Summary
हम एक जोड़ कार्टिलेज दोष में पहले प्रत्यारोपण के लिए एक उपास्थि biocomposite को अक्षीय या द्विअक्षीय यांत्रिक तनाव लागू कर सकते हैं कि एक उपन्यास यांत्रिक लोड हो रहा बायोरिएक्टर बनाया गया.
Abstract
हम प्रत्यारोपण के लिए गढ़े एक ऊतक इंजीनियर Biocomposites को अक्षीय या द्विअक्षीय यांत्रिक तनाव को लागू करने में सक्षम है कि एक लोडिंग उपकरण बनाया है. डिवाइस में मुख्य रूप से देशी यांत्रिक उपभेदों mimics कि एक बायोरिएक्टर के रूप में कार्य करता है, यह भी बल प्रतिक्रिया या निर्माणों की यांत्रिक परीक्षण उपलब्ध कराने के लिए एक लोड सेल के साथ outfitted है. डिवाइस विषयों लोडिंग खुराक की बड़ी सफाई (आयाम और आवृत्ति) के साथ द्विअक्षीय यांत्रिक लोड करने के लिए उपास्थि निर्माणों इंजीनियर और एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर फिट करने के लिए काफी कॉम्पैक्ट है. यह सीधे एक टिशू कल्चर प्लेट में नमूने लोड करता है, और कई थाली आकार सिस्टम के साथ संगत कर रहे हैं. डिवाइस परिशुद्धता निर्देशित लेजर अनुप्रयोगों के लिए निर्मित घटकों का उपयोग कर बनाया गया है. द्विपक्षीय अक्षीय लोडिंग दो orthogonal चरणों के द्वारा पूरा किया है. चरणों में एक 50 मिमी यात्रा सीमा है और stepper मोटर actuators द्वारा स्वतंत्र रूप से संचालित कर रहे हैं, के द्वारा नियंत्रितकम से कम 50 एनएम के कदम आकार को सक्षम करने, सूक्ष्म कदम क्षमताओं सुविधाएँ है कि एक बंद लूप stepper मोटर चालक. एक polysulfone लोड पट्ट द्वि अक्षीय चलती मंच के लिए युग्मित है. चरणों के आंदोलनों थोर प्रयोगशालाओं उन्नत पोजिशनिंग टेक्नोलॉजी (एपीटी) सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. stepper मोटर चालक आवृत्ति और कतरनी और स्वतंत्र रूप से और साथ ही संपीड़न दोनों के आयाम का भार मापदंडों को समायोजित करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ प्रयोग किया जाता है. स्थितीय प्रतिक्रिया यात्रा के पूरे 50 मिमी से अधिक कम से कम 3 मीटर का एक स्थितीय सटीकता के लिए अनुवाद, 0.1 माइक्रोन का एक द्विदिश repeatability और 20 एनएम के एक संकल्प है कि रैखिक ऑप्टिकल encoders द्वारा प्रदान की जाती है. इन encoders सच nanopositioning क्षमताओं को सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक्स ड्राइव करने के लिए आवश्यक स्थिति प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं. पता लगाने के लिए बल प्रतिक्रिया लदान प्रतिक्रियाओं से संपर्क करें और मूल्यांकन प्रदान करने के लिए, एक सटीक लघु लोड सेल लोड पट्ट और movin के बीच तैनात हैजी मंच. लोड सेल 0.15% से 0.25% पूर्ण पैमाने के उच्च accuracies है.
Introduction
हम प्रत्यारोपण के लिए गढ़े एक ऊतक इंजीनियर Biocomposites को अक्षीय या द्विअक्षीय यांत्रिक तनाव को लागू करने में सक्षम है कि एक लोडिंग बायोरिएक्टर तैयार की है. इस उपकरण में मुख्य रूप से जोड़ कार्टिलेज के लिए इंजीनियर प्रतिस्थापन के लिए एक बायोरिएक्टर के रूप में बनाया गया है, यह भी मानव शरीर में अन्य लोड असर ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस बायोरिएक्टर डिजाइन में हमारी प्रेरणा के प्रस्ताव के अभाव के कारण रुक लड़की भ्रूण में जोड़ कार्टिलेज के असामान्य गठन के मौलिक अवलोकन किया जो Drachman और Sokoloff 1 से उपजा है. इसी तरह, शारीरिक व्यायाम सामान्य मांसपेशियों और हड्डियों के विकास के लिए आवश्यक है. इस अवधारणा को ध्यान में रखते हुए, कई अनुसंधान समूहों विट्रो खेती में दौरान शारीरिक उत्तेजनाओं से कैसे अलग प्रकार की जांच की है सेल biomaterial Biocomposites और ऊतक explants 2-7 की जैव रासायनिक और यांत्रिक गुणों modulates. कार्यात्मक ऊतक इंजीनियरिंग की अवधारणाऊतकों के कार्यात्मक गुणों को बढ़ाने के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं की इन विट्रो प्रयोग में शामिल है, ऊतक विवो तनाव में होने की संभावना को झेलने और 8,9 तनाव करने के लिए सक्षम है कि यांत्रिक गुणों अर्थात्. कई अध्ययनों से जोड़ जोड़ों के लिए इंजीनियर उपास्थि निर्माणों को प्रोत्साहित करने के लिए कतरनी और संपीड़न के संदर्भ में इस्तेमाल यांत्रिक लोडिंग की रिपोर्ट. Mauck एट अल. 10 अकेले यांत्रिक लोडिंग भी महत्वपूर्ण माना जाता है कि वृद्धि कारकों के अभाव में mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की उपास्थिजनन पैदा कर सकते हैं सुझाव है. ऐसे ऊतक खेती के दौरान संपीड़न या कतरनी के रूप में रुक - रुक कर यांत्रिक लोडिंग के आवेदन उपास्थि और हड्डी गठन व्यवस्थित करना दिखाया गया है, लेकिन लोडिंग के इष्टतम मात्रामापी सेल और ऊतक गुण 11 के साथ अलग है.
जोड़ कार्टिलेज का सबसे महत्वपूर्ण कार्य के भीतर दबाने और कतरनी बलों का सामना करने की क्षमता हैसंयुक्त, इसलिए यह उच्च compressive और कतरनी moduli किया गया है. इंजीनियर उपास्थि में कार्यात्मक यांत्रिक शक्ति और शारीरिक फैटी की कमी विवो में नव उपास्थि पर टूटने और जोड़ों में उपास्थि प्रतिस्थापन रणनीतियों की विफलता में हुई है. संपीड़न और कतरनी सामान्यतः मिलाना और जोड़ कार्टिलेज Biocomposites के यांत्रिक शक्ति में सुधार करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, एक संयोजन दृष्टिकोण दुर्लभ 6,12-15 है. Wartella और वेन 16 meniscal उपास्थि प्रतिस्थापन निर्माण करने के लिए तनाव और संपीड़न लागू कि एक बायोरिएक्टर बनाया गया. वॉल्डमेन एट अल. 15 एक झरझरा कैल्शियम polyphosphate सब्सट्रेट में संवर्धित chondrocytes को संपीड़न और कतरनी लागू करने के लिए एक उपकरण बनाया है. बियान एट अल. 17 में इन विट्रो जैल में वयस्क कुत्ते chondrocytes की खेती और द्विअक्षीय यांत्रिक के आवेदन के साथ मूल उपास्थि मिलान यांत्रिक गुणों का प्रदर्शनanical लोड (दबाने deformational लोड हो रहा है और फिसलने संपर्क लोड हो रहा है).
द्विअक्षीय यांत्रिक लोड हो रहा बायोरिएक्टर मूल ऊतक इंजीनियर उपास्थि में रूपात्मक रूपांतरों को उत्पन्न करने के लिए समग्र लक्ष्य के साथ अपनी प्रयोगशाला में डेनिएल चू द्वारा डिजाइन किया गया था वर्तमान में उपलब्ध 18 से अधिक दबाने और कतरनी moduli में जिसके परिणामस्वरूप निर्माण करती है. हम इस अनुसंधान में काफी mechanotransduction नैदानिक प्रासंगिक ऊतकों इंजीनियर को संग्राहक जा सकता है की हमारी व्यापक समझ बढ़ाने के लिए होगा.
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Protocol
1. Biaxial लोड हो रहा है बायोरिएक्टर डिजाइन
- बायोरिएक्टर महान लोडिंग खुराक की परिशुद्धता (आयाम और आवृत्ति) और एक विस्तृत विविधता के लिए आवेदन के साथ, इंजीनियर के ऊतकों को अक्षीय या द्विअक्षीय यांत्रिक तनाव को लागू करने के लिए परिशुद्धता निर्देशित लेजर अनुप्रयोगों के लिए थोर प्रयोगशालाओं (न्यूटन, एमए) द्वारा निर्मित दो चरणों को रोजगार एक से 24 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा 1) के लिए टिशू कल्चर की स्थिति.
- द्विपक्षीय अक्षीय लोडिंग दो TravelMax चरणों (LNR50SE) द्वारा पूरा किया है. इन सभी चरणों में एक XZ विन्यास में orthogonally बढ़ रहे हैं. क्षैतिज चरण एक्स अक्ष के साथ झूलते द्वारा गतिशील बाल काटना गतियों प्रदान करता है. ऊर्ध्वाधर मंच z-अक्ष के साथ झूलते द्वारा गतिशील दबाने लोड हो रहा है प्रदान करता है. इन सभी चरणों से भी कम समय के कदम आकार, सक्रिय करने के लिए एक 50 मिमी यात्रा सीमा है और सूक्ष्म कदम क्षमताओं है कि सुविधाओं के एक बंद लूप stepper मोटर ड्राइवर (BSC102) द्वारा नियंत्रित actuators मोटर stepper (DRV014), द्वारा स्वतंत्र रूप से संचालित कर रहे हैं50 एनएम.
- इस उपकरण में एक कठोर 25 सेमी पर मुहिम शुरू की है एक्स 30 सेमी x 12.5 मशीन घटकों की विधानसभा के लिए एक मंच के रूप में और टिशू कल्चर प्लेटों के बढ़ते के लिए प्रयोग किया जाता है कि मिमी एल्यूमीनियम बेस प्लेट. समायोज्य विज्ञान सम्बन्धी बंद हो जाता है एल्यूमीनियम बेस प्लेट पर जगह में टिशू कल्चर प्लेटें बंद करने के लिए उपयोग किया जाता है. ये विज्ञान सम्बन्धी बंद हो जाता है नहीं तो हाथ से प्राप्त नहीं है कि सटीक संरेखण के लिए अनुमति देने के लिए ठीक समायोजन शिकंजा है. बेस प्लेट की मॉड्यूलर डिजाइन विभिन्न आकारों और आकार (पेट्री डिश बनाम बहु अच्छी तरह प्लेटें) की प्लेटों को समायोजित करने के लिए इन कीनेमेटीक्स बंद हो जाता है लचीला प्लेसमेंट के लिए अनुमति देता है.
- एक कस्टम machined polysulfone लोड पट्ट एक परिशुद्धता machined सही कोण कोष्ठक के माध्यम से द्वि अक्षीय चलती मंच के लिए युग्मित है. Polysulfone सामग्री मशीनिंग में आसानी, और नसबंदी में आसानी, इसकी वजह से biocompatibility के लिए चुना गया था.
- चरणों के आंदोलनों थोर प्रयोगशालाओं 'उन्नत पोजिशनिंग टेक्नोलॉजी (एपीटी) सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. stepper मोटर ड्राइवर हमें हैआवृत्ति और कतरनी और स्वतंत्र रूप से और साथ ही संपीड़न दोनों के आयाम का भार मापदंडों का समायोजन परमिट है कि सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में एड.
- स्थितीय प्रतिक्रिया प्रत्येक चलती मंच से जुड़े होते हैं और सॉफ्टवेयर के साथ एकीकृत कर रहे हैं कि रैखिक ऑप्टिकल encoders द्वारा प्रदान की जाती है. एनकोडर प्रणाली यात्रा के पूरे 50 मिमी से अधिक कम से कम 3 मीटर का एक स्थितीय सटीकता के लिए अनुवाद, 0.1 माइक्रोन का एक द्विदिश repeatability और 20 एनएम के एक संकल्प किया है. इन encoders सच nanopositioning क्षमताओं को सुनिश्चित करने के लिए ड्राइव इलेक्ट्रॉनिक्स और पूर्ण स्थिति का प्रत्यक्ष readout के लिए आवश्यक स्थिति प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं.
- पट्ट और नमूने के बीच संपर्क का पता लगाने के लिए आवश्यक बल प्रतिक्रिया उपलब्ध कराने और लदान प्रतिक्रियाओं, लोडिंग पट्ट और बढ़ मंच (चित्रा 2) के बीच तैनात है एक सटीक लघु लोड सेल (हनीवेल मॉडल 31) का मूल्यांकन करने के लिए. लोड सेल उच्च accuracies की है0.15% से 0.25% पूर्ण पैमाने. लोड सेल के लिए प्रदर्शन इकाई (SC500) भी 5 दशमलव स्थानों तक का भार मापन प्रदान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, यह एक कंप्यूटर पर डेटा संग्रह के लिए अनुमति देने के लिए एक रुपये -232 बंदरगाह है.
2. सेल वरीयता प्राप्त Agarose Constructs
- 4% agarose तैयार: 20 मिलीलीटर एक 50 मिलीलीटर कुप्पी में DMEM (कोई additives), फोड़ा, और फिर 70 में रखने के लिए उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस ओवन के लिए 0.8 ग्राम agarose जोड़ें.
- वांछित सेल बोने घनत्व की डबल राशि के लिए सेल निलंबन की मात्रा समायोजित करें. इस निलंबन वांछित बोने घनत्व में एक 2% agarose जेल बनाने के लिए 4% w / ध् agarose के बराबर मात्रा के साथ मिलाया जाता है.
- इनक्यूबेटर में सेल निलंबन और एक 10 मिलीलीटर विंदुक दोनों जगह.
- जेल कास्टिंग प्रणाली की स्थापना की. एक 1.5 मिमी और एक 0.75 एमएम स्पेसर प्लेट एक 2.25 एमएम मोटी जेल बनाने के लिए एक साथ रखा जाना चाहिए. अन्य आकार स्पेसर प्लेटें अलग जेल मोटाई बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जेल कास्टिंग प्रणाली इन प्लेटों toget के धारण करने के लिए पर्याप्त नहीं हैउसे, ताकि वे सुरक्षित रूप से लीक को रोकने के लिए टेप किया जाना चाहिए.
- अगले कदम agarose solidifies से पहले जल्दी से जेल मोल्ड में पहले से तैयार agarose और विंदुक के साथ सेल निलंबन मिश्रण करने के लिए है. ओवन से तरल agarose निकालें और उस में एक बाँझ थर्मामीटर जगह. agarose डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं के साथ मिश्रण से पहले 42-43 को शांत करना होगा. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल निलंबन को गर्म Agarose 43 हिट एक बार डिग्री सेल्सियस, जल्दी से वांछित राशि विंदुक ऊपर और फिर तुरंत मिश्रण करने के लिए एक बार कुछ नीचे सेल निलंबन विंदुक ऊपर और. फिर तुरंत जेल मोल्ड में पूरे मिश्रण विंदुक.
- जेल 10-15 मिनट के लिए जमना और फिर ध्यान से एक क्षैतिज स्थिति में झुकाव की अनुमति दें.
- शीर्ष गिलास प्लेट और बायोप्सी पंच के साथ पंच डिस्क निकालें. डिस्क एक छोटे बाँझ रंग के साथ उठाया जा सकता है. हमारे अनुभव में, एक 9 मिलीलीटर जेल एक सौ से अधिक 5 मिमी व्यास डिस्क बनाने के लिए काफी बड़ी थी.
3. संस्कृति डिस्क
4. यांत्रिक लोड के लिए नमूने का स्थिरीकरण
- 4% agarose (कोई सेल निलंबन जोड़ा) और जेल के नमूने लिए खुद को (लोडिंग के दौरान हस्तक्षेप को रोकने के लिए) की तुलना में पतली होना चाहिए तैयारी. सिफारिश की मोटाई 1.5-1.9 मिमी (2.25 मिमी मोटी नमूने के लिए) है.
- एक बार 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए पंच 16 मिमी व्यास डिस्क, gelled. अगर वांछित प्रत्येक डिस्क में, नमूना के लिए पंच एक 5 मिमी छेद पंच, मीडिया परिवर्तन के दौरान रखा जाना पिपेट के लिए डिस्क के किनारे पर एक और 5 मिमी छेद के अंदर रख दिया गया हो.
- एक बार agarose कुओं 24 अच्छी तरह से थाली में जगह के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, किया गया है.
- Agarose डब्ल्यू एक बारElls 24 अच्छी तरह से थाली में हैं, प्रत्येक कुएं में नमूने फिट दबाएँ. नमूना agarose अच्छी तरह से ऊपर से बढ़ाना चाहिए.
5. यांत्रिक लोड हो रहा है
- पट्ट (चित्रा 2) जीवाणुरहित.
- सेल लोड करने के लिए एल्यूमिनियम प्लेट सुरक्षित. सुरक्षित पट्ट / चरण के लिए लोड सेल / एल्यूमिनियम प्लेट विधानसभा लोड हो रहा है.
- Stepper मोटर नियंत्रक (पीठ में स्विच) पर मुड़ें.
- पीसी और खुले "एपीटी उपयोगकर्ता" कार्यक्रम (चित्रा 4) पर मुड़ें.
- वाम स्क्रीन क्षैतिज stepper मोटर नियंत्रित करता है. सही स्क्रीन खड़ी stepper मोटर नियंत्रित करता है. प्रत्येक स्क्रीन में, "ग्राफिकल नियंत्रण" टैब का मार्गदर्शन स्थिति के लिए अनुमति देता है और "हटो Sequencer" टैब स्वचालन के लिए अनुमति देता है. सभी इकाइयों मिमी हैं.
- दोनों स्क्रीन पर "ग्राफिकल नियंत्रण" टैब पर जाएं और "घर / शून्य" बटन दबाएँ. दोनों stepper मोटर्स 50 मिमी की एक श्रृंखला है. "घर / शून्य" दबाने शून्य की स्थिति (ऊपर और दाएँ अधिकांश पदों) के दोनों stepper मोटर्स भेज देंगे.
- Preparई हर अच्छी तरह से कुछ मीडिया को हटाने से लोड करने के लिए 24 अच्छी तरह से थाली में नमूने. मीडिया का कोई अधिक से अधिक 1 मिलीलीटर लोड करने के दौरान सैलाब को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में छोड़ दिया जाना चाहिए. पर्याप्त मीडिया नमूना कवर रखने के लिए अच्छी तरह से छोड़ दिया है कि सुनिश्चित करें.
- इनक्यूबेटर साधन विफलता को रोकने के लिए कम नमी की स्थिति में रखा जाता है कि ध्यान दें.
- जगह 24 अच्छी तरह बायोरिएक्टर में थाली और पट्ट के साथ सावधानी से अप लाइन.
- थाली चार समायोज्य विज्ञान सम्बन्धी लोकेटर उपयोग कर बायोरिएक्टर के लिए सुरक्षित है. यह आसान पट्ट अप लाइन को बनाने के लिए, दो बाएं लोकेटर पूर्व में तैनात किया गया है. थाली सुरक्षित है इतना है कि दो सही लोकेटर कसो. बायोरिएक्टर आधार के सामने के साथ फ्लश प्लेट लाइन करने के लिए सुनिश्चित करें.
- "ग्राफिकल नियंत्रण" टैब में, एक विशिष्ट stepper मोटर स्थिति मैन्युअल स्थिति बॉक्स पर क्लिक करके दर्ज किया जा सकता है. धीरे पट्ट कम और थाली के साथ अप लाइन के लिए क्षैतिज रूप से इसे स्थानांतरित करने के लिए इस क्षमता का उपयोग करें. </ राजभाषा>
- पट्ट नमूनों के साथ संपर्क में आने के करीब है एक बार, बहुत धीमी गति से वेतन वृद्धि में पट्ट नीचे लाने के लिए शुरू (0.1 मिमी) आप पूर्व निर्धारित शुरू करने की स्थिति तक पहुँचने तक (भाग 6 देखें).
- शुरू करने की स्थिति तक पहुँच जाता है एक बार, टैब "Sequencer जाएँ" और दबाकर वांछित कदम अनुक्रम लोड करने के लिए जाना "लोड." फिर शुरू करने के लिए "भागो" दबाएँ. (चित्रा 5) भाग 7 देखें. एक Dosing प्रोटोकॉल लेखन.
- लोड हो चुका है, मैन्युअल पट्ट बढ़ा. किसी भी नमूने पट्ट के लिए अटक रहे हैं, तो ध्यान से अच्छी तरह से एक बाँझ रंग का प्रयोग उचित में उन्हें वापस डाल दिया.
- बायोरिएक्टर से 24 अच्छी तरह से थाली निकालें और मीडिया की जगह.
- ध्यान से लोड सेल से पट्ट को हटाने और फिर बजाना बंद कर देते हैं.
6. औजार लोड पट्ट
उचित उपभेदों नमूनों को लागू कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक पट्ट ध्यान से एक प्रयोग शुरू करने से पहले calibrated किया जाना चाहिए.
- मैन्युअल रूप से 25 मिमी स्थिति में क्षैतिज stepper मोटर डाल दिया.
- यह सिर्फ मुश्किल से बायोरिएक्टर के आधार के साथ संपर्क में ध्यान कम पट्ट आता है. लोड सेल इस बिंदु पर बढ़ा भार दिखाएगा. खड़ी stepper मोटर (सभी संपीड़न तनाव माप इस मूल्य से गणना की जाएगी, के रूप में संभव के रूप में सटीक होना) की सही स्थिति का ध्यान रखना.
- स्थिति रिकार्ड. यह मान नमूना आयामों और वांछित उपभेदों के आधार पर एक खुराक प्रोटोकॉल लिखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
7. एक Dosing प्रोटोकॉल लेखन
- बायोरिएक्टर या तो एक साथ या अलग - अलग, दबाने और कतरनी दोनों तनाव को लागू करने में सक्षम है. बारदाना दबाने तनाव, गतिशील तनाव आयाम, और आवृत्ति लोड हो रहा है: तीन मुख्य मापदंडों का फैसला किया जाना चाहिए.
- एक धड़ा तनाव नमूना से पट्ट का liftoff से रोकने के लिए लागू किया जाता है.
- नमूना गतिशील तनाव आयाम और fre के लदानquency चुना जाता है.
इस अध्ययन में हम के रूप में दबाने और कतरनी तनाव को परिभाषित: 
उदाहरण द्विअक्षीय खुराक प्रोटोकॉल
नमूना मोटाई: 2.25 मिमी
बारदाना तनाव (संपीड़न): नमूना मोटाई के 10% (0.225 मिमी)
गतिशील तनाव आयाम (संपीड़न): 10% (/ - नमूना मोटाई के 5%)
फ्रीक्वेंसी (संपीड़न): 1 हर्ट्ज
गतिशील तनाव आयाम (कतरनी): नमूना मोटाई (0.5625 मिमी) का 25%: कतरें तनाव है
क्षैतिज रूप से आगे बढ़ पट्ट द्वारा नमूना के लिए आवेदन किया.
फ्रीक्वेंसी (कतरनी): 0.5 हर्ट्ज
ठेठ खुराक प्रोटोकॉल दिन प्रति लदान के 3 घंटा है.
इस उदाहरण में, गतिशील और कतरनी लोड हो रहा है साथ ही साथ के बजाय क्रमिक रूप से लागू किया जाता है. हम इस पद्धति बेहतर एमआईएम माननामानव घुटने में आईसीएस जटिल लोडिंग वातावरण.
- एक खुराक प्रोटोकॉल चुने जाने के बाद, एक संपीड़न कदम अनुक्रम कार्यक्रम लिखा होना चाहिए.
- इस कदम के अनुक्रम यह stepper मोटर एक निर्दिष्ट त्वरण और अधिकतम गति पर कदम होगा कि पदों की एक सूची है, की तरह लगता है कि वास्तव में क्या है.
- प्रोटोकॉल और पट्ट अंशांकन मूल्य (भाग 6) खुराक के आधार पर वांछित खड़ी पदों की गणना.
- पट्ट 1 के लिए उदाहरण संगणना नीचे दिया गया है:
| अंशांकन मूल्य से फर्क | लंबवत स्थिति | |
| पट्ट अंशांकन मूल्य (बायोरिएक्टर की स्पर्श के नीचे) | 0 मिमी | 29.7700 मिमी |
| पट्ट नमूना के साथ संपर्क (2.25 मिमी नमूना) बनाता है | 4.4140 मिमी | 25.3560 मिमी |
| सेंटवर्षा (5% मोटाई) | 4.3015 मिमी | 25.4705 मिमी |
| तनाव (10% मोटाई) | 4.1890 मिमी | 25.5810 मिमी |
| तनाव (15% मोटाई) | 4.0765 मिमी | 25.6955 मिमी |
- एक बार स्थिति, गति और सही आवृत्ति प्राप्त करने के लिए अधिकतम गति मूल्यों के साथ प्रयोग गणना कर रहे हैं. चक्रों की संख्या (1 हर्ट्ज से कम 3 घंटे के लिए जैसे 10,800 चक्र) के हिसाब से चुना जाना चाहिए.
- उदाहरण गतिशील संपीड़न हटो अनुक्रम कार्यक्रम (10% धड़ा संपीड़न, 10% गतिशील तनाव आयाम, 1 हर्ट्ज) (चित्रा 5)
- गतिशील कतरनी कदम अनुक्रम कार्यक्रम: चक्रों की संख्या वांछित आवृत्ति और अवधि (0.5 हर्ट्ज से कम 3 घंटे के लिए जैसे 5400 चक्र) के अनुसार चुना जाना चाहिए.
- उदाहरण गतिशील कतरें हटो अनुक्रम कार्यक्रम (10% धड़ा संपीड़न, 0.5625 मिमी (मोटाई के 25%) गतिशील कतरनी तनाव आयाम, 0.5हर्ट्ज) (चित्रा 5).
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Representative Results
युक्ति 20 मिलियन कोशिकाओं / एमएल chondrocytes साथ agarose जैल वरीयता प्राप्त का उपयोग करके परीक्षण किया और अक्षीय (संपीड़न) या द्विअक्षीय (संपीड़न और कतरनी) यांत्रिक लोडिंग की उपस्थिति में खेती की जाती थी. प्राथमिक सुअर का chondrocytes 2-4 महीने पुराने सूअरों का जोड़ कार्टिलेज से अलग थे. 5 मिमी व्यास और 1.5 मिमी मोटी नमूने परिभाषित chondrogenic संस्कृति मध्यम (उच्च ग्लूकोज DMEM, 1% इसके + Premix, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, 2.5 ग्राम / एमएल के 2 मिलीलीटर में सुसंस्कृत थे amphotericin बी, 37 में 24 अच्छी तरह प्लेटें में 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड, 0.1 मिमी nonessential अमीनो एसिड (NEAA), प्रोलाइन 0.4 मिमी,) डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2. 10 -7 एम dexamethasone और 10 एनजी / एमएल TGF-β1 संस्कृति के पहले 10 दिनों के लिए आपूर्ति की गई. नमूने दिनों 10-30 के बीच 3 घंटा / दिन के लिए भरी हुई थी. अक्षीय लोड हो रहा है 10% संपीड़न चोटी से शिखर आयाम के शामिल, 1 हर्ट्ज और द्विअक्षीय लोडिंग 0.15 मिमी (10% मोटाई) संपीड़न और 0.075 के शामिलमिमी कतरनी चोटी से शिखर आयाम, 1 हर्ट्ज. गतिशील तनाव आयाम और लदान आवृत्ति प्रकाशित अध्ययन 17,19 के आधार पर चुना जाता है. 30 दिन के अंत में इंजीनियर उपास्थि के जैव रासायनिक और यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन किया गया.
- कोई लोडिंग नियंत्रण, 2 - Uniaxial (दबाने) लोड हो रहा है, 3 - द्विअक्षीय (दबाने और कतरनी) लोड हो रहा है 1: यह अध्ययन तीन समूहों में कार्यरत हैं. डीएनए सामग्री और संरचनाओं के गीला वजन खेती के 30 दिनों (पी> 0.05) के बाद तीन समूहों में इसी तरह बने रहे. भूमिकाः सामग्री अक्षीय लोड समूह (समूह 2, पी <0.05) (चित्रा 6) के बाद (समूह -3, पी नियंत्रण समूह की तुलना में 0.001 <) द्विअक्षीय लोडिंग के अधीन था कि समूह में सबसे ज्यादा था. समूहों के 2 और 3 की भूमिकाः सामग्री को क्रमश: 48% और देशी उपास्थि के 50% के अनुरूप हैं. समूह 3 समूहों 1 और 2 (पी <0.01) की तुलना में कोलेजन की काफी अधिक राशि में हुई. समूह 2 भी मोटा निर्माणों था थाएन 1 समूह (पी <0.01). हैरानी की बात है, संतुलन दबाने यंग मापांक 2 समूह में सबसे ज्यादा था (अक्षीय लोड हो रहा है, पी <0.01) और समूह 3 और 1 के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे. समूह 2 की यंग मापांक देशी सुअर उपास्थि के 60.1% के लिए corresponded.
ऊतकीय विश्लेषण glycosaminoglycans (Alcian नीले, सैफरैनीन ओ) और प्रकार द्वितीय कोलेजन (चित्रा 7) के लिए सकारात्मक और सजातीय धुंधला संकेत दिया. सभी समूहों प्रकार मैं कोलेजन (नहीं दिखाया गया है) के लिए नकारात्मक दाग.
संक्षेप में, इन प्रारंभिक परिणाम इस बायोरिएक्टर सफलतापूर्वक संपीड़न और द्विअक्षीय (संपीड़न और कतरनी) इंजीनियर के ऊतकों की लंबी अवधि की खेती के दौरान यांत्रिक लोड लागू करता है. इस अध्ययन में द्विअक्षीय लोड proteoglycan और कोलेजन बयान और ऊतक इंजीनियर उपास्थि नमूनों की मोटाई को दिखाया गया था. अक्षीय संपीड़न proteoglycan बयान और दोनों में वृद्धि हुई यंग मापांक.
चित्रा 1. Biaxial लोड एक्स मंच (बाल काटना) और जेड मंच (संपीड़न) द्वारा पूरा किया है. आंकड़ा 24 अच्छी तरह से थाली में नमूने लोड करने के चरणों से जुड़ी एक कस्टम लोड पट्ट से पता चलता है. लोड हो रहा मापदंडों stepper मोटर्स 18 से जुड़ा कंप्यूटर से नियंत्रित कर रहे हैं.
चित्रा 2. वाम: 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए बनाया गया polysulfone लोड पट्ट. अधिकार: द्विअक्षीय लोड बायोरिएक्टर को लोडिंग पट्ट लगाव.
चित्रा 3. कतरनी लोडिंग के दौरान नमूने immobilizing के लिए agarose कुओं की तैयारी. यांत्रिक लोड करने के लिए अच्छी तरह से agarose में रखा स्थिर निर्माण. यह आंकड़ा अच्छी तरह से और एक 2.25 एमएम मोटी नमूना एक 1.5 मिमी मोटी agarose से पता चलता है.
4 चित्रा. द्विअक्षीय लोड डिवाइस को नियंत्रित करने के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 5. उदाहरण द्विअक्षीय लोड ले जाएँ अनुक्रम कार्यक्रम ग्राफिकल यूजर इंटरफेस: गतिशील संपीड़न हटो अनुक्रम कार्यक्रम (10% धड़ा संपीड़न, 10% गतिशील तनाव आयाम, 1 हर्ट्ज) और गतिशील कतरें हटो अनुक्रम कार्यक्रम (10% धड़ा संपीड़न, 25% गतिशील कतरनी तनाव आयाम, 0.5 हर्ट्ज). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
6 चित्रा. बायोकेमिकल और यांत्रिक परीक्षण के परिणाम (एन = 6) *** पी <0.001, ** पी <0.01, * पी समूह 1 (उतार नियंत्रण समूह 2 के साथ तुलना में 0.05 <:.. Uniaxial दबाने लोड हो रहा है, समूह 3: द्विअक्षीय दबाने और कतरनी लोड हो रहा है.
चित्रा 7. प्रोटोकॉल: Alcian नीला / परमाणु तेज लाल धुंधला, सैफरैनीन हे / तेजी से हरे रंग, प्रकार द्वितीय कोलेजन के लिए immunochemistry.
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Discussion
हम प्रत्यारोपण के लिए गढ़े ऊतक इंजीनियर निर्माणों को अक्षीय या द्विअक्षीय यांत्रिक तनाव को लागू करने में सक्षम है कि एक लोडिंग डिवाइस तैयार की है. डिवाइस देशी ऊतक के या करने से पहले अन्य उपचार के बाद यांत्रिक विशेषताओं का वर्णन करने के लिए इंजीनियर Biocomposites की इन विट्रो खेती के लिए एक बायोरिएक्टर के रूप में या एक परीक्षण उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. डिवाइस विषयों के 24 अच्छी तरह प्लेटें एक से महान लोडिंग खुराक की परिशुद्धता (आयाम और आवृत्ति) और टिशू कल्चर स्थितियों की एक विस्तृत विविधता के लिए आवेदन के साथ द्विअक्षीय यांत्रिक लोड करने के लिए ऊतक निर्माणों इंजीनियर.
कतरनी लोडिंग के आवेदन इस प्रणाली के डिजाइन के लिए अद्वितीय चुनौतियों का एक सेट भेंट किया. पोषक हस्तांतरण को अधिकतम करने के लिए, निर्माणों मूल रूप से एक 24 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में असमीमित गया. बारदाना दबाने तनाव बीमा, क्योंकि यह गतिशील संपीड़न के लिए एक समस्या पेश नहीं किया हैनमूना पट्ट संपर्क खो नहीं था. कतरनी तनाव प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा गया है, तथापि, unconfined नमूने प्लेट के नीचे के साथ गिरावट और पट्ट साथ कुछ खो से संपर्क करें. इसके अतिरिक्त, द्विअक्षीय लोडिंग प्रोटोकॉल नमूने दौरान असंगत लोडिंग के कारण, पर फ्लिप करने की प्रवृत्ति थी. हम प्रक्रिया में वर्णित के रूप में नमूने स्थिर agarose कुओं बनाने के द्वारा इस समस्या का हल. ये agarose कुओं नमूनों को पोषक तत्वों की उपलब्धता सीमित किए बिना नमूने के अनुरूप द्विअक्षीय लोडिंग की अनुमति.
बहुत व्यापक रूप से 20,21 शोध कर रहे हैं कि संपीड़न बायोरिएक्टर के विपरीत, हमारे युक्ति एकाधिक कुल्हाड़ियों पर सटीक उपभेदों को लागू करने में सक्षम है. ये कुल्हाड़ियों स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जा सकता है. Multiaxial लोड हो रहा क्रमिक रूप से या एक साथ लागू किया जा सकता है. यह बेहतर vivo परिस्थितियों में नकल करने के लिए तीन आयामों में यांत्रिक लोड हो रहा है प्रदान करने के लिए शाफ़्ट एक तिहाई को लागू करने के लिए संभव है.
जबअन्य multiaxial बायोरिएक्टर संयुक्त के यांत्रिक पर्यावरण नकल करने के लिए विकसित किया गया है, वे हमारे सिस्टम की तुलना में बड़े सीमाएं हैं. फ्रैंक, एट अल द्वारा बनाया गया एक कतरनी और संपीड़न उपकरण. लोड राय के साथ एक साथ लोड करने के लिए 12 नमूने लिए अनुमति देता है, लेकिन निर्माणों सीमित या 6 सुरक्षित नहीं हैं. कतरनी तनाव से जुड़े प्रयोगों के दौरान यह निर्माणों वे लोड पट्ट तहत स्लाइड नहीं है कि इतनी सुरक्षित किया जाना आवश्यक है. स्लाइडिंग नमूना की असमान और असंगत कतरनी लोडिंग का परिणाम देगा. ऐसे अद्वितीय "रोलिंग गेंद" प्रणाली 22,23 और एक द्विअक्षीय उत्तेजना डिवाइस के रूप में 16 नए बायोरिएक्टर,, एक बहुत अधिक यथार्थवादी और लगातार लोडिंग माहौल बनाने, लेकिन वे केवल एक नमूना एक समय में लोड करने की अनुमति देते हैं. बड़े नमूना आकार विश्वास की एक उच्च स्तर के साथ निर्माणों पर आवश्यक जैव रासायनिक, यांत्रिक, और ऊतकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं. आदिtionally, "रोलिंग गेंद" प्रणाली बल राय, इन विट्रो खेती में लंबी अवधि के दौरान निर्माण विकास का एक आवश्यक उपाय का अभाव है. यह भी पट्ट-नमूना गैर संपर्क और अचल ऊतक इंजीनियर निर्माणों को नुकसान होगा जो नमूना ओवरलोडिंग की रोकथाम की अनुमति देता है. बियान, एट अल. द्वारा विकसित एक रपट संपर्क बायोरिएक्टर एक साथ लोड करने के लिए चार निर्माणों के लिए अनुमति देता है, लेकिन अभी भी इस बहुमूल्य बल प्रतिक्रिया तंत्र 17 का अभाव है.
24 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर मौजूदा सेटअप के 24 नमूनों की एक साथ लोडिंग की अनुमति देता है, और अधिक नमूने लोड पट्ट की ज्यामिति के संशोधनों के साथ संभव हो रहे हैं. लोड पट्ट उपन्यास डिजाइन करने के लिए विशाल लचीलापन प्रदान करता है. polysulfone झरझरा है चुना सामग्री, निष्फल और एक मशीन की उमस और गर्म वातावरण में खेती की जा सकती. यह नमूने के geometries और संख्या की एक किस्म एक साथ लोड करने के लिए सक्षम करने के लिए, आसानी से machinable हैly है.
अंत में, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए नए द्विअक्षीय लोड बायोरिएक्टर ऊतक इंजीनियर निर्माणों की इन विट्रो खेती में लंबी अवधि के लिए सक्षम बनाता है. Biaxial लोड proteoglycan और कोलेजन बयान और ऊतक इंजीनियर उपास्थि नमूनों की मोटाई में वृद्धि हुई है लेकिन हम धारणा के रूप में काफी इंजीनियर उपास्थि के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करने के लिए नहीं लग रहे थे. अक्षीय संपीड़न proteoglycan बयान और यंग मापांक दोनों में वृद्धि हुई. हम यांत्रिक लोडिंग के इष्टतम खुराक सेल और ऊतक गुणों के साथ अलग है कि विश्वास करते हैं. कोलेजन वास्तुकला और लदान की मात्रामापी के भविष्य के अध्ययन के लिए हमें पूरी तरह से इंजीनियर के ऊतकों के विकास पर द्विअक्षीय लोडिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करने की अनुमति देगा.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम के अनुसंधान और विकास, आर आर एंड डी सर्विस, दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग, एनआईएच Cobre 1P20RR024484, एनआईएच K24 AR02128 और रक्षा W81XWH-10-1-0643 विभाग के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
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