Summary
Это исследование описывает эффективный способ изолировать и обработки тканей десны от мыши полости рта с целью получения одной клеточной культуры. Полученные клетки могут быть использованы для дальнейшего анализа потока цитометрии и молекулярных исследований.
Abstract
Мы разработали методику точно изолировать и обрабатывать мышиные десневой ткани для проточной цитометрии и молекулярных исследований. Десны является уникальным и важным ткани для изучения иммунных механизмов, поскольку он участвует в иммунный ответ против оральный биопленки, которые могут вызывать заболевания периодонта. Кроме того, в непосредственной близости от десны к альвеолярной костной ткани позволяет также изучение костного ремоделирования при воспалительных процессах. Наш метод дает большое количество иммунных клеток, что позволяет анализировать даже редкие популяции клеток, таких как клетки Лангерганса и Т-регуляторные клетки как мы показали ранее 1. Используя мышей для изучения местных иммунных реакций, участвующих в потеря альвеолярной кости при заболеваниях пародонта является выгодной из-за наличия различных иммунологических и экспериментальных средств. Тем не менее, из-за их малого размера и сравнительно неудобным доступ к мышиным десны, многие исследования избежать рассмотрение эту темус критической ткани. Метод, описанный в этой работе могли бы способствовать анализу десен, которые, будем надеяться увеличить наши занижение на устном иммунной системы и ее роль во время заболевания пародонта.
Introduction
Десны мягких тканей, окружающих шейном отделе зубы и покрывает альвеолярного отростка (рис. 1). Десны является одним из видов жевательной слизистой, которые могут быть далее разделены на эпителий слизистой оболочки и соединительной ткани (также известный как подслизистой или собственной пластинке слизистой оболочки). Анатомическое строение десны и соседних зубов позволяет бактериям жить и развиваться налета (биопленки), которые постоянно бросает вызов местной иммунной системы. В результате воспалительной реакции развивается в десне, которая в некоторых случаях становится разрушительной - состояние называется заболеваний пародонта 2. В основном, бляшка индуцированного периодонтальной патологии можно разделить на гингивит и периодонтит. Гингивит представляет собой обратимое состояние местной воспалительной реакции, которая приурочена к десне. Периодонтит, с другой стороны, является необратимым деструктивный процесс, в котором крепление аппарат (альвеолярной кости, периодонтальноесвязки, цемента и десной) разрушается 3.
Десны было предложено служить как эффекторные и индуктивных сайтов во время заболевания пародонта 4. Человека исследования показали, что в ответ на зубной налет, иммунные эффекторные клетки и молекулы динамически проникли или отправления десны 5-7. Данное мероприятие было показано, играют важную роль в разрушении пародонта 8,9. Принимая во внимание данные, полученные в этих исследованиях содержится ценная информация относительно этого патологического процесса, работа с тканями человека обладают основных этических, технических и экспериментальных ограничений. Развитие экспериментальной модели позволило причинно-следственных экспериментов с помощью использованием трансгенных мышей и в естественных вмешательства 10. В результате, наши знания о механизмах, участвующих в пародонтозом значительно увеличилось в течение последних двух десятилетий. Тем не менее, из-за сложности заболеваний пародонта, существуетПродолжается дискуссия о природе местного иммунного ответа содействие разрушению ткани. Существует также отсутствие в нашем понимании на функции центральных иммунных клеток в десны при заболеваниях пародонта. Таким образом, важно, чтобы изучить патологических воспалительных реакций, происходящих в ткани-мишени заболевания, десны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Подготовьте заранее:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS с 2 мг / мл коллагеназы типа II и 1 мг / мл ДНКазы I типа (1 мл на образец)
- Стерилизованные хирургические инструменты
- 0,5 М раствора ЭДТА
1. Верхние десны Техника иссечение
- Усыпить мышей с использованием утвержденных IACUC руководства.
- Вырежьте обе стороны полости рта включая щеки и нижней челюсти ветви с острым / тупым прямыми ножницами.
- Опустите нижнюю челюсть.
- Разрежьте мягких и твердых тканей в воображаемой линии 1 мм за третий моляры со стандартными ножницами. Направляйте ножницы перпендикулярно плоскости небной кости (рис. 2А, синие линии).
- Надрезать мягких и твердых тканей 2 мм за резцами (рис. 2А, синие линии).
- Потяните вниз передней части рта. Носовая полость наблюдается после этого шага.
- Поместите ножницыпараллельно небу, положить одним лезвием в полость носа, другой лезвие должно надрезать в вестибюль. Вырезать не до заднего разреза (рис. 2А, зеленые линии). Повторите этот шаг, на обеих сторонах верхней челюсти. В конце верхней челюсти отделяется от остальной части черепа (фиг. 2В).
- Снимите верхнюю челюсть, вырезать его в середину шва (рис. 2, черная пунктирная линия) и обрезки ткани небных каждого Hemi-верхней челюсти, пока не достигая альвеолярной кости.
- Пил тканях десны (как Hemi-челюстных костей) с их передней границе с Адсона щипцов (без зубов).
- Поместите вырезали десну в тарелку с PBS + 2% FCS.
2. Обработка десен
- Поместите вырезали десны в чашке для культуры ткани (35 х 10 мм) с 1 мл PBS + 2% FCS, 2 мг / мл коллагеназы типа II и 1 мг / мл ДНКазы типа I.
- Фарш хорошо тканей с N ° 15 стерильные хирургические лезвия.
- Трansfer ткани от пластины до 15 мл коническую пробирку.
- Промыть ткань / клетки, оставшиеся на пластине с 1 мл PBS + 2% FCS и передачи в той же пробирке.
- Выдержите в шейкере инкубаторе в течение 20 мин при 37 ° C, 200 оборотов в минуту (рекомендация: Разогреть инкубатор).
- Добавить 20 мкл 0,5 М ЭДТА и инкубировали в течение еще 10 мин при 37 ° С, 200 об.
- Заполните пробирку до 12 мл PBS + 2% FCS и центрифугируют при 4 ° С, 400 мкг в течение 8 мин (рекомендуется предварительно холод центрифуги).
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток с 2 мл PBS + 2% FCS.
- Фильтр образца с 70 мкм клетки-фильтр и сохранить поток через.
- Центрифуга при 4 ° С, 320 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл PBS + 2% FCS.
- Граф клеток (примерно 5-10 х 10 5 клеток, как ожидается, с одной челюсти).
3. Внеклеточного и внутриклеточного антителаОкрашивание на цитометрическим анализом
Рекомендуется для работы внутри капюшоном, с выключенным светом. Очень важно, чтобы сохранить клетки в постоянном холодной окружающей среде, а также все необходимые материалы.
- Пятно клетки от внеклеточных молекул добавлением 0,2-0,5 мкг каждого выбранного антитела на 1 × 10 6 клеток в общем объеме 100 мкл.
- Vortex кратко.
- Инкубировать пробирки в течение 15 мин в темноте при 4 ° С.
- Мытье клеток с 2 мл PBS + 2% FCS.
- Центрифуга при 4 ° С, 320 х г в течение 5 мин.
- Супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления, по каплям 500 мкл холодного Cytoperm BD / Cytofix при встряхивании.
- Инкубировать пробирки в течение 40 мин при 4 ° С в темноте.
- Vortex кратко.
- Вымойте клетки дважды 1 мл холодной BD Пермь / промывочного буфера и спина при 800 мкг в течение 7 мин при 4 ° C.
- Супернатант за исключением 300 мкл.
- Пятно клетки внутриклеточнодобавлением 1 мкг каждого выбранного антитела на 1 × 10 6 клеток в общем объеме 100 мкл.
- Vortex кратко.
- Выдержите в течение 30 минут в темноте при 4 ° C.
- Вымойте клетки дважды 1 мл холодной BD Пермь / промывочного буфера и спина при 800 мкг в течение 7 мин при 4 ° C.
- Супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления 300 мкл холодного BD Пермь / промывочного буфера.
- Vortex кратко.
- Передача подвески, что фильтрация FACS труб.
- Держите труб в темном и холодном месте, пока анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Примеры проточной цитометрии анализа на десневой клетки представлены. Десен клетки, собранные от 2 мышей проводили в проточной цитометрии LSR II и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo. 3А продемонстрировано распределение десны клетки от наивных мышей в сторону рассеяния (SSC) против прямого рассеяния (FSC) сюжет. Память стратегию для выявления (I), лимфоциты (II), моноциты / дендритных клеток и (III), гранулоциты указано. Для сравнения цели, мы также представляем FACS график, иллюстрирующий десневой клетки очищают от P. gingivalis инфицированных мышей 21 дней после желудочного зонда в условиях экспериментального пародонтита как мы описано ранее (рис. 3В). Увеличение различных иммунных клеточных популяций могут быть легко обнаружены в инфицированных мышей по сравнению с наивных мышей. Далее, мы определяем иммунных клеток в обработанных десны по стробирования на клетках, экспрессирующих маркер гемопоэтических CD45 (Фиг.4А). T Hese клетки далее подразделены на CD3-позитивных клеток представляют Т-клетки (рис. 4В). Мы также определили десен нейтрофилов в соответствии с экспрессией CD11b и Ly6G молекул (фиг.4С). Наконец, клетки Лангерганса, эпителиальные подмножество дендритные клетки (ДК), были определены стробирования на МНС класс II + CD11c + клеток (маркер мышиных ДК) и выражение Ep-CAM и langerin/CD207 (внутриклеточного окрашивания) (рис. 4D).
Рисунок 1. Схематическая диаграмма, показывающая анатомических ориентиров на десну.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схематическое изображение мыши полости рта в результате После завершения этапа 1.3 мягких тканей от задней к передней:. Жевательных мышц (MM), мягкого неба (SP), твердого неба (HP), десны (G). Твердых тканей: моляров и резцов. Основной целью этой техники заключается в изоляции десневой ткани, которая окружает три моляров (внутри черный овал).
Рисунок 3. Представитель FACS участков демонстрируя клеточное распределение десны лейкоцитов. Обработанные образцы десны проводили на проточной цитометрии LSR II и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo. Бокового рассеяния (SSC) против прямого рассеяния (FSC) участков десневого клетки (А) наивных мышей или (B) воспаленные десны являются давлениемподарил. Расположение (я) лимфоцитов (II), моноциты / дендритных клеток и (III), гранулоциты популяции указано.
Рисунок 4. Представитель FACS участков демонстрирует анализ иммунного десен клеток. (A) Иммунные клетки идентифицировали по экспрессии CD45. После стробирования на CD45-положительных клеток и лимфоцитов населения экспрессию CD3 позволило ориентации Т-клеток подмножества. (B) Нейтрофилы были определены в десне согласно способность CD45 +-клеток также выразить Ly6G и CD11b. (C) Дендритные клетки были определены стробирования на CD45 + клеток из моноцитов / дендритных населения [Рисунок 3, ворота (II)], а затем на МНС класса II и CD11c положительных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maxilla тканей десны, полученные из одной мыши достаточны для анализа субпопуляции Т-и В-лимфоцитов, а также их способность выразить внеклеточных и внутриклеточных молекул, как мы ранее описанных 1. Тем не менее, если редких клеточных популяций представляют интерес (например, ДК), рекомендуется объединить ткани от 2-3 мышей. Следует отметить, что если предпочтительнее, можно очистить и небной и тканей десны, а затем вырезать десны (модификация шагом 1,8-1,9). Следует также отметить, что десны нижней челюсти могут быть собраны, а, тем не менее, его изоляции является более сложным и может включать другие ткани, которые могут помешать анализу.
Общие методы для изучения иммунных клеток в десны являются иммуногистохимии и иммунофлуоресценции. Эти методы позволяют визуализировать распределение молекулы-мишени / клетку через десны, и скрининг многочисленные поляТребуется с целью изучения определенной области. В то время как физиологический локализации определенные клетки не могут быть определены с помощью проточной цитометрии из-за десен обработки, этот подход обеспечивает несколько преимуществ: (1) проточной цитометрии это быстрый и простой способ анализа большого количества клеток (2) снижает анализа ошибки возникают из ткани неоднородности (3) она позволяет анализ редких клеточных популяций (4) позволяет одновременно анализ различных показателей (5) она позволяет дискриминации между живых и мертвых клеток (6) она позволяет функциональный анализ полученных клеток.
Способность выполнять проточной цитометрии анализа тканей десны при экспериментальном заболеваний пародонта увеличивает нашу способность выявить иммунологические механизмы, участвующие в этом процессе. Продольные изучение клеточных изменений, что происходит в экспозиции десны следующее патогенов ротовой полости должна обеспечить более уместную информацию, а не измерения иммунных реакций сystemically. Этот аспект имеет особое значение при анализе фенотип и кинетика врожденного и адаптивного воспалительных клеток в воспаленных десен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами от Израиля научного фонда (№ 1418/11) и в АНН (№ 1933/12), чтобы AW, немецкий Израильского фонда для молодых исследователей (GIF младших) Ах, и д-р я . Cabakoff благотворительный фонд исследований в Еврейском университете Хадасса школы зубоврачебной медицины в АНН и AW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
