقيقات تمييزها لا يزال سبعة كحد أقصى. للتحايل على هذا القيد، وقد استخدمت استراتيجيات التوسيم اندماجي باستخدام fluorophores متعددة لخلق الباركود لأنواع مختلفة مرنا 19،20. وفي الآونة الأخيرة، وتستخدم لوبيك وتساى المتوازية الضوئية والطيفية لتحديد 32 نوعا مختلفة في وقت واحد مع السمك في خلايا الخميرة واحد 19. واحد الحد من هذا النهج اندماجي الأخيرة هو أنه يتطلب استخدام فائقة قرار المجهري. التحليل اللازمة لتمييز تحقيقات barcoded هو أيضا معقدة جدا.
لقد وجدنا أن CY3 وCy3.5 هي الأفضل لCy5 للتجارب FISH. واحدة من القيود المفروضة على صبغ Cy5 هو حساسيتهالphotobleaching. ومع ذلك، وضعت مؤخرا ستيلاريس Cy5 المتغيرات التي يتم الإعلان عنها على أنها أكثر مقاومة للphotobleaching، وربما تخفيف من حدة هذه مسألة تقنية. ومن الجدير بالذكر أيضا أن الأسماك هي طريقة مكلفة لتنفيذ وأن كلا من المغنية وستيلاريس تحقيقات تكلف عادة 700 $ - 1،000 $ لكل مجموعة التحقيق، رغم أن الأسعار لتحقيقات المتاحة تجاريا يجب أن تنخفض في المستقبل. تجنيب من الكواشف ووضع العلامات كفاءة يجلب تحقيقات المغني وصولا الى أقل تتراوح في السعر.
واحدة من التحديات التقنية الكبرى هو فصل اماكن مسبار واحد مقابل متعددة، الأمر الذي يتطلب تنفيذ خوارزميات بقعة تحديد متطورة. هذا يمكن أن يستغرق المراجعة اليدوية واسعة لضبط المعلمات تحليل الصور عن الاجهزة التجريبية المحددة. وتقدم الخطوط العريضة من خط أنابيب الحسابية لدينا مع وظائف MATLAB ذات الصلة في المادة 7 من البروتوكول. يتم إنزال بعض الشيء هذه المشكلة عن طريق تحقيقات ستيلاريس التي لديها فقط تسمية واحدة في التحقيق. وبالتالي فإنه يتطلب colocalization من تحقيقات متعددة في رؤية إشارة.
لأن FISH يتطلب تحديد الخلايا، فإنه لا يسهل تتبع الخلايا الفردية مع مرور الوقت. سابقا، كنا البيانات لقطة FISH لإعادة بناء ديناميات التعبير الجيني في عملية الأيض الفردية السكان الخميرة الدراجات 6. ويلاحظ الدراجات التمثيل الغذائي في مرحلة ما قبل المتعطشة، الثقافات المستمر، ويتميز التذبذبات الجماعية على نطاق السكان في استهلاك الأكسجين. وترتبط هذه التذبذبات مع التذبذبات على نطاق الجينوم من النصوص التي تحدث عن نصف جميع جينات الخميرة في مراحل مختلفة من استهلاك الأوكسجين. سعينا لتحديد ما إذا كان ركوب الدراجات الأيض موجودة في الثقافات غير المتزامنة الخميرة المستمر. إذا كان موجودا، وينبغي أن النصوص التي هي المضادة للارتباط في السكان متزامن أيضا أن تكون مضادة للالمترابطة في الخلايا واحد متزامن، والعكس بالعكس من النصوص المترابطة.
الأنف والحنجرة "> لإعادة بناء ديناميات الإنتاج مرنا في الوقت المناسب، ويجب مقارنة البيانات المرصودة لقطة ما هو متوقع من نموذج للسلوك الكامنة. هناك قيود النظرية إلى حين مثل" لقطات "من بيانات التعبير الجيني يمكن أن تستخدم لتحديد الكامنة وراء ديناميات التعبير الجيني والذي أنواع النماذج ويمكن تمييز 21. للبيانات دورة الأيض، بدلا من أن تظهر مباشرة وجود التذبذبات الزمانية، تم تنفيذ القياسات الإحصائية لإثبات أن هناك فعلا خلية برنامج متذبذبة مستقلة بما يتفق مع ميكروأري السائبة القياسات.Disclosures
يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة GM046406 (لDB) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة مركز لعلم الأحياء الكمي (GM071508). RSM يقر تمويل من جبهة الخلاص الوطني عليا بحوث زمالة. معتمد من قبل MNM زمالة لويس سيغلر. ونود أن نعترف أعضاء المختبر لإجراء مناقشات مفيدة كبير قادتها وأعضاء سابقين أليجرا بيتي ونيكولاي Slavov لمساهماتها في المشروع دورة التمثيل الغذائي. نشكر دانيال Zenklusen وروبرت سينجر عن الوصول بنا بدأت مع طريقة FISH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
| Lyticase | Sigma | L5263 | |
| E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
| BSA (RNase free) | Ambion | ||
| Beta-mercapt–thanol | Fisher | 03446l | |
| DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
| PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
| Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
| Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
| Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
| Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
| 1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
| 100% Ethanol | |||
| Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
| Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
| Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
| Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
| Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
| FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
| Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
| 12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
| Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
| EQUIPMENT | |||
| Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
| Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
| Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
| 100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
| Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
| Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
| Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER | |
References
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).
- Jones, K. W. Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells. Nature. 225, 912 (1970).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).
- Silverman, S. J., et al. Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).
- Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast. Cell. 147, 1484-1497 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).
- Itzkovitz, S., et al. Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine. Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).
- Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463, 913-U984 (2010).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Cell segmentation | Steve on Image Processing [Internet]. , The MathWorks, Inc.. Available from: http://blogs.mathworks.com/steve/2006/06/02/cell-segmentation/ (2006).
- Otsu, N. A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).
- Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. Single-cell gene expression profiling. Science. 297, 836-840 (2002).
- Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data. Plos Computational Biology. 6, (2010).
