Summary
Denne undersøgelse beskriver en effektiv teknik til at isolere og behandle gingivale væv fra muse mundhulen for at producere en enkelt cellekultur. De resulterende celler kan yderligere anvendes til flowcytometrianalyse og molekylære studier.
Abstract
Vi har udviklet en teknik til præcist isolere og behandle murin tandkødsvæv til flowcytometri og molekylære studier. Tandkødet er en unik og vigtig væv at studere immunmekanismer fordi det er involveret i vært immunrespons mod oral biofilm, kan forårsage periodontale sygdomme. Endvidere muliggør den tætte nærhed af gingiva til alveoleknoglen væv også studere knogleremodelleringen under betændelsestilstande. Vores metode giver store mængder af immunceller, der tillader analyse af selv sjældne cellepopulationer, såsom Langerhanske celler og T regulatoriske celler, som vi tidligere vist 1.. Anvender mus at studere lokale immunresponser involveret i alveoleknogletab under parodontose er fordelagtig på grund af tilgængeligheden af forskellige immunologiske og eksperimentelle værktøjer. Alligevel, på grund af deres lille størrelse og relativt ubekvemme adgang til det murine gingiva mange undersøgelser undgås undersøgelse af This kritisk væv. Metoden i dette arbejde kan gøre det lettere gingival analyse som forhåbentlig vil øge vores underdrive den mundtlige immunsystemet og dets rolle under parodontose.
Introduction
Gingiva er det bløde væv omkring den cervikale del af tænderne og dækker den alveolære proces (figur 1). Tandkødet er en type af tyggemæssig slimhinde, som kan adskilles yderligere i slimhindeepitelet og bindevæv (også kendt som submucosa eller lamina propria). Den anatomiske struktur gingiva og tilstødende tænder tillader bakterier at opholde sig og udvikle plak (biofilm), som konstant udfordrer det lokale immunforsvar. Som et resultat, udvikler inflammatorisk respons i tandkødet, som under visse omstændigheder bliver ødelæggende - en tilstand kaldet parodontale sygdomme 2. Grundlæggende kan plak-inducerede periodontale patologier opdeles i tandkødsbetændelse og parodontose. Gingivitis er en reversibel tilstand af lokal inflammatorisk respons, der er begrænset til gingiva. Parodontitis, på den anden side, er en irreversibel destruktiv proces, hvor fastgørelsen apparat (alveoleknoglen, periodontalledbånd, cementum og gingiva), destrueres 3..
Gingiva blev foreslået at tjene både som effektor og induktive sites under parodontose 4.. Humane undersøgelser har antydet, at som svar på plak, immuneffektorceller og molekyler dynamisk infiltreret eller afgang gingiva 5-7. Denne aktivitet blev vist at spille en vigtig rolle i parodontal destruktion 8,9. Betragtninger data genereret af disse undersøgelser, værdifulde oplysninger om denne patologiske proces, der arbejder med humant væv besidder store etiske, tekniske og eksperimenterende begrænsninger. Udviklingen af eksperimentelle modeller tilladt årsag-virknings-eksperimenter via ansætte transgene mus og in vivo interventioner 10. Som følge heraf steg vores viden om de mekanismer, der er involveret i paradentose betydeligt i de seneste to årtier. Selv så, på grund af kompleksiteten af parodontale sygdomme, der eren løbende debat om arten af lokale immunrespons letter vævsødelæggelser. Der er også en mangel i vores forståelse af funktionen af centrale immunceller i gingiva under periodontale sygdomme. Det er derfor vigtigt at undersøge patologiske inflammatoriske begivenheder i målvævet af sygdommen, gingiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forbered på forhånd:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS med 2 mg / ml collagenase type II og 1 mg / ml DNAse type I (1 ml per prøve)
- Steriliserede kirurgiske instrumenter
- 0,5 M EDTA-opløsning
1.. Upper Gingival Excision Technique
- Afliv mus bruger godkendte IACUC vejledning.
- Skær begge sider af mundhulen, herunder kinder og underkæben ramus med en skarp / sløv lige saks.
- Træk ned underkæben.
- Skær de bløde og hårde væv i en imaginær linie 1 mm bag tredjedele kindtænder med standard saks. Direkte saksen vinkelret på planet af palatinale knogle (figur 2A, blå linjer).
- Incise de bløde og hårde væv 2 mm bag fortænderne (figur 2A, blå linjer).
- Træk ned den forreste del af munden. Næsehulen observeres efter dette trin.
- Placer saksenparallel til ganen, sætte den ene vinge ind i næsehulen, må den anden klinge incise på forhallen. Skær indtil den bageste indsnit (figur 2A, grønne linjer). Gentag dette trin på begge sider af overkæben. Ved afslutningen maxilla er adskilt fra resten af kraniet (figur 2B).
- Fjern overkæben, skæres det i midten sutur (figur 2, sort stiplet linie) og trim palatinale væv af hvert hemi-overkæben indtil man alveoleknoglen.
- Skræl gingival væv (både hemi-Kjaever) fra deres forreste grænse med Adson pincet (uden tænder).
- Placer det udskårne gingiva i en plade med PBS + 2% FCS.
2.. Gingival Processing
- Sæt det udskårne gingiva i en vævskulturskål (35 x 10 mm) med 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg / ml collagenase type II og 1 mg / ml DNAse type I.
- Hakke godt vævet med et N ° 15 steril kirurgisk kniv.
- Transfer væv fra pladen til en 15 ml konisk reagensglas.
- Vask væv / celler tilbage på pladen med 1 ml PBS + 2% FCS og overførsel til den samme reagensglas.
- Inkuber i en shaker inkubator i 20 minutter ved 37 ° C, 200 rpm (anbefaling: forvarme inkubatoren).
- Tilsæt 20 pi EDTA 0,5 M og inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 ° C, 200 rpm.
- Fyld reagensglasset op til 12 ml med PBS + 2% FCS og centrifugeres ved 4 ° C, 400 xg i 8 min (anbefaling: pre-chill centrifugen).
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne med 2 ml PBS + 2% FCS.
- Filtrere prøven med en 70 um celle si og gem flow igennem.
- Centrifuge ved 4 ° C, 320 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne med 300 gl PBS + 2% FCS.
- Tæl celler (ca. 5-10 x 10 5 celler forventes fra en enkelt overkæben).
3.. Ekstracellulær og Intracellulær antistofFarvning for flowcytometri-analyse
Det anbefales at arbejde inde i en hætte, med lys slukket. Det er afgørende at holde cellerne i konstant koldt miljø, samt alle de nødvendige materialer.
- Stain celler mod ekstracellulære molekyler ved tilsætning 0,2-0,5 ug af hver af de valgte antistof pr 1 x 10 6 celler i et samlet volumen på 100 ul.
- Vortex kortvarigt.
- Inkuber rørene i 15 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellerne med 2 ml PBS + 2% FCS.
- Centrifuge ved 4 ° C, 320 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellerne ved at tilføje, drop klog, 500 pi kold BD Cytoperm / Cytofix mens vortex.
- Inkuber rørene i 40 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vortex kortvarigt.
- Vask cellerne to gange med 1 ml kold BD Perm / Wash Buffer og centrifugering ved 800 xg i 7 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten undtagen 300 pi.
- Stain celler intracellulært aftilsætning af 1 ug af hver af de valgte antistof pr 1 x 10 6 celler i et samlet volumen på 100 ul.
- Vortex kortvarigt.
- Inkuber i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellerne to gange med 1 ml kold BD Perm / Wash Buffer og centrifugering ved 800 xg i 7 minutter ved 4 ° C.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellerne ved tilsætning 300 pi kold BD Perm / vaskebuffer.
- Vortex kortvarigt.
- Overfør suspensionen mens filtrering til FACS-rør.
- Holde rørene i en mørk og kold miljø indtil analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på flowcytometri analyse på gingivale celler præsenteres. Gingivale celler poolet fra 2 mus blev kørt i en LSR II flowcytometer og analyseres ved hjælp FlowJo software. Figur 3A viste fordelingen af gingivale celler fra naive mus i en side scatter (SSC) versus frontal scatter (FSC) plot. Gating strategi til at identificere (i) lymfocytter (ii) monocytter / dendritiske celler og (iii) granulocytter er indiceret. Til sammenligning formål, også præsenterer vi en FACS plot illustrerer gingival celler oprenset fra P. gingivalis inficerede mus 21 dage efter oral sondeernæring i en indstilling af eksperimentel parodontitis som vi tidligere beskrevet (figur 3B). En stigning i de forskellige immun cellepopulationer let kan afsløres i de inficerede mus sammenlignet med naive mus. Dernæst identificerer vi immunceller i forarbejdede gingiva ved gating på celler, der udtrykker det hæmatopoietiske markør CD45 (figur 4A). T isse celler yderligere opdelt i CD3-positive celler repræsenterer T-celler (figur 4B). Vi har også identificeret gingival neutrofiler ifølge udtryk for Ly6G og CD11-molekyler (figur 4C). Endelig blev Langerhanske celler, en epitelial delmængde af dendritiske celler (DCS), identificeret ved gating på MHC klasse II + CD11c + celler (en markør for murine DCS) og ekspression af Ep-CAM og langerin/CD207 (intracellulær farvning) (figur 4D).
Figur 1. Skematisk diagram, der viser de anatomiske vartegn af gingiva.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
Figur 2. Skematisk billede af muse mundhulen resulterer efter udførelsen af trin 1.3 Bløde væv fra bagsiden til forsiden:. Kæbemuskel (MM), bløde gane (SP), hårde gane (HK), gingiva (G). Hårdt væv: kindtænder og fortænder. Det vigtigste mål med denne teknik er at isolere gingival væv, der omgiver de tre kindtænder (inde i det sorte ovale).
Figur 3. Repræsentative FACS plots viser cellulære distribution af gingivale leukocytter. Forarbejdede gingivale prøver blev kørt på LSR II flowcytometeret og analyseres ved hjælp FlowJo software. Side scatter (SSC) versus forward scatter (FSC) afbildninger af gingivale celler fra (A) naive mus eller (B) betændt gingiva er presterede. Placeringen af (i) lymfocytter (ii) monocytter / dendritiske celler og (iii) granulocytter populationer er indiceret.
Figur 4.. Repræsentative FACS plots viser analyse af immun gingivale celler. (A) Immunceller blev identificeret i henhold til CD45 udtryk. Efter gating på CD45-positive celler og lymfocytter befolkning, aktiveret udtryk for CD3 rettet T-celle delmængde. (B) Neutrofiler blev identificeret i tandkødet efter evne CD45 + celler til at udtrykke også Ly6G og CD11b. (C) dendritiske celler var identificeret ved gating på CD45 +-celler fra monocyt / dendritiske befolkningen [Figur 3, gate (ii)], og derefter på MHC klasse II og CD11c positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maxilla gingivale væv fra en enkelt mus er tilstrækkelige til at analysere sub-populationer af T-og B-lymfocytter, samt deres evne til at udtrykke ekstracellulære og intracellulære molekyler, som vi tidligere beskrevet 1.. Men hvis sjældne cellepopulationer er af interesse (f.eks DCS), anbefales det at samle væv 2-3 mus. Det skal bemærkes, hvis foretrækkes, er det muligt at skrælle både palatinalt og gingival væv og derefter til udskæring af tandkødet (en ændring af trin 1,8-1,9). Det bør også nævnes, at mandibulær gingiva kan opsamles såvel, stadig, sin isolation er mere kompliceret og kan omfatte andre væv, der kan interferere med analysen.
Almindelige teknikker til at studere immunceller i gingiva er immunhistokemi og immunofluorescens. Disse teknikker muliggøre visualisering af fordelingen af et målmolekyle / celle gennem gingiva og screening af talrige felts er nødvendig for at studere et bestemt område. Henviser fysiologiske lokalisering af visse celler ikke kan bestemmes ved flowcytometri på grund af gingival behandling, denne tilgang giver flere andre fordele: (1) flowcytometri er en hurtig og enkel metode til at analysere et stort antal celler (2) det reducerer analyse fejl stammer fra væv heterogenitet (3) det muliggør analyse af sjældne cellepopulationer (4) det muliggør samtidig analyse af forskellige variabler (5) det tillader diskrimination mellem levende og døde celler (6) Det muliggør funktionel analyse af de resulterende celler.
Evnen til at udføre flowcytometri analyse på gingivale væv under eksperimentel paradentose forbedrer vores evne til at afsløre de immunologiske mekanismer involveret i denne proces. Longitudinal studerer af celleforandringer, der opstår i gingiva efter udsættelse for orale patogener bør give mere relevant information end måling immunreaktioner systemically. Dette aspekt er af særlig betydning, når man analyserer fænotype og kinetik af medfødte og adaptive inflammatoriske celler i betændt tandkød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (nr. 1418-1411) til AHH og (nr. 1933-1912) til AW, den tyske israelske Foundation for unge efterforskere (GIF Young) til AHH og Dr. I . Cabakoff Research Endowment Fund på Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine til AHH og AW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
