Design af en Biaksial Mekanisk Loading bioreaktor for Tissue Engineering
Summary
Vi har designet en roman mekanisk belastning bioreaktor, der kan anvende enaksede eller biaksial mekanisk belastning til en brusk biokomposit før transplantation ind i en ledbrusken defekt.
Abstract
Vi har designet en belastning enhed, der er i stand til at anvende énakset eller biaksial mekanisk belastning til en manipuleret væv biokompositter fabrikeret til transplantation. Mens enheden primært fungerer som en bioreaktor, der efterligner de native mekaniske belastninger, er det også udstyret med en vejecelle til tilvejebringelse force feedback eller mekanisk prøvning af konstruktionerne. Enheden emner manipuleret brusk konstruktioner til biaxial mekanisk belastning med stor præcision støddosis (amplitude og frekvens), og er kompakt nok til at passe inde i en standard vævsdyrkningsinkubator. Den indlæser prøver direkte i en vævskultur plade, og flere pladestørrelser er forenelige med systemet. Enheden er designet ved brug komponenter, som fremstilles for præcisionsstyrede laser applikationer. Bi-aksial belastning opnås ved to ortogonale etaper. Etaperne har en 50 mm vandring rækkevidde og drives selvstændigt af stepmotor aktuatorer, der styres afet lukket kredsløb stepmotor driver, der er udstyret med mikro-Stepping kapaciteter, så trin kornstørrelser på mindre end 50 nm. En polysulfon loading plade er koblet til bi-aksial bevægelse platform. Flytninger af etaperne er kontrolleret af Thor-labs Avanceret Positioning Technology (APT) software. Stepper motor driver bruges sammen med software til at justere belastningen parametre frekvens og amplitude af både forskydning og kompression uafhængigt og samtidigt. Positionsfeedback er leveret af lineære optiske målesystemer, der har en tovejs gentagelsesnøjagtighed på 0,1 um og en opløsning på 20 nm, oversætte til et positionel nøjagtighed på mindre end 3 m over det fulde 50 mm vandring. Disse givere yde den nødvendige position feedback til køreelektronikken at sikre ægte nanopositioning kapaciteter. For at tilvejebringe den force feedback at detektere kontakt og evaluere loading svar er en præcision miniature vejecelle anbragt mellem lastningen valsen og Moving platform. Vejecellen har høje nøjagtighed af 0,15% til 0,25% af fuld skala.
Introduction
Vi har designet en belastning bioreaktor, der er i stand til at anvende énakset eller biaksial mekanisk belastning til en manipuleret væv biokompositter fabrikeret til transplantation. Denne enhed er primært beregnet som en bioreaktor for manipuleret erstatninger for ledbrusk, kunne den også anvendes til andre bærende væv i den menneskelige krop. Vores motivation i denne bioreaktor design stammer fra Drachman og Sokoloff 1, der gjorde den skelsættende observation af unormal dannelse af ledbrusk i lammede kyllingeembryoer grundet fravær af bevægelse. Tilsvarende motion er afgørende for udviklingen af normale muskler og knogler. I overensstemmelse med dette koncept, har mange forskergrupper undersøgt, hvordan forskellige former for fysiske stimuli under in vitro dyrkning modulerer de biokemiske og mekaniske egenskaber af celle-biomateriale biokompositter og væv eksplanteret 2-7. Begrebet funktionelle vævsmanipuleringinvolverer in vitro-anvendelse af mekaniske stimuli for at forbedre de funktionelle egenskaber af væv, dvs de mekaniske egenskaber, der gør det muligt for vævet at modstå den forventede in vivo-stress og pres 8,9. Talrige undersøgelser indberette anvendelsen mekanisk belastning i form af forskydning og kompression til at stimulere manipuleret brusk konstruktioner for artikulær leddene. Mauck et al. 10. tyder på, at mekanisk belastning alene kan inducere chondrogenese af mesenkymale stamceller, selv i fravær af vækstfaktorer, der anses afgørende. Anvendelse af intermitterende mekanisk belastning, såsom kompression eller forskydning under væv dyrkning har vist sig at modulere brusk og knogledannelse, men den optimale dosimetrien lastningen afviger med celler og væv egenskaber 11.
Den vigtigste funktion af ledbrusk er evnen til at modstå tryk-og forskydningskræfter undersamlingen, derfor har det at have høj trykstyrke og shear moduli. Manglen på funktionelle mekanisk styrke og fysiologiske ultrastruktur i manipuleret brusk har resulteret i opdeling neo-brusk in vivo og svigt af brusk udskiftning strategier i leddene. Selvom kompression og forskydning er blevet almindeligt påvist at modulere og forbedre mekaniske styrke af ledbrusken biokompositter, en kombination tilgang er sjælden 6,12-15. Wartella og Wayne 16 designet en bioreaktor, der blev anvendt spænding og kompression til at producere menisk brusk udskiftninger. Waldman et al. 15. konstrueret en anordning til at anvende kompression og forskydning til chondrocytter dyrket i et porøst calcium polyphosphat substrat. Bian et al. 17 viste mekaniske egenskaber matcher nativ brusk med in vitro dyrkning af voksne hunde chondrocyter i geler og anvendelse af biaksial mechnisk belastning (trykstyrke deformational lastning og glidende kontakt belastning).
Den biaxial mekanisk belastning bioreaktor blev oprindeligt designet af Danielle Chu i vores laboratorium med det overordnede mål at fremkalde morfologiske tilpasninger manipuleret væv brusk konstruerer resulterer i højere tryk-og shear moduli end i øjeblikket tilgængelige 18 år. Vi tror denne forskning vil øge vores bredere forståelse af, hvordan mechanotransduction kan moduleres til ingeniør klinisk relevante væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har designet en belastning enhed, der er i stand til at anvende énakset eller biaksial mekanisk belastning til manipuleret væv konstruktioner fremstillet til transplantation. Enheden kan anvendes som en bioreaktor til in vitro dyrkning af industrielt biokompositter eller som en testindretning til at beskrive de mekaniske egenskaber af det native væv eller efter andre behandlinger før. Enheden emner manipuleret vævskonstruktioner til biaxial mekanisk belastning med stor præcision bolusdosis (amplitude o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Kontoret for forskning og udvikling, RR & D-service, US Department of Veterans Affairs, NIH Cobre 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 og Department of Defense W81XWH-10-1-0643.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Bilgen, B., et al. Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
