Summary
本研究中描述了一种有效的技术，用于隔离和处理，以产生一个单一的细胞培养的小鼠口腔牙龈组织。得到的细胞可进一步用于流式细胞分析和分子水平的研究。
Abstract
我们已经开发出一种技术，能够精确地隔离和处理流式细胞术及分子生物学研究的小鼠牙龈组织。牙龈是一个独特而重要的组织来研究，因为它是免疫机制参与宿主的免疫反应，可能会导致牙周疾病对口腔生物膜。此外，靠近牙龈牙槽骨组织，也能学习骨重塑炎症条件下。我们的方法会产生大量的免疫细胞，允许甚至罕见的细胞群，如朗格汉斯细胞和调节性T细胞的分析，为大家展示了以前1。用人小鼠研究参与齿槽骨丧失在牙周疾病的局部免疫反应是有利的，因为各种免疫学和实验工具的可用性。然而，由于其体积小，小鼠牙龈相对交通不便，许多研究避免氏检查关键组织。在这项工作中所描述的方法可促进牙龈的分析，希望将增加我们在牙周疾病的口服免疫系统，它的作用低估。
Introduction
牙龈是宫颈部的牙齿周围的软组织和覆盖肺泡的过程（ 图1）。齿龈是一种咀嚼粘膜，粘膜上皮和结缔组织（也被称为粘膜下层或固有层），并且可以进一步分离成不同的。牙龈和牙齿相邻的解剖结构，使细菌居住和发展斑块（生物膜）局部免疫系统，不断挑战。其结果是，炎症反应的发展的牙龈，这在某些情况下变得有破坏性的-这种情况称为牙周疾病2。基本上可分为牙龈炎和牙周炎，牙斑引起的牙周病理学。牙龈炎局限于牙龈的局部炎症反应是一个可逆的条件。牙周炎，在另一方面，是一种不可逆的破坏过程，其中所述附接装置（牙槽骨，牙周韧带，牙骨质和牙龈）被摧毁3。
牙龈提出服务效应和感性的网站，在牙周疾病4。人类的研究表明，在应对牙菌斑，免疫效应细胞和分子动态渗透或出发的牙龈5-7。这项活动被证明发挥了重要作用，在牙周破坏8,9。鉴于这些研究提供了有价值的信息，关于这个病理过程，与人体组织所产生的数据具有重大的伦理，技术和实验的局限性。开发实验模型允许因果experimentations通过采用转基因小鼠体内干预10。因此，我们的知识在牙周疾病所涉及的机制大大增加，在过去的二十年。即便如此，由于牙周疾病的复杂性，有正在进行的辩论，关于促进组织破坏局部免疫反应的性质。还有一个在我们的理解缺乏牙龈牙周疾病的中枢免疫细胞的功能。因此，必须研究病理在靶组织的疾病，牙龈炎症发生的事件。
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Protocol
提前准备：
- PBS + 2％FCS
- PBS + 2％FCS与胶原酶II型和1毫克/毫升的DNA酶I型（1毫升，每样2毫克/毫升）
- 消毒手术器械
- 0.5 M EDTA溶液
1。上牙龈切除技术
- 安乐死小鼠使用批准IACUC指导。
- 切口腔两侧脸颊和下颌支与锐/钝直剪刀。
- 拉下颌骨。
- 切割软硬组织在一个假想的线1毫米标准剪刀三分之二磨牙后面。直接剪刀垂直于腭骨的平面内（ 图2A中 ，蓝色的线）。
- 切开软，硬组织2毫米背后的门牙（ 图2A，蓝色的线）。
- 拉下嘴的前部。此步骤之后，可观察的鼻腔。
- 将剪刀与上腭平行，把一个刀片进入鼻腔，其他刀片切开前庭。切，直到后切口（ 图2A，绿线）。上颌骨两侧，重复此步骤。在结束上颌骨脱离颅骨的其余部分（ 图2B）。
- 取下颌骨，切在中间缝合（ 图2，黑色虚线），直到达到牙槽骨修剪每个半侧颌骨的腭组织。
- 剥离牙龈组织（半侧颌骨）从他们的前缘阿德森钳（无齿）。
- 将切除牙龈用PBS + 2％FCS一盘。
2。牙龈处理
- 将切下的牙龈组织培养皿（35×10毫米），用1ml PBS + 2％FCS，2毫克/毫升胶原酶II型和1毫克/毫升DNA酶I型
- 百果组织的N°15无菌手术刀片。
- 风帆ansfer组织从板到15毫升锥形试管中。
- 盘上剩余的组织/细胞洗净，用1ml PBS +2％FCS中，转移到相同的试管。
- 在摇床培养箱孵育20分钟，37℃，200转（建议：预热孵化）。
- 加入20微升0.5 M EDTA和孵化，再过10分钟，在37°C，200转。
- 在试管至12毫升，用PBS + 2％FCS和离心机在4°C，400 XG 8分钟（建议：预冷离心机）。
- 取出上清，重悬细胞2毫升PBS + 2％FCS。
- 70微米的细胞过滤器和过滤器样品，节省流量通过。
- 离心机在4℃，320×g离心5分钟。
- 上清，重悬细胞取出300微升PBS + 2％FCS。
- 计数细胞（约5×10 5细胞从一个单一的上颌骨）预期。
3。细胞外和细胞内抗体染色流式细胞仪分析
建议里面工作引擎盖，灯熄灭。这是至关重要的，以保持细胞在恒冷的环境中，以及所需的所有材料。
- 每1×10 6个细胞的总体积为100μl，加入0.2-0.5微克每个选定的抗体染色的细胞对细胞外分子。
- 涡简要介绍。
- 孵育15分钟，在黑暗中在4℃下在管
- 洗涤细胞2毫升PBS + 2％FCS。
- 离心机在4℃，320×g离心5分钟。
- 吸上清，重悬细胞，加入，逐滴，500微升冷BD Cytoperm / Cytofix的而震荡。
- 孵育40分钟，在4℃下在黑暗中管。
- 涡简要介绍。
- 洗涤细胞两次与1毫升冷BD烫发/洗涤缓冲和自旋在800 XG 7分钟在4°C。
- 吸上清液300μl的除外。
- 细胞染色细胞每个选定的抗体加入1微克每1×10 6个细胞在总体积为100μl。
- 涡简要介绍。
- 在4℃下孵育30分钟，在黑暗
- 洗涤细胞两次与1毫升冷BD烫发/洗涤缓冲和自旋在800 XG 7分钟在4°C。
- 吸上清，重悬细胞，加入300μL冷BD的彼尔姆/洗涤缓冲液。
- 涡简要介绍。
- 暂停转移，同时过滤FACS管。
- 保持管在黑暗和寒冷的环境中，直到分析。
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Representative Results
作为对牙龈细胞的流式细胞仪分析。汇集从2小鼠牙龈细胞运行在一个LSR II流式细胞仪，使用FlowJo软件分析表明牙龈细胞的分布图3A从一个侧面散射（SSC）与前向散射（FSC）情节天真的小鼠。选通策略，以确定（一）淋巴细胞（ⅱ）单核细胞/树突状细胞，粒细胞及（iii）表示。比较而言，我们还提出了流式细胞仪示出了牙龈细胞纯化P.牙龈卟啉单胞菌感染小鼠灌胃后21天在一个设定的，因为我们前面描述的实验性牙周炎（ 图3B）。天真的小鼠相比，可以容易地检测各种免疫的细胞群增加受感染的小鼠。接下来，我们确定在处理由门牙龈的免疫细胞对细胞表达造血标记CD45（ 图4A）。 Ť备有相应的定义组态细胞进一步划分为CD3阳性细胞占T细胞（ 图4B）。我们还确定了牙龈的嗜中性粒细胞，根据Ly6G表达和CD11b分子（ 图4C）。最后，由门上的MHC II类的CD11c +细胞（标记的鼠DCs），和表达的Ep-CAM和langerin/CD207（细胞内染色）（ 图朗格汉斯细胞，上皮细胞的树突状细胞（DC）的子集，被确定4D）。
图1。示意图的牙龈解剖标志。
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图2。步骤1.3完成后的示意图小鼠口腔软组织从后面到前面：咬肌（MM），软腭（SP），（HP）硬腭，牙龈（G）。硬组织：臼齿和门齿。这种技术的主要目的是隔离的牙龈组织，围绕三个臼齿（里面的黑色椭圆形）。
图3。代表FACS地块牙龈加工样品展示细胞牙龈白细胞分布。LSR II流式细胞仪上运行，并使用FlowJo软件分析。侧散射（SSC）与前向散射（FSC）地块（A）天真的小鼠或（B）牙龈发炎的牙龈细胞压力ented。的位置（一）淋巴细胞（ⅱ）单核细胞/树突状细胞，及（iii）粒细胞种群表示。
图4。 （A）代表FACS地块展示分析免疫牙龈细胞。免疫细胞进行鉴定，根据CD45的表达。选通后的CD45阳性细胞和淋巴细胞人口，表达的CD3启用目标的T细胞亚群（B）的嗜中性粒细胞的CD45 +细胞的能力确定的所述齿龈表达也Ly6G和CD11b（C）的树突状细胞确定门对CD45 +细胞的单核细胞/树突状人口[ 图3，栅极（ⅱ）]，然后在MHC II类和CD11c阳性细胞。
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Discussion
颌骨牙龈组织从一个单一的鼠标得到足够的用于分析的T和B淋巴细胞的子种群，以及他们的能力，表达细胞外和细胞内的分子，如我们之前描述1。然而，如果还罕见的细胞种群（例如区议会），它是建议到池组织从2-3只小鼠。值得注意的是，如果优选的话，它有可能剥离腭和牙龈组织，然后切除牙龈（修改步骤1.8-1.9）。还应该提到，下颌牙龈，以及可以收集的是，它的隔离是更复杂的，并且可能包括其它组织中，可能会干扰分析。
共同的技术来研究免疫细胞在牙龈免疫组化和免疫。这些技术可以通过牙龈目标分子/细胞的分布可视化，筛选许多现场s需要为了研究目标区域。鉴于某些细胞生理本地化可以不被确定流仪由于牙龈处理，这种方法提供了其他一些优点：（1）流式细胞仪是一个快速和简单的方法，分析大量的细胞（2）它可以减少分析错误起源从组织的异质性（3）（4）它允许同时分析各种变量（5），它可以区分活的和死细胞（6），它可导致细胞功能分析，使罕见的细胞群的分析。
在实验性牙周疾病在牙龈组织进行流式细胞仪分析的能力，提高我们的能力，揭示在这个过程中涉及的免疫机制。纵向研究免疫反应细胞的变化，发生在口腔的致病菌牙龈暴露后，应提供更多的相关信息，而不是测量小号ystemically。这一方面是牙龈发炎的先天免疫和适应性的炎性细胞的表型和动力学分析时尤为重要。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
该研究得到了补助，以色列科学基金会（第1418/11号）AHH（第1933/12号）AW，年轻的研究者（GIF年轻）的德国以色列基金会AHH，我博士希伯来大学哈达萨学校的牙科医学AHH和AW Cabakoff研究基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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