Design av en Biaxial Mekanisk belastning bioreaktor for Tissue Engineering
Summary
Vi har konstruert en roman mekanisk belastning bioreaktor som kan søke uniaxial eller biaxial mekanisk påkjenning for en brusk biocomposite før transplantasjon inn i en leddbruskskader.
Abstract
Vi har konstruert en lademekanisme som er i stand til å anvende uniaxial eller biaxial mekanisk belastning til en vev konstruerte biocomposites fabrikkert for transplantasjon. Mens apparatet primært fungerer som en bioreaktor som etterligner de opprinnelige mekaniske belastninger, er det også utstyrt med en lastcelle for å gi kraft tilbakemelding eller mekanisk testing av konstruksjoner. Enheten fagene konstruert brusk konstruerer til biaxial mekanisk belastning med stor presisjon av startdose (amplitude og frekvens) og kompakt nok til å passe inn i en standard vev kultur inkubator. Den laster prøver direkte i en vevkulturplate, og flere plate størrelser er kompatible med systemet. Enheten er utviklet ved hjelp av komponenter produsert for presisjonsstyrte laser-programmer. Bi-aksiell belastning oppnås ved to ortogonale faser. Etappene har en 50 mm kjøreområdet og drives uavhengig av stepper motor aktuatorer, styrt avet lukket stepper motor driver som har mikro-stepping evner, slik at trinn størrelser på mindre enn 50 nm. En polysulfon lasting platen er koplet til den bi-aksiale bevegelig plattform. Bevegelser av etappene er kontrollert av Thor-labs Avansert Positioning Technology (APT) programvare. Den stepper motor driver blir brukt sammen med programvare for å justere belastningsparametere av frekvens og amplitude av både skjær og kompresjon uavhengig av hverandre og samtidig. Posisjonelle tilbakemeldinger er levert av lineære optiske givere som har en toveis repeterbarhet på 0,1 mikrometer og en oppløsning på 20 nm, oversette til en posisjonsnøyaktighet på mindre enn tre mikrometer over hele 50 mm med reise. Disse kodere gi den nødvendige posisjon tilbakemelding til drivelektronikken å sikre sanne nanopositioning evner. For å tilveiebringe den kraft som tilbakemelding for å detektere kontakt og evaluere lasting responser, er en presisjon miniatyr lastcelle plassert mellom lastkammeret og den beveger glassplateng plattform. Lastcellen har høye nøyaktighet på 0,15% til 0,25% av full skala.
Introduction
Vi har utviklet en lasting bioreaktor som er i stand til å anvende uniaxial eller biaxial mekanisk belastning til en vev konstruerte biocomposites fabrikkert for transplantasjon. Denne enheten er i hovedsak utformet som en bioreaktor for konstruerte erstatninger for artikulær brusk, det kan også brukes for andre bærende vev i menneskekroppen. Vår motivasjon i denne bioreaktor utforming stammer fra Drachman og Sokoloff en, som gjorde banebrytende observasjon av unormal dannelse av leddbrusk i lammet kyllingembryo grunn av fravær av bevegelse. Tilsvarende er fysisk trening viktig for utvikling av normal muskel og bein. I tråd med dette konseptet, har mange forskningsgrupper undersøkt hvordan ulike former for fysiske stimuli under in vitro dyrking modulerer biokjemiske og mekaniske egenskaper av celle-biomateriale biocomposites og vev eksplantater 2-7. Begrepet funksjonell tissue engineeringinvolverer in vitro bruk av mekanisk påvirkning for å forbedre de funksjonelle egenskaper av vev, det vil si de mekaniske egenskaper som gjør at vevet for å tåle de forventede in vivo trykk og strekk, 8,9. Tallrike studier rapporterer bruk mekanisk belastning i form av skjær og komprimering for å stimulere konstruerte brusk konstruerer for articular leddene. Mauck et al. 10. antyder at mekanisk lasting alene kan indusere chondrogenesis for stamceller, selv i fravær av vekstfaktorer som anses viktig. Anvendelse av intermitterende mekanisk belastning som for eksempel kompresjon eller skjærkraft under vev dyrking har vist seg å modulere brusk og bendannelse, men den optimale dosimetri av lasting forskjellig med celle-og vevs egenskaper 11.
Den viktigste funksjon av leddbrusk er evnen til å motstå trykk-og skjær-krefter innenforfelles, derfor har det å ha høy komprimering og skjær moduli. Mangelen på funksjonell mekanisk styrke og fysiologiske ultrastructure innen utformet brusk har resultert i nedbryting på neo-brusk in vivo og svikt i brusk erstatning strategier i leddene. Selv kompresjons-og skjær-er blitt hyppig vist seg å modulere og bedre mekanisk styrke i leddbrusk biocomposites, er en kombinasjon tilnærming sjelden 6,12-15. Wartella og Wayne 16 utviklet en bioreaktor som gjaldt strekk og kompresjon for å produsere menisk brusk erstatninger. Waldman et al. 15. konstruert en enhet for å bruke komprimering og skjær til chondrocytes dyrket i et porøst kalsium polyphosphate underlaget. Bian et al. 17. demonstrert mekaniske egenskaper matchende innfødte brusk med in vitro dyrking av voksen hjørnetann chondrocytes i geler og anvendelse av biaxial mechanical lasting (compressive DEFORMASJONS lasting og glidekontakt lasting).
Den biaxial mekanisk belastning bioreaktor ble opprinnelig designet av Danielle Chu i vårt laboratorium med overordnet mål å indusere morfologiske tilpasninger i vev konstruert brusk konstruerer resulterer i høyere trykk-og skjær moduli enn tiden tilgjengelig 18. Vi tror denne forskningen vil øke vår bredere forståelse av hvordan mechanotransduction kan moduleres til ingeniør klinisk relevante vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utviklet en lademekanisme som er i stand til å anvende uniaxial eller biaxial mekanisk belastning til vev konstruerte konstruerer fabrikkert for transplantasjon. Anordningen kan benyttes som en bioreaktor for in vitro dyrking av konstruerte biocomposites eller som en testanordning for å beskrive de mekaniske egenskapene til den opprinnelige vev eller etter annen behandling før. Enheten fagene konstruert vev konstruerer til biaxial mekanisk belastning med stor presisjon av startdose (amplitude og frekv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Office of Research and Development, RR & D tøy, US Department of Veterans Affairs, NIH Cobre 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 og Department of Defense W81XWH-10-1-0643.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Bilgen, B., et al. Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
