Summary
この研究は、単一細胞培養を生成するために、マウス口腔から歯肉組織を分離して処理するための効率的な手法が記載されている。得られた細胞をさらにフローサイトメトリー分析および分子生物学的研究のために使用することができる。
Abstract
我々は正確にフローサイトメトリーや分子の研究のためにネズミ歯肉組織を分離して処理するための技術を開発した。歯肉は、それが歯周病の原因となることがあり、口腔バイオフィルムに対する宿主免疫応答に関与しているため、免疫機構を研究するためのユニークで重要な組織である。さらに、歯槽骨組織への歯肉のすぐ近くには、炎症性の条件下で骨リモデリングを勉強できます。本手法は、我々は以前に1を示したようなランゲルハンス細胞およびT調節細胞でさえ希少細胞集団の分析を可能にする免疫細胞を大量に得られる。歯周病の間に歯槽骨の損失に関わる局所免疫応答を研究するためにマウスを採用するため、様々な免疫学的および実験的なツールの利用可能性に有利である。それにもかかわらず、彼らの小さなサイズとネズミ歯肉に比較的不便なアクセスによる、多くの研究は、THIの検査を避けたの重要な組織。この作品に記載された方法がうまくいけば、歯周病の間に私達の経口免疫システムに過小とその役割が大きくなり歯肉分析を容易にすることができます。
Introduction
歯肉は、歯頸部の周囲の軟部組織である歯槽プロセス（ 図1）をカバーしています。歯肉はさらに、粘膜上皮と結合組織（また、粘膜または粘膜固有層とも呼ばれる）に分けることができる咀嚼粘膜の一種である。歯肉と隣接する歯の解剖学的構造は、細菌が常にローカル免疫系に挑戦プラーク（バイオフィルム）が存在し、開発することができます。結果として、炎症反応は、特定の状況では破壊的になる歯肉に発症-条件は、歯周病2と呼ば。基本的には、歯垢誘発性歯周病態は、歯肉炎と歯周炎に分けることができます。歯肉炎は歯肉に限定されている地元の炎症反応の可逆的な状態を表しています。歯周炎、その一方で、不可逆的な破壊的なプロセスである取付装置（歯槽骨、歯周靭帯、セメント質と歯肉）は3を破壊している。
歯肉は歯周病4時などのエフェクターや誘導サイトの両方を提供することを提案した。ヒトでの研究は、歯垢に対応して、免疫エフェクター細胞および分子が動的に浸潤または出発歯肉5-7を示唆している。この活性は、歯周破壊8,9において主要な役割を果たすことが示された。ヒト組織と協力し、この病理学的過程に関する貴重な情報を提供し、それらの研究によって生成されたデータは、主要な、倫理的、技術的、実験的な限界を持っているのに対し。トランスジェニックマウスを用いてビアおよびin vivoでの介入10因果実験法を許可した実験モデルの開発。その結果、歯周病に関与するメカニズムに関する我々の知識は、最後の二十年の間に大幅に増加した。そうであっても、歯周病の複雑さに起因がある組織破壊を促進する局所免疫応答の性質に関する進行中の議論。歯周病の間の歯肉の中心的な免疫細胞の機能に関する我々の理解に不足があります。それは病気、歯肉の標的組織で発生する病理学的炎症事象を研究することが不可欠です。
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Protocol
事前に準備します。
- PBS + 2％FCS
- コラゲナーゼタイプIIおよびDNアーゼタイプIの1 mg / mlの（サンプル当たり1ミリリットル）の2 mg / mlのとPBS + 2％FCS
- 滅菌手術器具
- 0.5 M EDTA溶液
1。アッパー歯肉切除テクニック
- 承認された動物実験委員会のガイダンスを使用して、マウスを安楽死させる。
- 頬と鈍い/鋭いストレートハサミで下顎枝含む口腔の両側をカットします。
- 下顎骨をプルダウン。
- 標準ハサミで三分の臼歯の後ろに仮想線1ミリメートルでソフトとハードの組織を切り取る。はさみは口蓋骨の面（ 図2A、青い線）に垂直な演出。
- 前歯の後ろにソフトとハードの組織2ミリメートル（ 図2A、青い線）を切開。
- 口の前部をプルダウン。鼻腔は、この工程の後に観測される。
- はさみを置き口蓋と平行に、鼻腔内に1ブレードを入れて、他のブレードは前庭で切開する必要があります。後部切開（ 図2A、緑の線）までカットします。上顎の両側に、この手順を繰り返します。端部には上顎骨、頭蓋骨の残りの部分（ 図2B）から取り外される。
- 、上顎を削除ミドル縫合（ 図2、黒の破線）でそれをカットし、歯槽骨に達するまで、各半上顎の口蓋組織をトリミング。
- アドソン鉗子（歯なし）との前縁から歯肉組織（両方半上顎）をはがします。
- PBS + 2％FCSとプレートに切除歯肉を置きます。
2。歯肉処理
- 1mlのPBSで組織培養皿（35×10㎜）で切除歯肉を入れ+ 2％FCS、コラゲナーゼタイプIIとタイプDNアーゼIの1 mg / mlの2 mg / mlの
- N°15無菌手術用ブレードとよく組織をミンチ。
- TRプレートで15 mlコニカル試験管に組織をansfer。
- 1mlのPBS + 2％FCSと同じ試験管に移すと皿の上に残っている組織/細胞を洗浄。
- 37℃で20分間シェーカーインキュベーター内でインキュベート℃、200rpmで（推奨：予熱インキュベーター）。
- 37℃でさらに10分間℃、200rpmで、20 EDTA 0.5 Mの液とインキュベートを追加します。
- 12 PBS + 2％FCSとml及び4で遠心まで試験管を埋める°C、8分間400×gで（推奨：プレチル遠心分離機）。
- 2ミリリットルPBS + 2％FCSを上清と再懸濁した細胞を取り除きます。
- 70μmのセルストレーナーでサンプルをフィルタリングし、フロースルーを保存します。
- 4℃、5分間320×gで遠心。
- 300μlのPBS + 2％FCSを上清と再懸濁した細胞を取り除きます。
- 細胞（約5〜10×10 5個の細胞が単一の上顎から期待されている）カウント。
3。外および細胞内抗体フローサイトメトリー分析のための染色
それは、ライトをオフにして、ボンネット内部の作業をすることをお勧めします。それは一定の寒い環境で細胞を維持するだけでなく、必要に応じてすべての材料が重要です。
- 総容量100μl中に1×10 6個の細胞あたりそれぞれ選択された抗体の0.2〜0.5μgのを加えることによって細胞外分子に対して細胞を染色。
- 簡潔に渦。
- 4℃で暗所で15分間チューブをインキュベート
- 2ミリリットルPBS + 2％FCSで細胞を洗浄します。
- 4℃、5分間320×gで遠心。
- ボルテックスしながら追加して上清と再懸濁した細胞を吸引、賢い、500μlの冷たいBD Cytoperm / Cytofixドロップします。
- 4℃で40分間チューブをインキュベートし、暗所でC。
- 簡潔に渦。
- 1ミリリットル冷たいBDパーマで二回細胞を洗浄/ 4で7分間、800×gでバッファとスピンを洗う℃に
- 300μlのを除いて、上清を吸引除去する。
- によって細胞内に細胞を染色100μlの総体積で1×10 6個の細胞あたりそれぞれ選択された抗体1μgのを追加。
- 簡潔に渦。
- 4℃で暗所で30分間インキュベート
- 1ミリリットル冷たいBDパーマで二回細胞を洗浄/ 4で7分間、800×gでバッファとスピンを洗う℃に
- 300μlの冷たいBDパーマ/洗浄バッファを追加することで、上清と再懸濁した細胞を吸引。
- 簡潔に渦。
- FACSチューブにフィルタリングしながらサスペンションを移す。
- 分析まで暗くて寒い環境の中で管を保つ。
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Representative Results
歯肉細胞に対するフローサイトメトリー分析の例が示されている。 2匹のマウスからのプールされた歯肉細胞をLSR IIフローサイトメーターで実行され、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。 図3A側方散乱（SSC）対前方散乱（FSC）プロットにおけるナイーブマウスから歯肉細胞の分布を示した。識別するためのゲーティング戦略は、（i）リンパ球（ii）の単球/樹状細胞および（iii）顆粒が示される。比較のため、我々はまた、P.から精製歯肉細胞を示すFACSプロットを提示する我々は前述のようにバリス（ 図3B）21日実験的歯周炎の設定で強制経口投与した後、マウスに感染。ナイーブマウスと比較して、種々の免疫細胞集団の増加が容易に感染したマウスでは検出することができる。次に、我々は、造血マーカーCD45（ 図4A）を発現する細胞にゲーティングによって処理された歯肉の免疫細胞を同定する。 Tヘセ細胞はさらにT細胞（ 図4B）を表すCD3陽性細胞に分離。またLy6GとCD11bを分子の発現（ 図4C）によると歯肉好中球を同定した。最後に、ランゲルハンス細胞、樹状細胞（DC）の上皮サブセットは、MHCクラスII EP-CAMとlangerin/CD207の+のCD11c +細胞（マウスの樹状細胞のマーカー）と式（細胞内染色）（ 図でゲーによって同定された4D）。
図1。歯肉の解剖学的特徴を示す模式図。
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図2。ステップ1.3を完了した後に生じたマウス口腔の概略図で後ろから前への軟部組織が：。咬筋（MM）、軟口蓋（SP）、硬口蓋（HP）、歯肉（G）。硬組織：臼歯と切歯。この技術の主な目的は、3つの臼歯（黒楕円形の内側）取り囲む歯肉組織を単離することである。
図3。歯肉白血球の細胞分布を示す代表的なFACSプロット。加工歯肉サンプルはLSR IIフローサイトメーター上で実行され、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。側方散乱（SSC）対（A）ナイーブマウスまたは（B）炎症歯肉から歯肉細胞の前方散乱（FSC）のプロットは圧力である取得済み。 （i）のリンパ球（ii）の単球/樹状細胞および（iii）顆粒球集団の位置が示されている。
図4。歯肉免疫細胞の分析を示す代表的なFACSプロット。（）免疫細胞がCD45発現に従って同定した。 CD45陽性細胞およびリンパ球集団上で次のゲーティング、CD3の発現はT細胞サブセットを対象としたイネーブル。（B）好中球はまたLy6GとCD11bを表現するためのCD45 +細胞の能力に係る歯肉において同定された。（C）樹状細胞であった単球/樹集団からCD45 +細胞にゲートによって識別される[ 図3、ゲート（ⅱ）]を選択し、MHCクラスIIとのCD11c陽性細胞に関する。
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Discussion
単一のマウスから得られた上顎歯肉組織は、我々は以前に説明したように1外および細胞内の分子を発現するTリンパ球およびBリンパ球の亜集団、ならびにそれらの能力を分析するために十分である。希少細胞集団が興味（例えばDCの）である場合にもかかわらず、それは2-3マウスからプール組織に推奨されます。望ましい場合に注目すべきは、それが歯肉（ステップ1.8から1.9の変更）の両方口蓋および歯肉組織ピール、その後消費税にすることが可能です。また、下顎歯肉が同様に収集することができることが言及されるべきである、まだ、その分離はより複雑であり、分析に干渉する可能性のある他の組織を含むことができる。
歯肉の免疫細胞を研究するための一般的な技術は、免疫組織化学および免疫蛍光である。これらの技術は、歯肉を通して標的分子/細胞の分布の可視化を可能にし、多数のフィールドのスクリーニングsが特定の領域を研究するために必要とされる。特定の細胞の生理的局在を歯肉処理によるフローサイトメトリーによって決定することができないのに対し、このアプローチは、いくつかの他の利点を提供する：（1）フローサイトメトリー（2）は、解析エラーが発信低減する多数の細胞を分析するための迅速かつ簡単な方法である組織の不均一から（3）（4）それは生細胞と死細胞（6）との間の区別は、それが得られた細胞の機能解析を可能にすることができる（5）さまざまな変数の同時分析を可能にまれな細胞集団の分析を可能にする。
実験的歯周病の間に歯肉組織上のフローサイトメトリー分析を実行する能力は、このプロセスに関与する免疫学的メカニズムを明らかにするために我々の能力を向上させます。口腔病原体に対する歯肉暴露で起こる細胞の変化の勉強を縦ではなく、免疫応答の測定よりも多くの関連情報を提供する必要がありますystemically。炎症歯肉における自然免疫と適応性炎症性細胞の表現型および動力学を分析するとき、この態様では特に重要である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、イスラエル科学財団（番号1418から1411）からAHHと（番号1933から1912年）にAW、AHHに若い研究者のためのドイツのイスラエル財団（GIFヤング）、博士と私への補助金によって支えられてAHHとAWへの歯科医学のヘブライ大学 - ハダサスクールで。Cabakoff研究基金基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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