Summary
Vi konstruerade en ny mekanisk belastning bioreaktor som kan ansöka enaxlig eller tvåaxlig mekaniska påfrestningar till ett brosk biokompositmaterial före transplantation till en ledbrosk defekt.
Abstract
Vi konstruerade en belastning som är kapabel att tillämpa enaxlig eller tvåaxlig mekanisk påfrestning till en vävnadsteknisk biokompositer tillverkade för transplantation. Medan anordningen primärt fungerar som en bioreaktor som härmar de nativa mekaniska påkänningar, är det också utrustad med en lastcell för att tillhandahålla kraft feedback eller mekanisk provning av konstruktionerna. Enheten ämnen konstruerade brosk konstruktioner till biaxial mekanisk belastning med stor precision av laddningsdos (amplitud och frekvens) och är kompakt nog att få plats i en vanlig vävnadsodling inkubator. Den laddar prover direkt i en vävnadsodlingsplatta, och multipla plattan storlekar är kompatibla med systemet. Apparaten har konstruerats med hjälp av komponenter tillverkade för styrd laser applikationer. Bi-axiell belastning åstadkommes genom två ortogonala etapper. Stegen har en 50 mm rörelseområde och drivs självständigt av stegmotorn ställdon, som styrs aven sluten slinga stegmotor driver som presenterar mikro-stepping kapacitet, vilket gör steg som är mindre än 50 nm. En polysulfon loading formbordet är kopplad till den bi-axiella rörlig plattform. Förflyttning av stegen styrs av nog-labs Advanced Positioning Technology (APT) programvara. Stegmotorn drivrutinen används med programvara för att justera belastningen parametrar för frekvensen och amplituden hos både skjuvning och tryck oberoende och samtidigt. Positionsfeedback tillhandahålls av linjära optiska pulsgivare som har en dubbelriktad repeterbarhet på 0,1 m och en upplösning på 20 nm, översätta till en lägesnoggrannheten mindre än 3 mikrometer över hela 50 mm rörelse. Dessa givare ger den nödvändiga lägesåterkoppling till drivelektronik för att säkerställa sann nanopositioning kapacitet. För att tillhandahålla den kraft återkoppling att detektera kontakt och utvärdera lastning svar fungerar en precision miniatyr lastcell placerad mellan lastningen plattan och moving plattform. Lastcellen har hög noggrannhet på 0,15% till 0,25% av full skala.
Introduction
Vi har utformat en belastning bioreaktor som är i stånd att tillämpa enaxlig eller tvåaxlig mekanisk påfrestning till en vävnadsteknisk biokompositer tillverkade för transplantation. Denna enhet är i första hand avsedd som en bioreaktor för engineered ersättare för ledbrosk, det kan också användas för andra bärande vävnader i människokroppen. Vår motivation i denna bioreaktor designen kommer från Drachman och Sokoloff 1, som gjorde banbrytande observation av onormal bildandet av ledbrosk i förlamade kycklingembryon grund avsaknad av rörelse. Likaså är motion viktigt för utvecklingen av normala muskler och ben. I linje med detta koncept, har många forskargrupper undersökt hur olika typer av fysiska stimuli under odling in vitro modulerar de biokemiska och mekaniska egenskaper hos cell-biomaterial biokompositer och vävnadsdelar vävnad 2-7. Begreppet funktionell vävnadsteknikinvolverar in vitro-användning av mekaniska stimuli för att förbättra de funktionella egenskaperna hos vävnader, det vill säga de mekaniska egenskaper som gör att vävnaden för att motstå den förväntade in vivo påfrestningar 8,9. Talrika studier rapporterar användningen mekanisk belastning i form av skjuvning och tryck för att stimulera iscensatte brosk konstruktioner för artikulära lederna. Mauck et al. 10 tyder på att mekanisk belastning ensam kan inducera kondrogenes av mesenkymala stamceller även i frånvaro av tillväxtfaktorer som anses avgörande. Tillämpning av intermittent mekanisk belastning såsom kompression eller skjuvning under vävnadsodling har visats modulera brosk-och benbildning, men den optimala dosimetri för lastning varierar med cell och egenskaper vävnad 11.
Den viktigaste funktionen av ledbrosk är förmågan att motstå kompressionskrafter och skjuvkrafter inomleden, därför måste det ha hög tryckhållfasthet och skjuvmodulerna. Bristen på fungerande mekanisk hållfasthet och fysiologiska ultrastrukturen i engineered brosk har resulterat i fördelningen på neo-brosk in vivo och den misslyckade strategier broskcellstransplantationer i lederna. Även kompression och skjuvning har ofta visat att modulera och förbättra mekanisk hållfasthet Biokompositer ledbrosk, är en kombination tillvägagångssätt sällsynt 6,12-15. Wartella och Wayne 16 utformat en bioreaktor som gällde spänning och kompression för att producera meniskbrosk ersättare. Waldman et al. 15 utformat en anordning för att tillämpa kompression och skjuvning till kondrocyter odlade i ett poröst Kalciumpolyfosfat substrat. Bian et al. 17 visade mekaniska egenskaper matchande nativt brosk med in vitro odling av vuxna canine kondrocyter i geler och tillämpning av biaxiell mechanical belastning (komprimerande deformerande lastning och glidande kontakt lastning).
Den biaxiala mekanisk belastning bioreaktor designades ursprungligen av Danielle Chu i vårt laboratorium med det övergripande målet att inducera morfologiska anpassningar i vävnadsteknisk brosk konstruerar resulterar i högre tryck-och skjuvmodulerna än idag finns 18. Vi tror att denna forskning kommer att öka betydligt vår bredare förståelse för hur mechanotransduction kan moduleras till ingenjör kliniskt relevanta vävnaderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Biaxial Loading Bioreactor Design
- Bioreaktorn sysselsätter två steg tillverkade av Thor-Labs (Newton, MA) för styrd laserapplikationer för applicering enaxlig eller biaxiell mekaniska påfrestningar till konstruerade vävnader, med stor precision av laddningsdos (amplitud och frekvens) och applicering på ett stort antal olika vävnad odlingsbetingelser från enkelt till 24-brunnsplattor (figur 1).
- Bi-axiell belastning åstadkommes genom två TravelMax etapper (LNR50SE). Dessa faser är monterade ortogonalt i XZ-konfiguration. Den horisontella steget har dynamiska klipporganen rörelser genom att oscillera längs X-axeln. Den vertikala steget ger dynamisk kompressiv belastning genom att oscillera längs Z-axeln. Dessa faser har en 50 mm rörelseområde och drivs självständigt av stegmotor manöverdon (DRV014), som kontrolleras av en sluten slinga stegmotor drivrutin (BSC102) som innehåller mikro-stepping kapacitet, vilket gör steg som är mindre än50 nm.
- Anordningen är monterad på en fast 25 cm x 30 cm x 12,5 mm aluminiumbasplåt som används som en plattform för montering av maskinkomponenter och för montering av plattor för vävnadsodling. Justerbara kinematiska stopp används för att låsa vävnadsodlingsplattor på plats på aluminiumbasplåt. Dessa kinematiska hållplatser har fina justerskruvar för att möjliggöra exakt inriktning som annars inte uppnås för hand. Den modulära designen av bottenplattan ger flexibel placering av dessa kinematiska slutar att rymma plattor av olika storlekar och former (petriskålar vs flerbrunnsplattor).
- En skräddarsydd bearbetad polysulfon lastning plattan är kopplad till bi-axial rörlig plattform via en precision-svarvad rätt vinkel fäste. Polysulfone material valdes tack vare dess biokompatibilitet, enkel bearbetning och enkel sterilisering.
- Förflyttning av stegen styrs av nog-labs "Advanced Positioning Technology (APT) programvara. Stegmotorn föraren är ossed i kombination med programvara som tillåter justering av belastningsparametrar av frekvensen och amplituden hos både skjuvning och tryck oberoende och samtidigt.
- Positionsfeedback tillhandahålls av linjära optiska pulsgivare som är knutna till varje rörlig plattform och är integrerade med programvaran. Givaren systemet har en dubbelriktad repeterbarhet på 0,1 pm och en upplösning på 20 nm, översätta till en lägesnoggrannheten mindre än 3 mikrometer under hela 50 mm rörelse. Dessa givare ger den nödvändiga lägesåterkoppling till drivelektronik för att säkerställa sann nanopositioning kapacitet och en direkt avläsning av den absoluta positionen.
- För att tillhandahålla den kraft återkoppling krävs för att upptäcka kontakt mellan plattan och prover och utvärdera lastning besvarandet har en precision miniatyr belastningscell (Honeywell Modell 31) är placerad mellan lastningen formbordet och den rörliga plattformen (figur 2). Lastcellen har höga noggrannhet hos0,15% till 0,25% av full skala. Displayenheten (SC500) för lastcellen kan också ge belastning mätningar av upp till fem decimaler. Dessutom har det en RS-232-port för att möjliggöra insamling av data på en dator.
2. Cell-seedade Agarose konstruktioner
- Förbered 4% agaros: Tillsätt 0,8 g agaros till 20 ml DMEM (inga tillsatser) i en 50 ml kolv, koka, och sedan hålla i 70 ° C ugn tills användning.
- Justera volymen av cellsuspension för dubbel mängd av den önskade cellympning densitet. Denna suspension blandas med lika stor volym av 4% vikt / volym agaros för att skapa en 2% agarosgel vid den önskade såddtäthet.
- Placera både cellsuspensionen och en 10 ml pipett i inkubatorn.
- Konfigurera systemet gelgjutning. En 1,5 mm och en 0,75 mm spacer platta bör sättas samman för att skapa en 2,25 mm tjock gel. Andra format distansplattor kan användas för att skapa olika gel tjocklekar. Gelén gjutsystem är inte tillräckligt stor för att hålla dessa plattor togethenne, så de måste vara säkert tejpas för att förhindra läckage.
- Nästa steg är att snabbt blanda cellsuspensionen med den tidigare beredda agaros och pipett in i gelén formen innan agarosen stelnar. Avlägsna vätskan agaros från ugnen och placera en steril termometer i det. Agarosen måste kyla till 42-43 ° C före blandning med celler. Värm upp cellsuspensionen till 37 ° C. När agarosen träffar 43 ° C, snabbt pipettera upp önskad mängd och sedan omedelbart pipett cellsuspensionen upp och ner ett par gånger för att blanda. Sedan omedelbart pipettera hela blandningen i gelen mögel.
- Låt gelen stelna i 10-15 min och sedan försiktigt luta den till ett horisontellt läge.
- Ta bort den övre glasskivan och diskar punsch med biopsi punch. Diskar kan plockas upp med en liten steril spatel. I vår erfarenhet, var en 9 ml gel stor nog att göra mer än hundra 5-mm-diameter skivor.
Tre. Kultur diskarna
4. Immobilisering av prover för mekanisk belastning
- Förbered 4% agaros (ingen cellsuspension tillsattes) och gelén bör vara tunnare än de prover som själva (för att förhindra interferens under lastning). Den rekommenderade tjocklek är 1,5-1,9 mm (för 2,25 mm tjocka prover).
- När geléartad, punsch 16 mm diameter skivor för 24 brunnar. I varje disk, till stans ett 5 mm hål för provet placeras i. Om så önskas, punch ytterligare 5 mm hål på kanten av skivan för pipetten som ska placeras under media förändringar.
- När agaros brunnar har gjorts, placera dem i 24-brunnars platta, såsom visas i fig. 3.
- När agarosen wells är i 24 brunnar, presspassning prov i varje brunn. Provet bör skjuta ut från toppen av agarosen väl.
Fem. Mekanisk Loading
- Sterilisera platta (Figur 2).
- Säkra aluminiumplåt att ladda cellen. Säker lastning plattan / lastcell / aluminiumplåt montering till scenen.
- Slå på stegmotorer (switch på baksidan).
- Slå på datorn och öppna "APT User"-programmet (Figur 4).
- Vänster skärm styr horisontell stegmotor. Höger skärm styr vertikala stegmotor. I varje skärm, "Graphical Control" fliken möjliggör manuell positionering och "Move Sequencer" fliken möjliggör automatisering. Alla enheter är mm.
- Gå till "Graphical Control" fliken på båda skärmarna och trycker på "Hem / Zero"-knappen. Både stegmotorer har en räckvidd på 50 mm. Tryck på "Start / Zero" kommer att skicka både stegmotorer till nolläget (topp-och höger-de flesta lägen).
- Förberedere proverna i 24 brunnar för lastning genom att ta bort vissa medier från varje brunn. Inte mer än 1 ml medium bör lämnas i varje brunn för att förhindra spill under lastningen. Se till att tillräckligt många medier är kvar i brunnen för att hålla provet omfattas.
- Observera att inkubatorn hålls i med låg luftfuktighet förhållanden för att förhindra fel på instrumentet.
- Placera 24 brunnar i bioreaktor och försiktigt rada upp med plattan.
- Plattan är fäst till bioreaktom med användning av fyra justerbara kinematiska locators. För att göra det lättare att rada upp plattan, har de två vänstra locators varit pre-läge. Dra åt de två högra locators så att plattan är säker. Se till att rada upp plattan jäms med framsidan av bioreaktorn bas.
- I "Graphical Control" fliken, kan ett visst stegmotor positionen matas in manuellt genom att klicka på positionen rutan. Använd denna funktion för att sakta sänka plattan och flytta den horisontellt för att rada upp med plattan. </ Ol>
- När plattan är nära att komma i kontakt med prover, börja sätta plattan i mycket långsamma steg (0,1 mm) tills du når det förutbestämda startpositionen (se del 6).
- När startpositionen är nådd, gå till "Flytta Sequencer" fliken och ladda önskad flytta sekvensen genom att trycka på "Load". Tryck sedan på "Kör" för att starta. (Figur 5) Se del 7. Skriva en dosering protokoll.
- När lästs manuellt höja plattan. Om några prover fastnat på plattan, försiktigt sätta tillbaka dem i rätt väl med en steril spatel.
- Ta 24 brunnar från bioreaktor och ersätta medierna.
- Ta försiktigt bort plattan från lastcell och sedan stänga av instrument.
6. Kalibrera Loading Platen
För att säkerställa att de rätta stammarna tillämpas på prov, måste varje platta noggrant kalibreras före start ett experiment.
- Manuellt sätta horisontell stegmotor på 25 mm läget.
- Försiktigt nedre plattan tills det knappt kommer i kontakt med botten av bioreaktor. Load cell kommer att visa ökad belastning på denna punkt. Ta del av den exakta positionen för den vertikala stegmotor (vara så exakt som möjligt, eftersom alla komprimering töjningsmätningarna kommer att beräknas från detta värde).
- Spela positionen. Detta värde kommer att användas för att skriva en dosering protokoll baserat på provdimensioner och önskade stammar.
7. Skriva en dosering protokoll
- Den bioreaktor kan tillämpas både tryck-och skjuvspänning, antingen samtidigt eller individuellt. Tre huvudsakliga parametrar måste beslutas: tara tryckpåkänning, dynamisk belastning amplitud och lastning frekvens.
- En tara-stam appliceras för att förhindra liftoffen av plattan från provet.
- Prov dynamisk spänningsamplitud och lastning frefrekvens väljs.
I denna studie har vi definiera tryck-och skjuvtöjning enligt följande: 
Exempel Biaxial dosering protokoll
Prov tjocklek: 2,25 mm
Tare Strain (Compression): 10% av provets tjocklek (0,225 mm)
Dynamisk Strain Amplitud (Compression): 10% (+ / - 5% av provets tjocklek)
Frekvens (Compression): 1 Hz
Dynamisk Strain Amplitud (Shear): 25% av provets tjocklek (0,5625 mm): Skjuvspänning är
appliceras på provet genom valsen rör sig horisontellt.
Frekvens (Shear): 0,5 Hz
Typisk dosering protokoll är 3 tim för lastning per dag.
I detta exempel, är dynamisk och skjuvbelastning tillämpas samtidigt snarare än sekventiellt. Vi tror att detta mönster bättre mimics den komplexa belastning miljön i människors knän.
- När en dosering protokoll har valts, måste en kompression flytta sekvens program skrivas.
- Flytten sekvensen är precis vad det låter som, en lista över positioner som stegmotorn kommer att flytta till vid en viss acceleration och maximal hastighet.
- Beräkna önskade vertikala positioner baserade på dosering protokoll och plattan kalibrering värde (från del 6).
- Exempel beräkningar för Platen 1 anges nedan:
| Skillnad från kalibreringsvärdet | Vertikal position | |
| Platen Calibration Standard (berör botten av bioreaktor) | 0 mm | 29,7700 mm |
| Glasskivan kommer i kontakt med prov (2,25 mm prov) | 4,4140 mm | 25,3560 mm |
| Stregn (5% tjocklek) | 4,3015 mm | 25,4705 mm |
| Töjning (10% tjocklek) | 4,1890 mm | 25,5810 mm |
| Töjning (15% tjocklek) | 4,0765 mm | 25,6955 mm |
- När positionerna beräknas, experimentera med acceleration och maxvärden hastighet för att få rätt frekvens. Antalet cykler bör väljas, därefter (t.ex. 10.800 cykler för 3 timmar vid 1 Hz).
- Exempel Dynamisk komprimering Move Sequence Program (10% tara kompression, 10% dynamisk töjning amplitud, 1 Hz) (Figur 5)
- Dynamisk skjuvning flyttar sekvens program: Antalet cykler bör väljas med hänsyn till önskad frekvens och varaktighet (t.ex. 5.400 cykler under 3 timmar vid 0,5 Hz).
- Exempel Dynamisk skjuv Move Sequence Program (10% tara komprimering, 0,5625 mm (25% av tjockleken) dynamisk skjuvspänning amplitud, 0,5Hz) (Figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anordningen testades genom att använda agarosgeler ympades med 20 miljoner celler / ml kondrocyter och odlas i närvaro av enaxlig (kompression) eller biaxiell (kompression och skjuvning) mekanisk belastning. Primära porcina kondrocyter isolerades från ledbrosk i 2-4 månader gamla grisar. 5 mm diameter och 1,5 mm tjocka prover odlades i 2 ml definierat kondrogen odlingsmedium (hög glukos DMEM, 1% ITS + Premix, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 2,5 ^ g / ml amfotericin B, 50 | ig / ml askorbinsyra, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,4 mM prolin,) i 24-brunnars plattor vid 37 ° C, 5% CO2. 10 -7 M dexametason och 10 ng / ml TGF-β1 levererades under de första 10 dagarna av odling. Proverna laddades för 3 tim / dag mellan dag 10-30. Enaxlig laddning bestod av 10% kompression topp-till-topp-amplitud, bestod 1 Hz och biaxiell belastning av 0,15 mm (10% tjocklek) komprimering och 0,075mm skjuvning topp-till-topp-amplitud, 1 Hz. Den dynamiska spänningsamplitud och lastning frekvens väljs utifrån publicerade studier 17,19. Vid slutet av 30 dagar biokemiska och mekaniska egenskaper av konstruerade brosk bedömdes.
Denna studie användes tre grupper: 1 - Ingen lastning kontroll, 2 - Enaxlig (tryckspänning) lastning, 3 - Biaxial (tryck-och skjuvning) lastning. De DNA-innehåll och de våta vikter konstruktioner förblev likartad i de tre grupperna efter 30 dagars odling (p> 0,05). Den GAG-halt var högst i den grupp som underkastades biaxiell belastning (grupp 3, p <0,001 jämfört med kontrollgruppen), följt av den uniaxiella lastning gruppen (grupp 2, p <0,05) (Figur 6). Gag innehållet i grupperna 2 och 3 motsvarar 48% respektive 50% av nativt brosk, respektive. Grupp 3 resulterade i signifikant högre mängden kollagen än grupp 1 och 2 (p <0,01). Grupp 2 hade också tjockare konstruktioner thaN-grupp 1 (p <0,01). Överraskande, var jämvikt komprimerande elasticitetsmodulen den högsta i grupp 2 (enaxlig belastning, p <0,01) och det fanns inga signifikanta skillnader mellan grupp 3 och 1. Den Youngs grupp 2 motsvarade 60,1% av infödda svin brosk.
De histologiska analyser indikerade positiv och homogen färgning för glykosaminoglykaner (alcianblått, safranin O) och typ II kollagen (Figur 7). Alla grupper färgades negativ för typ I-kollagen (ej visad).
Sammanfattningsvis, dessa preliminära resultat tyder på att denna bioreaktor framgång tillämpas komprimering och tvåaxlig (kompression och skjuvning) mekanisk belastning under lång sikt odling av manipulerade vävnader. I denna studie biaxiell belastning visades för proteoglykan och kollagen nedfall och tjockleken på vävnadstekniska brosk prover. Enaxlig kompression ökade både proteoglykanen nedfall och Youngs modul.
Figur 1. Biaxial lastning åstadkommes av X-steget (skjuvning) och Z-steget (komprimering). Figuren visar en skräddarsydd lastning plattan fäst till stadiet att ladda proven i en 24-brunnars platta. De Hämtar parametrar styrs med en dator ansluten till stegmotorer 18.
Figur 2. Till vänster: polysulfon loading formbordet avsedd för 24-brunnsplattor. Höger: Belastningen valsen infästning till biaxiala lastning bioreaktor.
Figur 3. Framställning av agaros brunnar för immobilisering prover under skjuvbelastning. Det immobiliserade konstruktionen placeras i agaros väl för mekanisk belastning. Denna figur visar en 1,5 mm tjock agaros väl och ett 2,25 mm tjockt prov.
Figur 4. Det grafiska användargränssnittet för att styra biaxiala lastanordningen. Klicka här för att visa en större bild .
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50387/50387fig5.jpg "/>
Figur 5. Exempel Biaxial Loading Move Sequence Program Graphical User Interface: Dynamisk komprimering Move Sequence Program (10% tara kompression, 10% dynamisk belastning amplitud, 1 Hz) och Dynamic Shear Move Sequence Program (10% tara kompression, 25% dynamisk skjuvspänning amplitud, 0,5 Hz). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Biokemiska och mekanisk testresultat (n = 6) *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05 jämfört med grupp 1 (obelastad kontroll Grupp 2:.. Enaxlig kompressiv belastning, grupp 3: Biaxial tryck-och skjuvning lastning.
Figur 7. Histologi: Alcian blue / nukleär Fast Red färgning, Safranin O / snabb grön, immunokemi för typ II kollagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utformat en belastning som är kapabel att tillämpa enaxlig eller tvåaxlig mekanisk påfrestning för vävnadstekniska konstruktioner tillverkade för transplantation. Anordningen kan användas som en bioreaktor för odling in vitro av konstruerade biokompositer eller som en testanordning för att beskriva de mekaniska egenskaperna hos den naturliga vävnaden eller efter andra behandlingar före. Enheten försökspersoner engineered vävnad konstruktioner till biaxiell mekanisk belastning med stor precision av laddningsdosen (amplitud och frekvens) och applicering på ett stort antal tillstånd vävnadsodling från enstaka till 24 brunnsplattor.
Tillämpningen av skjuvbelastning presenterades en uppsättning unika utmaningar för utformningen av detta system. För att maximera näringsämnen överföring, var konstruktioner ursprungligen unconfined i enskilda brunnar i en 24 brunnar. Detta inte utgör ett problem för dynamisk kompression, som tara stukning försäkrade attprov-platta kontakten var inte förlorat. När skjuvtöjning lades till protokollet, men gled unconfined prover längs botten av plattan och en del förlorad kontakt med plattan. Dessutom, under biaxiella lastning protokoll proven hade en tendens att tippa över, vilket orsakar inkonsekvent belastning. Vi löst detta problem genom att skapa agarosen brunnar för att immobilisera prover såsom beskrivits i förfarandet. Dessa agaros brunnar möjliggör konsekvent biaxial lastning av prover utan att begränsa tillgången på näringsämnen i prover.
Till skillnad från komprimering bioreaktorer som är mycket allmänt forskat 20,21, är vår enhet som kan tillämpa exakta påfrestningar på flera axlar. Dessa axlar kan styras oberoende. Multiaxiell belastning kan appliceras sekventiellt eller samtidigt. Det är möjligt att genomföra en tredje Y-axel för att åstadkomma mekanisk belastning i tre dimensioner för att bättre härma in vivo-betingelser.
Medanandra fleraxliga bioreaktorer har utvecklats för att efterlikna den mekaniska miljön i leden, de har stora begränsningar jämfört med vårt system. En skjuvning och tryck apparat designad av Frank, et al. tillåter upp till 12 prover som skall lastas samtidigt med last återkoppling, finns dock konstruktioner inte begränsas eller säkrad 6. Under experiment med skjuvdeformation, är det viktigt att konstruktioner säkras så att de inte glider under lastning formbordet. Sliding kommer att resultera i ojämn och inkonsekvent skjuvbelastning av provet. Nyare bioreaktorer, såsom den unika "rullande boll" systemet 22,23 och en tvåaxlig stimuleringsanordning 16, skapa en mycket mer realistisk och konsekvent lastning miljö, men de tillåter endast ett prov som skall lastas på en gång. Stora urvalen är grundläggande för att utföra de nödvändiga biokemiska, mekaniska och histologiska analyser av konstruktioner med en hög grad av förtroende. Additionellt, saknar den "rullande boll" systemet force feedback, ett viktigt mått på konstruktion utveckling under lång tid in vitro odling. Det gör också att förebygga digelpressidan provet beröringsfri och prov överbelastning, vilket irreversibelt skadar vävnadstekniska konstruktioner. En glidande kontakt bioreaktor utvecklad av Bian, et al. Tillåter upp till fyra konstruktioner som skall lastas samtidigt, men ändå saknar denna värdefulla mekanism force feedback 17.
Den nuvarande inställning med 24 brunnar tillåter samtidig laddning av 24 prover, fler prover är möjliga med modifikationer av geometrin av lastning plattan. Belastningen plattan ger en enorm flexibilitet för den nya designen. Det valda materialet polysulfon är porös, kan steriliseras och odlas i fuktiga och varma miljön i en inkubator. Det är lätt maskinbearbetbart, vilket möjliggör en mängd olika geometrier och antal prover som skall lastas samtidigtly.
Sammanfattningsvis möjliggör nya biaxial lastning bioreaktor för tissue engineering långsiktig odling in vitro av vävnadstekniska konstruktioner. Biaxial belastning ökade proteoglykan och kollagen nedfall och tjockleken på vävnadstekniska brosk prover men verkade inte märkbart påverka de mekaniska egenskaperna hos manipulerade brosk som vi antog. Enaxlig kompression ökade både proteoglycan nedfall och Youngs modul. Vi tror att den optimala dosen av mekanisk belastning varierar med cell och egenskaper vävnad. Framtida studier av kollagen arkitektur och dosimetri lastningen kommer att tillåta oss att fullt ut bedöma effekterna av biaxial belastning på utvecklingen av tekniska vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Office of Research and Development, RR & D service, US Department of Veterans Affairs, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 och försvarsdepartementet W81XWH-10-1-0643.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM, High glucose, pyruvate | Invitrogen | 11995 | |
| Agarose Type II | Sigma | CAS 39346-81-1 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine 100X | Invitrogen | 10378-016 | |
| ITS+ Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| Pen Strep Glutamine | Invitrogen | 10378-016 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 041-95780 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-2218 | |
| Nonessential Amino Acid Solution 100x | Sigma | M-7145 | |
| L-proline | Sigma | P-5607 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-2915 | |
| Recombinant Human Transforming Growth Factor β1 | R&D Systems | 240-B-010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Model 31 Load Cell (1000 g) | Honeywell | AL311 | |
| Single Channel Display | Honeywell | SC500 | |
| 50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator | Thorlabs | LNR50SE/M | |
| Two Channel Stepper Motor Controller | Thorlabs | BSC102 | |
| 50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2) | Thorlabs | DRV014 | |
| Adjustable Kinematic Locator (4) | Thorlabs | KL02 | |
| Precision Right Angle Plate | Thorlabs | AP90/M | |
| Vertical Mounting Bracket | Thorlabs | LNR50P2/M | |
| Solid Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB3030/M | |
| Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates | BioRad | #1653312 and #1653310 | |
| Disposable Biopsy Punch, 5 mm | Miltex, Inc. | 33-35 | |
| 16 mm hollow punch | Neiko Tools | ||
| Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom | BD Biosciences | 351147 | |
| Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens | McMaster-Carr | 86735k19 | Custom-machined |
References
- Drachman, D. B., Sokoloff, L. The role of movement in embryonic joint development. Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).
- Gooch, K. J., et al. Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage. Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).
- Carver, S. E., Heath, C. A. Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure. Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).
- Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants. J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).
- Wagner, D. R., et al. Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium. Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).
- Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading. Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).
- Rubin, C., Xu, G., Judex, S. The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli. FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).
- Wimmer, M. A., et al. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage. Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).
- Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading. J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).
- Heiner, A. D., Martin, J. A. Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system. J. Biomech. 37, 689-695 (2004).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).
- Bian, L., et al. Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes. Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).
- Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815 (2011).
- Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading. Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).
- Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage. Biorheology. 40, 331-336 (2003).
- Grad, S., et al. Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds. Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).
- Schatti, O., et al. A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).
