Summary
Este estudio describe una técnica eficiente para aislar y procesar los tejidos gingivales de la cavidad oral del ratón con el fin de producir un cultivo de una sola célula. Las células resultantes pueden ser utilizados además para el análisis de citometría de flujo y los estudios moleculares.
Abstract
Hemos desarrollado una técnica para aislar y procesar precisamente tejido gingival murino para citometría de flujo y los estudios moleculares. La encía es un tejido único e importante para estudiar los mecanismos inmunes, ya que está implicado en la respuesta inmune del huésped contra la biopelícula oral que podría causar enfermedades periodontales. Por otra parte, la estrecha proximidad de la encía al tejido óseo alveolar también permite el estudio de la remodelación ósea en condiciones inflamatorias. Nuestro método produce gran cantidad de células inmunes que permite el análisis de incluso poblaciones de células raras, tales como las células de Langerhans y células T reguladoras como hemos demostrado previamente 1. El empleo de los ratones para estudiar las respuestas inmunes locales implicadas en la pérdida de hueso alveolar durante enfermedades periodontales es ventajoso debido a la disponibilidad de diversas herramientas inmunológicas y experimental. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y el acceso relativamente inconveniente para la encía murino, muchos estudios evitarse examen de thitejido crítico s. El método descrito en este trabajo podría facilitar el análisis gingival, los que podrán aumentar nuestro subestimando sobre el sistema inmune oral y su papel durante las enfermedades periodontales.
Introduction
Encía es el tejido blando que rodea la porción cervical de los dientes y cubre el proceso alveolar (Figura 1). La encía es un tipo de la mucosa masticatoria que se puede separar más a fondo en epitelio de la mucosa y tejido conectivo (también conocido como submucosa o lámina propia). La estructura anatómica de la encía y los dientes adyacentes permite que las bacterias residen y desarrollan la placa (biopelícula) que desafía continuamente el sistema inmune local. Como resultado, la respuesta inflamatoria se desarrolla en la encía, lo que en ciertas circunstancias se convierte en destructivo - una condición denominada enfermedades periodontales 2. Básicamente, patologías periodontales inducidas por placa se pueden dividir en la gingivitis y la periodontitis. Gingivitis representa una condición reversible de la respuesta inflamatoria local que se limita a la encía. La periodontitis, en el otro lado, es un proceso destructivo irreversible en la cual el aparato de inserción (hueso alveolar, periodontalligamento, cemento y encía) se destruye 3.
La encía se propuso servir a los sitios, tanto como efectores e inductivo en enfermedades periodontales 4. Los estudios en humanos han sugerido que, en respuesta a la placa dental, células efectoras inmunes y las moléculas se infiltraron en la encía o de salida 5-7 dinámicamente. Esta actividad ha demostrado desempeñar un papel importante en la destrucción periodontal 8,9. Considerando que los datos generados por los estudios proporcionaron información valiosa con respecto a este proceso patológico, que trabaja con tejidos humanos poseen importantes limitaciones éticas, técnicas y experimentales. El desarrollo de modelos experimentales animales experimentos de causa-efecto mediante el empleo de ratones transgénicos y en las intervenciones in vivo 10. Como resultado, nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la enfermedad periodontal aumentó considerablemente durante las últimas dos décadas. Aún así, debido a la complejidad de las enfermedades periodontales, hayun debate sobre la naturaleza de la respuesta inmune local para facilitar la destrucción del tejido. Hay también una falta en nuestra comprensión de la función de las células inmunes centrales en la encía durante enfermedades periodontales. Es por lo tanto esencial para estudiar eventos inflamatorios patológicos que se producen en el tejido diana de la enfermedad, la encía.
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Protocol
Preparar de antemano:
- PBS + 2% de FCS
- PBS + 2% de FCS con 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNasa tipo I (1 ml por muestra)
- Instrumentos quirúrgicos esterilizados
- Solución de EDTA 0,5 M
1. Técnica de escisión gingival superior
- La eutanasia a los ratones con orientación IACUC aprobado.
- Corte ambos lados de la cavidad oral, incluyendo las mejillas y la línea de la mandíbula con rectas / romas tijeras rectas.
- Tire hacia abajo la mandíbula.
- Cortar los tejidos blandos y duros en una línea imaginaria 1 mm por detrás de los molares tercios con unas tijeras estándar. Dirigir las tijeras perpendiculares al plano del hueso palatino (Figura 2A, las líneas azules).
- Una incisión en los tejidos blandos y duros 2 mm por detrás de los incisivos (Figura 2A, las líneas azules).
- Tire hacia abajo la parte anterior de la boca. La cavidad nasal es observable después de este paso.
- Coloque las tijerasparalelo al paladar, puso una hoja en la cavidad nasal, la otra cuchilla debe incidir en el vestíbulo. Corte hasta que la incisión posterior (Figura 2A, línea verde). Repita este paso en ambos lados del maxilar. Al final del maxilar superior se separa del resto del cráneo (Figura 2B).
- Retire el maxilar, se corta en la sutura media (Figura 2, línea de trazos negro) y recortar el tejido palatino de cada hemi-maxilar hasta alcanzar el hueso alveolar.
- Pelar los tejidos gingivales (ambos hemi-maxilares) a partir de su borde anterior con Adson fórceps (sin dientes).
- Coloque la encía extirpado en una placa con PBS + 2% FCS.
2. Gingival Procesamiento
- Ponga la encía extirpado en una placa de cultivo de tejido (35 x 10 mm) con 1 ml de PBS + 2% de FCS, 2 mg / ml de colagenasa tipo II y 1 mg / ml de DNAsa I. Tipo
- Picar bien el tejido con una cuchilla de 15 ° N quirúrgico estéril.
- Transfer el tejido de la placa a un ml tubo de ensayo cónico de 15.
- Lavar las células de los tejidos / restantes en la placa con 1 ml de PBS + 2% de FCS y la transferencia al mismo tubo de ensayo.
- Incubar en un agitador incubador durante 20 min a 37 ° C, 200 rpm (recomendación: precalentar el incubador).
- Añadir 20 l de EDTA 0,5 M y se incuba durante otros 10 min a 37 ° C, 200 rpm.
- Llenar el tubo de ensayo hasta 12 ml con PBS + 2% de FCS y se centrifuga a 4 ° C, 400 xg durante 8 min (recomendación: pre-enfriamiento de la centrífuga).
- Retire las células sobrenadante y resuspender con 2 ml de PBS + 2% de FCS.
- Filtrar la muestra con una célula de 70 micras-colador y guardar el flujo a través.
- Se centrifuga a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
- Eliminar las células sobrenadante y resuspender con 300 l de PBS + 2% FCS.
- Contar las células (células de aproximadamente 5-10 x 10 5 Se espera que a partir de un solo maxilar).
3. Anticuerpo extracelulares e intracelularesLa tinción para el Análisis de Citometría de Flujo
Se recomienda para trabajar dentro de una campana, con las luces apagadas. Es crítico para mantener las células en ambiente frío constante, así como todos los materiales necesarios.
- Mancha de las células contra moléculas extracelulares mediante la adición de 0,2-0,5 g de cada anticuerpo seleccionado por 1 x 10 6 células en un volumen total de 100 l.
- Brevemente Vortex.
- Incubar los tubos durante 15 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar las células con 2 ml de PBS + 2% FCS.
- Se centrifuga a 4 ° C, 320 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo, gota a gota, 500 l BD frío Cytoperm / Cytofix mientras vórtice.
- Incubar los tubos durante 40 min a 4 ° C en la oscuridad.
- Brevemente Vortex.
- Lavar las células dos veces con 1 ml frío BD Perm / Tampón de lavado y centrifugado a 800 g durante 7 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante con excepción de 300 l.
- Mancha de células intracelularmente porla adición de 1 g de cada anticuerpo seleccionado por 1 x 10 6 células en un volumen total de 100 l.
- Brevemente Vortex.
- Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con 1 ml frío BD Perm / Tampón de lavado y centrifugado a 800 g durante 7 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo 300 l BD Perm / Wash Buffer frío.
- Brevemente Vortex.
- Transferir la suspensión mientras se filtra a tubos de FACS.
- Mantener los tubos en un lugar oscuro y frío hasta su análisis.
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Representative Results
Se presentan ejemplos de análisis de citometría de flujo en células de la encía. Células gingivales agrupados a partir de 2 ratones se llevaron a cabo en un citómetro de flujo LSR II y analizados utilizando el software FlowJo. Figura 3A demostraron la distribución de células de la encía de los ratones no tratados previamente en una dispersión lateral (SSC) frente a dispersión trama hacia adelante (FSC). Estrategia de apertura de puerta para identificar (i) linfocitos (ii) los monocitos / células dendríticas y (iii) los granulocitos está indicado. Para fines de comparación, también presentamos un gráfico que ilustra FACS células gingivales purificadas de P. gingivalis infectado ratones 21 días después de sonda oral en un entorno de la periodontitis experimental como hemos descrito anteriormente (Figura 3B). Un aumento en las diversas poblaciones de células inmunes puede ser fácilmente detectado en los ratones infectados en comparación con ratones no tratados previamente. A continuación, se identifican las células inmunes en la encía procesado por gating sobre las células que expresan el marcador hematopoyéticas CD45 (Figura 4A). T stos células segregan aún más en las células CD3-positivas que representan las células T (Figura 4B). También se identificaron los neutrófilos gingivales de acuerdo a la expresión de la Ly6G y moléculas de CD11b (Figura 4C). Por último, las células de Langerhans, un subconjunto epitelial de las células dendríticas (DCs), fueron identificados por gating en MHC de clase II + células CD11c + (un marcador de murino países en desarrollo) y la expresión de Ep-CAM y langerin/CD207 (tinción intracelular) (figura 4D).
Figura 1. Diagrama esquemático que muestra los puntos de referencia anatómicos de la encía.
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Figura 2. Vista esquemática del ratón cavidad oral resultante después de completar el paso 1.3 Los tejidos blandos de la parte posterior a la parte frontal:. Músculo masetero (MM), el paladar blando (SP), el paladar duro (HP), la encía (G). Tejido duro: molares e incisivos. El objetivo principal de esta técnica es para aislar el tejido gingival que rodea los tres molares (en el interior del óvalo negro).
Figura 3. Representante FACS gráficos que demuestran la distribución celular de los leucocitos gingivales. Gingivales muestras procesadas se ejecutaron en el citómetro de flujo LSR II y analizados utilizando software FlowJo. Dispersión (FSC) parcelas delanteros de las células de la encía de (a) los ratones no tratados previamente o (B) la encía inflamada dispersión lateral (SSC) frente son presentando. La ubicación de (i) los linfocitos (ii) los monocitos / células dendríticas y (iii) las poblaciones de granulocitos está indicado.
La Figura 4. FACS representativos gráficos que demuestran el análisis de células de la encía inmunes. (A) Las células inmunes se identificaron de acuerdo a la expresión CD45. Después de compuerta en las células CD45-positivas y la población de linfocitos, la expresión de CD3 habilitado focalización de células T subconjunto. (B) Los neutrófilos se identificaron en la encía de acuerdo a la capacidad de las células CD45 + para expresar también Ly6G y CD11b. (C) Las células dendríticas fueron identificado por gating en células CD45 + de la población de monocitos / dendríticas [Figura 3, la puerta (ii)], y luego en MHC de clase II y las células CD11c positivas.
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Discussion
Tejidos gingivales Maxilla obtenidos a partir de un solo ratón son suficientes para el análisis de subpoblaciones de linfocitos T y B, así como su capacidad para expresar moléculas extracelulares e intracelulares como hemos descrito anteriormente en 1. Sin embargo, si las poblaciones de células raras son de interés (por ejemplo, DC), se recomienda a los tejidos piscina 2-3 ratones. De nota, si así se prefiere, es posible despegar ambos los tejidos gingivales y palatales y luego a impuestos especiales, la encía (una modificación de la etapa 1.8 a 1.9). Se debe mencionar también que la encía mandibular puede ser recogido, así, todavía, su aislamiento es más complicado y puede incluir otros tejidos que puedan interferir con el análisis.
Las técnicas más comunes para estudiar las células inmunes en la encía son inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Estas técnicas permiten la visualización de la distribución de una molécula diana / célula a través de la encía, y la detección de numerosos campos se requiere con el fin de estudiar un área determinada. Considerando que la localización fisiológica de ciertas células no se puede determinar por citometría de flujo debido al procesamiento gingival, este enfoque proporciona varias otras ventajas: (1) la citometría de flujo es un método rápido y simple para analizar grandes números de células (2) que reduce los errores de análisis se originan de la heterogeneidad del tejido (3) que permite el análisis de poblaciones celulares raras (4) que permite el análisis simultáneo de diversas variables (5) que permite la discriminación entre células vivas y muertas (6) que permite el análisis funcional de las células resultantes.
La capacidad de realizar el análisis de citometría de flujo en los tejidos gingivales durante la enfermedad periodontal experimental mejora nuestra capacidad para revelar los mecanismos inmunológicos implicados en este proceso. El estudio longitudinal de los cambios celulares que se producen en la encía después de la exposición a los patógenos orales deben proporcionar información más relevante en lugar de medir la respuesta inmune systemically. Este aspecto es de particular importancia cuando se analiza el fenotipo y la cinética de las células inflamatorias innatas y adaptativas en encía inflamada.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Israel Science Foundation (No. 1418-1411) para AHH y (N º 1933/12) a AW, la Fundación Alemana de Israel para que los investigadores jóvenes (GIF joven) de AHH, y el Dr. I . Cabakoff Investigación Fondo de Dotación de la Escuela Hadassah de la Universidad de Medicina Dental de AHH y AW hebreo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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