Summary
Questo studio descrive una tecnica efficiente per isolare e processare tessuti gengivali dalla cavità orale topo per produrre una coltura cella singola. Le cellule risultanti possono essere ulteriormente utilizzati per l'analisi di citometria a flusso e studi molecolari.
Abstract
Abbiamo sviluppato una tecnica per isolare e processare murino tessuto gengivale per la citometria a flusso e studi molecolari con precisione. La gengiva è un tessuto unico e importante per studiare i meccanismi immunitari perché è coinvolto nella risposta immunitaria contro i biofilm orale che potrebbe causare malattie parodontali. Inoltre, la vicinanza della gengiva al tessuto osseo alveolare consente anche studiando rimodellamento osseo in condizioni infiammatorie. Il nostro metodo consente di ottenere grandi quantità di cellule del sistema immunitario che permette l'analisi anche di popolazioni di cellule rare, come le cellule di Langerhans e le cellule T regolatorie, come abbiamo dimostrato in precedenza 1. Impiegando i topi per studiare le risposte immunitarie locali coinvolti nella perdita di osso alveolare durante la malattia parodontale è vantaggioso a causa della disponibilità di vari strumenti immunologici e sperimentali. Tuttavia, a causa della loro piccola dimensione e l'accesso relativamente scomodo per la gengiva murino, molti studi evitati esame di this tessuto critico. Il metodo descritto in questo lavoro potrebbe facilitare l'analisi gengivale, che si spera di aumentare la nostra sottovalutare sul sistema immunitario orale e il suo ruolo durante le malattie parodontali.
Introduction
Gengiva è il tessuto molle che circonda la porzione cervicale dei denti e copre il processo alveolare (Figura 1). La gengiva è un tipo di mucosa masticatoria che può essere ulteriormente separato in epitelio mucoso e tessuto connettivo (noto anche come sottomucosa o lamina propria). La struttura anatomica della gengiva e denti adiacenti permette ai batteri di risiedere e sviluppare placche (biofilm) che sfida costantemente il sistema immunitario locale. Come risultato, risposta infiammatoria sviluppa nella gengiva, che in talune circostanze diventa distruttiva - una condizione nota come malattie periodontali 2. In sostanza, patologie parodontali placca indotte possono essere suddivisi in gengivite e parodontite. La gengivite rappresenta una condizione reversibile della risposta infiammatoria locale che si limita alla gengiva. Periodontite, d'altra parte, è un processo distruttivo irreversibile in cui l'apparato di attacco (osso alveolare, parodontalelegamento, cemento e gengiva) è distrutto 3.
La gengiva è stato proposto per servire siti sia come effettori e induttivi durante malattie parodontali 4. Studi sull'uomo hanno suggerito che in risposta alla placca dentale, le cellule immunitarie effettrici e le molecole infiltrate o di partenza la gengiva 5-7 dinamicamente. Questa attività ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nella distruzione parodontale 8,9. Considerando che i dati generati da questi studi hanno fornito informazioni importanti per quanto riguarda questo processo patologico, lavorando con i tessuti umani possiedono grandi limiti etici, tecnici e sperimentali. Lo sviluppo di modelli sperimentali animali sperimentazioni di causa-effetto con l'impiego topi transgenici e negli interventi in vivo 10. Come risultato, le nostre conoscenze sui meccanismi coinvolti nella malattia parodontale è aumentato notevolmente nel corso degli ultimi due decenni. Anche così, a causa della complessità delle malattie periodontali, c'èun dibattito in corso in merito alla natura della risposta immunitaria locale facilitando la distruzione dei tessuti. Vi è anche una mancanza nella nostra comprensione sulla funzione delle cellule immunitarie centrali nella gengiva durante malattie periodontali. E 'quindi essenziale studiare eventi infiammatori patologici che si verificano nel tessuto bersaglio della malattia, la gengiva.
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Protocol
Preparare in anticipo:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS con 2 mg / ml di collagenasi di tipo II e 1 mg / ml di DNAsi tipo I (1 ml per campione)
- Strumenti chirurgici sterilizzati
- 0,5 M soluzione di EDTA
1. Tomaia gengivale Tecnica escissione
- Euthanize topo, utilizzando una guida IACUC approvato.
- Tagliare entrambi i lati del cavo orale tra le guance e il ramo mandibolare con un secco / smussato forbici dritte.
- Tirare verso il basso la mandibola.
- Tagliare i tessuti molli e duri in una linea immaginaria 1 millimetro dietro i molari terzi con forbici normali. Dirigono le forbici perpendicolari al piano dell'osso palatale (Figura 2A, linee blu).
- Incidere i tessuti molli e duri 2 millimetri dietro gli incisivi (Figura 2A, linee blu).
- Tirare verso il basso la parte anteriore della bocca. La cavità nasale è osservabile dopo questo passaggio.
- Posizionare le forbiciparallelo al palato, mettere una lama nella cavità nasale, l'altra lama deve incidere al vestibolo. Tagliare finché l'incisione posteriore (Figura 2A, linee verdi). Ripetere questo passaggio su entrambi i lati del mascellare superiore. Alla fine del mascellare è staccata dal resto del cranio (Figura 2B).
- Rimuovere la mascella, tagliarlo nella sutura centro (Figura 2, nero linea tratteggiata) e tagliare il tessuto palatale di ciascun emi-mascellare fino a raggiungere l'osso alveolare.
- Sbucciare i tessuti gengivali (sia emi-mascellari) dal loro margine anteriore con Adson pinza (senza denti).
- Posizionare la gengiva asportato in un piatto con PBS + 2% FCS.
2. Gengivale Elaborazione
- Mettere la gengiva asportato in un piatto di coltura tissutale (35 x 10 mm) con 1 ml di PBS + 2% FCS, 2 mg / ml di collagenasi di tipo II e 1 mg / ml di DNAsi Tipo I.
- Tritare bene il tessuto con un 15 ° lama chirurgica sterile n.
- Transfer il tessuto dalla piastra ad una provetta ml conica 15.
- Lavare le cellule del tessuto / restano sulla piastra con 1 ml di PBS + 2% FCS e trasferimento alla stessa provetta.
- Incubare in un agitatore incubatore per 20 minuti a 37 ° C, 200 rpm (raccomandazione: preriscaldare l'incubatrice).
- Aggiungere 20 ml di EDTA 0,5 M e incubare per altri 10 min a 37 ° C, 200 rpm.
- Riempire la provetta fino a 12 ml con PBS + 2% FCS e centrifugare a 4 ° C, 400 x g per 8 minuti (si consiglia di pre-raffreddamento della centrifuga).
- Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con 2 ml di PBS + 2% FCS.
- Filtrare il campione con un 70 micron cella-filtro e salvare il flusso attraverso.
- Centrifugare a 4 ° C, 320 xg per 5 min.
- Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con 300 microlitri di PBS + 2% FCS.
- Contare le cellule (circa 5-10 x 10 5 cellule sono attesi da un singolo mascellare).
3. Anticorpo extracellulare e intracellulareLa colorazione per Citometria a Flusso Analisi
Si consiglia di lavorare all'interno di una cappa, con le luci spente. È fondamentale per mantenere le cellule in ambiente freddo costante, così come tutti i materiali necessari.
- Colorare le cellule contro molecole extracellulari aggiungendo 0,2-0,5 ug di ciascun anticorpo selezionata per 1 x 10 6 cellule in un volume totale di 100 microlitri.
- Vortex brevemente.
- Incubare le provette per 15 minuti al buio a 4 ° C.
- Lavare le cellule con 2 ml di PBS + 2% FCS.
- Centrifugare a 4 ° C, 320 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo, goccia a goccia, 500 microlitri freddo BD Cytoperm / Cytofix mentre vortex.
- Incubare le provette per 40 min a 4 ° C al buio.
- Vortex brevemente.
- Lavare le cellule due volte con 1 ml di freddo BD Perm / tampone di lavaggio e centrifuga a 800 xg per 7 minuti a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante eccetto 300 microlitri.
- Colorare le cellule intracellulare dallaaggiungendo 1 ug di ciascun anticorpo selezionata per 1 x 10 6 cellule in un volume totale di 100 microlitri.
- Vortex brevemente.
- Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C.
- Lavare le cellule due volte con 1 ml di freddo BD Perm / tampone di lavaggio e centrifuga a 800 xg per 7 minuti a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con l'aggiunta di 300 ml freddo BD Perm / Wash Buffer.
- Vortex brevemente.
- Trasferire la sospensione, mentre il filtraggio di tubi FACS.
- Tenere i tubi in un ambiente buio e fredda fino all'analisi.
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Representative Results
Esempi di analisi di citometria a flusso su cellule gengivali sono presentati. Cellule gengivali pool da 2 topi sono stati eseguiti in un LSR II citofluorimetro e analizzati utilizzando il software FlowJo. Figura 3A dimostrato la distribuzione delle cellule gengivali da topi naive in un side scatter (SSC) rispetto forward scatter (FSC) trama. Strategia di gating per identificare (i) linfociti (ii) monociti / cellule dendritiche e (iii) granulociti è indicata. Fini confronto, presentiamo anche una trama FACS illustrando cellule gengivali purificate da P. gingivalis infettato topi 21 giorni dopo la sonda gastrica in un ambiente di parodontite sperimentale come abbiamo descritto in precedenza (Figura 3B). Un aumento nelle diverse popolazioni di cellule immunitarie possono essere facilmente individuati nei topi infettati rispetto ai topi naive. Prossimo, identifichiamo cellule immunitarie nel gengiva elaborati da gating sulle cellule esprimenti il marcatore CD45 ematopoietica (Figura 4A). T cellule ueste ulteriormente suddivise in cellule CD3-positive rappresentano cellule T (Figura 4B). Abbiamo anche individuato neutrofili gengivali secondo l'espressione del Ly6G e molecole CD11b (Figura 4C). Infine, le cellule di Langerhans, un sottoinsieme epiteliale delle cellule dendritiche (DC), sono stati identificati da gating su MHC di classe II + CD11c + cellule (un marker di cellule dendritiche murine) e l'espressione di Ep-CAM e langerin/CD207 (colorazione intracellulare) (Figura 4D).
Figura 1. Schema che mostra i punti di riferimento anatomici della gengiva.
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Figura 2. Rappresentazione schematica di topo cavità orale risultante dopo aver completato il punto 1.3 i tessuti molli dal retro al fronte:. Massetere (MM), palato molle (SP), palato duro (HP), gengiva (G). Tessuti duri: molari e incisivi. L'obiettivo principale di questa tecnica è quello di isolare il tessuto gengivale che circonda i tre molari (all'interno dell'ovale nero).
Figura 3. Rappresentante FACS trame che dimostrano distribuzione cellulare dei leucociti gengivali. Campioni gengivali trasformati sono stati eseguiti sul LSR II citofluorimetro e analizzati utilizzando il software FlowJo. Side scatter (SSC) rispetto forward scatter (FSC) appezzamenti di cellule gengivali da (a) topi naive o (B) gengiva infiammata sono presented. La posizione del (i) linfociti (ii) monociti / cellule dendritiche e (iii) granulociti popolazioni è indicata.
Figura 4. Rappresentante FACS trame che dimostrano l'analisi di cellule gengivali immunitarie. (A) Le cellule immunitarie sono state identificate secondo CD45 espressione. Seguendo gating su cellule CD45 positive e popolazione linfociti, espressione di CD3 abilitato il targeting subset T-cellule. (B) I neutrofili sono stati identificati nella gengiva secondo la capacità delle cellule CD45 + di esprimere anche Ly6G e CD11b. (C) Le cellule dendritiche erano identificato da gating sulle cellule CD45 + da parte della popolazione di monociti / dendritica [Figura 3, cancello (ii)], e quindi il MHC di classe II e di cellule positive CD11c.
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Discussion
Maxilla tessuti gengivali ottenuti da un singolo mouse sono sufficienti per analizzare sottopopolazioni di linfociti T e B, così come la loro capacità di esprimere molecole extracellulari ed intracellulari come noi descritta 1. Tuttavia, se le popolazioni di cellule rare sono di interesse (ad esempio DC), si raccomanda di tessuti piscina 2-3 topi. Di nota, se preferibile, è possibile sbucciare entrambi i tessuti palatali e gengivale e quindi di asportare la gengiva (una modifica del passo 1.8-1.9). Va ricordato, inoltre, che mandibolare gengiva può essere raccolto e, ancora, il suo isolamento è più complicato e può includere altri tessuti che potrebbero interferire con l'analisi.
Tecniche comuni per studiare le cellule immunitarie nella gengiva sono immunoistochimica e immunofluorescenza. Queste tecniche consentono visualizzazione della distribuzione di un bersaglio molecola / cellula attraverso la gengiva, e lo screening di numerose campos è necessaria al fine di studiare una certa area. Mentre la localizzazione fisiologica di alcune cellule non può essere determinata mediante citometria di flusso a causa di elaborazione gengivale, questo approccio fornisce diversi altri vantaggi: (1) la citometria a flusso è un metodo rapido e semplice per analizzare gran numero di cellule (2) riduce gli errori di analisi originano da eterogeneità del tessuto (3) permette l'analisi di popolazioni di cellule rare (4) permette l'analisi simultanea di diverse variabili (5) consente la discriminazione tra cellule vive e morte (6) consente l'analisi funzionale delle cellule risultanti.
La possibilità di eseguire analisi di citometria a flusso su tessuti gengivali durante la malattia parodontale sperimentale migliora la nostra capacità di svelare i meccanismi immunologici coinvolti in questo processo. Longitudinale studio di cambiamenti cellulari che si verifica nel seguente gengiva esposizione ad agenti patogeni orali dovrebbe fornire informazioni più rilevanti, piuttosto che misurare la risposta immunitaria systemically. Questo aspetto è di particolare importanza quando si analizza il fenotipo e la cinetica delle cellule infiammatorie innata e adattativa in gengiva infiammata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal Israel Science Foundation (n. 1418/11) per AHH e (n. 1933/12) a AW, la Fondazione israeliana tedesco per i giovani ricercatori (GIF Young) di AHH, e la dottoressa mi . Cabakoff Research Fondo di dotazione presso la University-Hadassah School of Dental Medicine di AHH e AW ebraico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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