Summary
Deze studie beschrijft een efficiënte techniek voor het isoleren en verwerken tandvleesweefsels van de muis mondholte om een-celkweek produceren. De resulterende cellen kunnen verder worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse en moleculaire studies.
Abstract
We hebben een techniek nauwkeurig isoleren en te verwerken murine gingivale weefsel voor flowcytometrie en moleculaire studies ontwikkeld. Het tandvlees is een unieke en belangrijke weefsels te immuun mechanismen te bestuderen omdat het betrokken is bij gastheer immuunreactie tegen orale biofilm die parodontale aandoeningen kunnen veroorzaken. Bovendien maakt het mogelijk de nabijheid van het tandvlees te alveolaire botweefsel ook het bestuderen botremodellering onder inflammatoire aandoeningen. Onze methode levert grote hoeveelheid afweercellen dat de analyse van zelfs zeldzame celpopulaties zoals Langerhans cellen en regulatoire T-cellen mogelijk maakt zoals we aangetoond eerder 1. Gebruikmakend muizen plaatselijke immune responsen betrokken alveolair botverlies bij periodontale ziekten te bestuderen is voordelig vanwege de beschikbaarheid van verschillende immunologische en experimentele instrumenten. Omdat echter de kleine omvang en de relatief lastig toegang tot de murine gingiva, vele studies vermeden onderzoek this kritische weefsel. De methode in dit werk beschreven kon tandvlees analyse, die hopelijk zal toenemen onze understatement op de mondelinge immuunsysteem en de rol daarvan bij parodontale aandoeningen te vergemakkelijken.
Introduction
Gingiva het zachte weefsel rond de cervicale gedeelte van de tanden en de alveolaire werkwijze omvat (figuur 1). De gingiva is een soort kauw slijmvlies dat verder kan worden gescheiden in mucosale epitheel en bindweefsel (ook bekend als submucosa of lamina propria). De anatomische structuur van het tandvlees en de aangrenzende tanden laat bacteriën om plaque (biofilm) die voortdurend uitdaagt het lokale immuunsysteem verblijven en te ontwikkelen. Daardoor ontstekingsreactie ontstaat in de gingiva, die onder bepaalde omstandigheden wordt destructief - een voorwaarde genoemd parodontitis 2. In principe kan plaque-geïnduceerde parodontale aandoeningen worden verdeeld in gingivitis en periodontitis. Gingivitis is een reversibele aandoening lokale ontstekingsreactie die wordt beperkt tot de gingiva. Parodontitis, anderzijds, is een onomkeerbaar vernietigingsproces waarbij het bevestigingsinstrument (alveolaire bot, periodontaleligament, cement en tandvlees) wordt vernietigd 3.
De gingiva werd voorgesteld om zowel als effector en inductieve locaties serveren tijdens parodontale aandoeningen 4. Menselijke studies hebben gesuggereerd dat in reactie op tandplaque, immune effector cellen en moleculen dynamisch geïnfiltreerd of vertrek van het tandvlees 5-7. Deze activiteit bleek een belangrijke rol spelen bij parodontitis 8,9. Overwegende dat de gegevens die zijn gegenereerd door deze studies leverden waardevolle informatie met betrekking tot dit pathologisch proces, het werken met menselijke weefsels bezitten belangrijke ethische, technische en experimentele beperkingen. De ontwikkeling van experimentele modellen toegestaan oorzaak-gevolg experimenten via het gebruik van transgene muizen en in vivo interventies 10. Daardoor kennis over de bij parodontitis mechanismen aanzienlijk gedurende de laatste twee decennia. Toch, vanwege de complexiteit van parodontitis, iseen lopende discussie over de aard van de lokale immuunrespons faciliteren weefseldestructie. Er is ook een gebrek aan inzicht in de functie van de centrale immuuncellen in de gingiva tijdens parodontale ziekten. Het is dus essentieel om pathologische inflammatoire gebeurtenissen in het doelweefsel van de ziekte, de gingiva bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bereiden op voorhand:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS met 2 mg / ml collagenase type II en 1 mg / ml DNAse type I (1 ml per monster)
- Gesteriliseerde chirurgische instrumenten
- 0,5 M EDTA-oplossing
1. Bovenste tandvlees Excisie Techniek
- Euthanaseren muizen met behulp van goedgekeurde IACUC begeleiding.
- Snijd beide zijden van de mondholte, waaronder de wangen en de onderkaak ramus met een scherp / stomp recht schaar.
- Trek de onderkaak.
- Snijd de zachte en harde weefsels in een denkbeeldige lijn 1 mm achter de derde molaren met standaard een schaar. Richt de schaar loodrecht op het vlak van de palatale bot (Figuur 2A, blauwe lijnen).
- Incise de zachte en harde weefsels 2 mm achter de snijtanden (Figuur 2A, blauwe lijnen).
- Trek de voorste deel van de mond. De neusholte waarneembaar na deze stap.
- Plaats de schaarparallel aan het gehemelte, zet een mes in de neusholte, moet de ander mes incisie in de vestibule. Snijd totdat de achterste incisie (Figuur 2A, groene lijnen). Herhaal deze stap aan beide zijden van de bovenkaak. Aan het einde van de bovenkaak wordt losgemaakt van de rest van de schedel (figuur 2B).
- Verwijder de bovenkaak, snijd het in het midden hechtdraad (figuur 2, zwarte stippellijn) en trim de palatale weefsel van elk hemi-bovenkaak tot aan het alveolaire bot.
- Schil de tandvleesweefsels (zowel hemi-maxillae) uit hun voorste grens met Adson pincet (zonder tanden).
- Leg de uitgesneden gingiva in een plaat met PBS + 2% FCS.
2. Gingivale Processing
- Plaats de uitgesneden gingiva in een weefselkweek schaal (35 x 10 mm) met 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg / ml collagenase type II en 1 mg / ml DNAse I. Type
- Hak ook het weefsel met een N ° 15 steriel chirurgisch mes.
- Transfer het weefsel van de plaat tot een ml conische reageerbuis 15.
- Was de weefsels / cellen nog op de plaat met 1 ml PBS + 2% FCS en transfer naar dezelfde reageerbuis.
- Incubeer in een shaker incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C, 200 rpm (aanbeveling: Verwarm de incubator).
- Voeg 20 gl 0,5 M EDTA en incubeer gedurende nog 10 min bij 37 ° C, 200 rpm.
- Vul het reageerbuisje tot 12 ml met PBS + 2% FCS en centrifugeer bij 4 ° C, 400 g gedurende 8 min (aanbeveling: pre-chill de centrifuge).
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met 2 ml PBS + 2% FCS.
- Filter de steekproef met een 70 um cel zeef en stroom besparen door.
- Centrifugeer bij 4 ° C, 320 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met 300 pi PBS + 2% FCS.
- Tel de cellen (ongeveer 5-10 x 10 5 cellen worden verwacht van een bovenkaak).
3. Extracellulaire en intracellulaire AntibodyKleuring voor flowcytometrie-analyse
Het wordt aanbevolen om te werken binnen een kap, met lichten uit. Het is cruciaal om de cellen houden in een constante koude omgeving, evenals alle benodigde materialen.
- Stain cellen tegen extracellulaire moleculen door toevoeging 0,2-0,5 ug van elk geselecteerd antilichaam per 1 x 10 6 cellen in een totaal volume van 100 ul.
- Vortex kort.
- Incubeer de buizen gedurende 15 min in het donker bij 4 ° C.
- Was de cellen met 2 ml PBS + 2% FCS.
- Centrifugeer bij 4 ° C, 320 g gedurende 5 minuten.
- Aspireren supernatant en resuspendeer cellen door het toevoegen, druppelsgewijs, 500 ul koude BD Cytoperm / Cytofix terwijl vortexen.
- Incubeer de buizen gedurende 40 min bij 4 ° C in het donker.
- Vortex kort.
- Was tweemaal de cellen met 1 ml koude BD Perm / Wash Buffer en draaien op 800 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
- Aspireren supernatant behalve voor 300 pl.
- Stain cellen intracellulair doortoevoeging van 1 ug van elk geselecteerd antilichaam per 1 x 10 6 cellen in een totaal volume van 100 ul.
- Vortex kort.
- Incubeer gedurende 30 min in het donker bij 4 ° C.
- Was tweemaal de cellen met 1 ml koude BD Perm / Wash Buffer en draaien op 800 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C.
- Aspireren supernatant en resuspendeer cellen door toevoeging van 300 ul koud BD Perm / Wash Buffer.
- Vortex kort.
- Spoel de suspensie tijdens het filteren op FACS buizen.
- Houd de tubes in een donkere en koude omgeving tot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeelden van flowcytometrie analyse van gingivale cellen worden gepresenteerd. Gingivale cellen samengevoegd uit 2 muizen werden uitgevoerd in een LSR II flowcytometer en geanalyseerd met behulp van FlowJo software. Figuur 3A aangetoond dat de verdeling van de gingivale cellen uit naïeve muizen in een zijwaartse verstrooiing (SSC) versus voorwaartse verstrooiing (FSC) plot. Gating strategie te bepalen (i) lymfocyten (ii) monocyten / dendritische cellen en (iii) granulocyten aangegeven. Ter vergelijking doeleinden, presenteren we ook een FACS plot illustreert tandvlees cellen gezuiverd van P. gingivalis geïnfecteerde muizen 21 dagen na orale gavage in een experimentele omgeving parodontitis zoals we eerder beschreven (Figuur 3B). Een toename van de verschillende immuuncel populaties kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd in de geïnfecteerde muizen in vergelijking tot naïeve muizen. Vervolgens identificeren we immuuncellen in de bewerkte gingiva door gating op cellen die de marker hematopoïetische CD45 (Figuur 4A). T eze cellen verder gescheiden in CD3-positieve cellen die T-cellen (Figuur 4B). We identificeerden ook gingival neutrofielen volgens expressie van de Ly6G en CD11b moleculen (Figuur 4C). Tenslotte langerhans cellen, een epitheliale subset van dendritische cellen (DCs) werden geïdentificeerd door gating op MHC klasse II + CD11c + cellen (een marker van muizen DCs) en expressie van Ep-CAM en langerin/CD207 (intracellulaire kleuring) (figuur 4D).
Figuur 1. Schematische weergave van de anatomische oriëntatiepunten van het tandvlees.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schematische weergave van de muis mondholte resulteert na het voltooien van stap 1.3 zachte weefsels van de achterkant naar de voorkant:. Kauwspieren (MM), zachte gehemelte (SP), harde gehemelte (HP), gingiva (G). Hard weefsel: kiezen en snijtanden. Het belangrijkste doel van deze techniek is om de tandvleesweefsel dat de drie molaren (binnen in de zwarte ovale) omringt isoleren.
Figuur 3. Representatieve FACS plots demonstreren cellulaire distributie van gingivale leukocyten. Verwerkte tandvlees monsters werden uitgevoerd op de LSR II flowcytometer en geanalyseerd met behulp van FlowJo software. Zijwaartse verstrooiing (SSC) versus voorwaartse verstrooiing (FSC) percelen van de gingivale cellen van (A) naïeve muizen of (B) ontstoken tandvlees zijn presteerde. De plaats van (i) lymfocyten (ii) monocyten / dendritische cellen en (iii) granulocyten populatie aangegeven.
Figuur 4. Representatieve FACS plots demonstreren analyse van immune gingivale cellen. (A) Immune cellen werden geïdentificeerd op basis van CD45 expressie. Na gating op CD45-positieve cellen en lymfocyten bevolking expressie van CD3 aanstaat richten T-cel subreeks. (B) Neutrofielen werden in de gingiva naar vermogen van CD45 + cellen ook expressie Ly6G en CD11b. (C) Dendritische cellen geïdentificeerd door gating op CD45 + cellen van de monocyt / dendritische bevolking [Figuur 3, poort (ii)], en vervolgens op MHC klasse II en CD11c positieve cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maxilla gingivale weefsel van een enkele muis voldoende voor het analyseren van subpopulaties van T-en B-lymfocyten, evenals hun vermogen om extracellulaire en intracellulaire moleculen uitdrukken zoals we eerder beschreven 1. Niettemin, als zeldzame celpopulaties zijn van belang (bijvoorbeeld DC's), is het raadzaam om zwembad weefsels 2-3 muizen. Of: bij voorkeur is het mogelijk om zowel de schil en palatale tandvleesweefsels en vervolgens Snijd de gingiva (een modificatie van stap 1.8-1.9). Ook moet worden vermeld dat mandibulaire gingiva en kunnen worden verzameld, maar toch is de isolatie ingewikkelder en kunnen andere weefsels die storende analyse.
Gebruikte technieken om immuuncellen studeren in het tandvlees zijn immunohistochemie en immunofluorescentie. Deze technieken kunnen visualisatie van de verdeling van een doelwitmolecuul / cel door de gingiva en screening van talrijke velds vereist om een bepaald gebied te bestuderen. Dat de fysiologische lokalisatie van bepaalde cellen kan worden bepaald door middel van flowcytometrie door gingivale verwerking, deze aanpak biedt verschillende andere voordelen: (1) flowcytometrie is een snelle en eenvoudige methode om grote aantallen cellen te analyseren (2) vermindert analyse fouten ontstaan uit weefsel heterogeniteit (3) het maakt analyse van zeldzame celpopulaties (4) het maakt gelijktijdige analyse van verschillende variabelen (5) het maakt onderscheid tussen levende en dode cellen (6) het functionele analyse van de resulterende cellen toelaat.
De mogelijkheid om flowcytometrie analyse tandvleesweefsels voeren tijdens experimentele parodontitis vergroot ons vermogen om de immunologische mechanismen betrokken bij dit proces onthullen. Longitudinale studie van cellulaire veranderingen die optreedt in de gingiva na blootstelling aan orale pathogenen moet meer relevante informatie dan meten verschaffen immuunresponsen systemically. Dit aspect is van bijzonder belang bij de analyse van het fenotype en de kinetiek van aangeboren en adaptieve ontstekingscellen in ontstoken gingiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (nr. 1418/11) tot AHH en (nr. 1933/12) aan AW, de Duitse Israëlische Stichting voor jonge onderzoekers (GIF Young) naar AHH, en de Dr I . Cabakoff Onderzoek Endowment Fund aan de Hebreeuwse Universiteit Hadassah-School of Dental Medicine aan AHH en AW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
