Summary
Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.
Abstract
O diabético (NOD) do mouse não obesos espontaneamente desenvolve diabetes auto-imune após 12 semanas de idade e é o modelo animal mais estudada do ser humano diabetes tipo 1 (DM1). Estudos de transferência de células em ratinhos receptores irradiados têm demonstrado que as células T são fundamentais na patogénese T1D neste modelo. Descrevemos aqui um método simples para rapidamente induzir T1D por transferência adoptiva de purificada, as células T a partir de ratinhos NOD pré-diabéticos transgénicas para o receptor de células T específico de ilhota (TCR) BDC2.5 em ratinhos receptores NOD.SCID CD4 + primárias. As principais vantagens desta técnica são que o isolamento e transferência adoptiva de células T diabetogênicas pode ser concluída no mesmo dia, a irradiação dos destinatários não é necessária, e uma elevada incidência de DM1 é induzida dentro de 2 semanas após a transferência de células T. Assim, os estudos de patogénese e intervenções terapêuticas DM1 pode prosseguir a uma velocidade mais rápida do que com os métodos que se baseiam em populações heterogéneas de células T ou clonesderivados de ratinhos NOD diabéticos.
Introduction
O ratinho NOD espontaneamente desenvolve a diabetes auto-imune e tem sido amplamente utilizada como um modelo animal para 1,2 T1D humano. Patogénese de DM1 em ratinhos NOD é caracterizada pela infiltração de, com início às 3-4 semanas de idade, dos ilhéus pancreáticos de Langerhans por macrófagos e células dendríticas, seguido de células T e B. Esta fase de não-destrutiva peri-insulite leva à destruição lenta e progressiva das células β pancreáticas produtoras de insulina, o que resulta em diabetes evidente por 4-6 meses de idade 3. A transferência de esplenócitos de 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 As células T de ratinhos NOD diabéticos têm mostrado mediar a diabetes em ratinhos NOD imunocomprometidos, indicando que as células T reactivas ilhotas desempenham um papel central na patogénese DM1. Dependendo das condições experimentais, desenvolveram diabetes em ratinhos receptores, lentamente, ao longo de várias semanas nestes estudos. Da mesma forma, vários clones de células T, derivadas por demorado e dispendiosocultura de células T diabetogênicas, têm sido relatados para mediar a diabetes várias semanas após a transferência para ratinhos receptores 7,10. Com a disponibilidade de ratinhos transgénicos que expressam TCR derivados de CD4 ou clones de células T CD8 + restritas diabetogênicas T, vários laboratórios têm subsequentemente demonstrado que as células T do baço de tais ratinhos eram capazes de transferir a diabetes aos receptores 11-13. Especificamente, os ratinhos NOD são BDC2.5 transgénico para a BDC2.5 TCR, que é específico para a cromogranina A, uma proteína em células beta pancreáticas 14-16. Transferência de in vitro ativado ou células do baço inteiro ou fracionado não-ativado a partir abertamente diabéticos ou pré-diabéticos BDC2.5 ratos transferidos diabetes em camundongos NOD neonatais ou imunodeficientes em diferentes eficiências 11,17-19.
Nós descrevemos um método simples que utiliza transgênicos CD4 + purificadas células T de pré-diabéticos BDC2.5 ratos para induzir DM1 em camundongos receptores de alta eficiência e Consistency. Grandes números de células T naive, ilhotas CD4 + específicas para o antigénio são isolados a partir destes ratos por separação de células activadas por fluorescência (FACS) para CD4 + CD62L + células T que expressam a cadeia a de TCR Vβ4 transgénica. Células purificadas transgênicos T são então transferidos sem ativação em camundongos NOD.SCID, que carecem funcionais T e células B e são insulitis e diabetes livre de 20. Os ratinhos receptores são monitorados para elevadas concentrações de glucose na urina, indicando DM1, que se desenvolve rapidamente dentro de duas semanas após a transferência de células T.
Em contraste com outros métodos que transferir células T com especificidades diabetogênicas heterogéneos, o nosso protocolo utiliza células T que expressam quase exclusivamente o diabetogénico BDC2.5 TCR FACS classificados CD4 +. Devido à sua homogeneidade, apenas um pequeno número de células T transferidas (~ 1x10 6 células / rato) são necessários para o desenvolvimento rápido T1D dentro de 2 semanas a 100% de incidência. Outra vantagem é que o nosso protocolo irradiation de ratos destinatário não é necessário, pois é para alguns outros métodos. Uma limitação potencial deste método é que ela não permite a investigação sobre a contribuição de ambas as células T CD8 em diabetes subconjuntos CD4 e CD8 das células T ou especificamente.
O protocolo descrito irá ser útil para estudar o desenvolvimento rápido DM1, mediada por CD4 naive, monoespecíficos + células T, bem como estratégias terapêuticas para intervir na direcção das células Th específicas do antigénio da ilhota para o órgão alvo.
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Protocol
1. Isolamento de células T de baço e linfonodos de BDC2.5 Mice
- Use 6 semanas de idade pré-diabéticos do sexo feminino BDC2.5 ratos como doadores de células T CD4 + diabetogênicos. Os ratos devem estar livre de diabetes, conforme determinado por medição de glucose na urina (ver abaixo).
- Eutanásia cada rato usando asfixia CO 2 e remover o baço, axilar e braquial gânglios linfáticos sob condições estéreis. Para remover o baço, mergulhe a pele com álcool 70%, em seguida, cortar e retirar a pele. O baço será visível como um órgão de vermelho escuro sobre o lado esquerdo do rato. Adicione uma incisão de 1 cm no peritoneu utilizando as pequenas tesouras e agarrar suavemente o baço, no centro, com um par de pequenas pinças. Aparar cuidadosamente o tecido conjuntivo e gordura em anexo, tanto quanto possível, e remover o baço.
- Recolha as baço e linfonodos em 10 ml de Meio Dulbecco's-Modified Eagle (DMEM), em um tubo cônico de 15 ml no gelo.
- Prepara-se uma suspensão de células individuais utilizando the final de um estéril 10 ml êmbolo da seringa para pressionar suavemente os órgãos linfóides através de 70 filtros de celulares mM (um baço por peneira e 4-6 linfonodos por filtro) no mesmo tubo de 50 ml.
Durante o processo, lavar cada filtro com um ml de DMEM várias vezes para maximizar a recuperação de células a partir do filtro.
- Transferir as células recolhidas a partir do tubo cónico de 50 ml para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 300-400 x g durante 7 minutos à TA.
- Para lisar as células vermelhas do sangue, descartar o sobrenadante, re-suspender as células em 5 ml de tampão de amónio-cloreto e potássio (ACK) (pH 7,2), e incubar a suspensão de célula ACK à TA durante 5 min.
- Adicionar 10 ml de DMEM para a suspensão de célula ACK e centrifugar o tubo como acima. Lava-se a pelete celular uma vez com 10 ml de DMEM.
2. Separação de células de fluorescência-activated de diabetogênicos TCD4 + de BDC2.5 Mice
- Re-suspender as células em 5 ml FACS scontendo tampão e contar o número de células viáveis (por microscopia de contraste de fase e um hemocitómetro) por exclusão do corante azul de tripano.
- Usando tampão FACS, ajustar o volume da suspensão de células a 5 x 10 7 células / ml. Remover ~ 1 x 10 6 células por controle coloração (1 não mancha, três manchas individuais). Stain a amostra para CD4 transgénicos não activadas + células T com anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) e (PE), os anticorpos monoclonais anti-CD62L (Acm) em um tubo de 15 ml. Realização da coloração celular, utilizando as concentrações de mAb sugeridas pelo fabricante durante 20-30 minutos a 4 ° C no escuro.
- Lava-se a amostra e controles de manchas individuais com tampão FACS em> 3x o volume da reacção de coloração. Centrifuga-se o tubo a 300-400 x g, remover o sobrenadante, e re-suspender as células em tampão de SCAF (1-2 x 10 7 células / ml de amostra de triagem e 300 ul para os controlos mancha individual) e armazenar em gelo até que o próximo passo.
- Passar a amostra de células através de uma célula de 35 mMtubo de tampa de filtro para remover aglomerados de células. Classificar as amostras de CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + células em um classificador de células com um operador treinado. Recolher as células classificadas em 3 ml de DMEM em um tubo de 15 ml. Permitir 2,5-3 horas, incluindo a configuração, para classificar 8 1,5 x 10 células (com o número aproximado de células obtidos a partir de três ratinhos dadores) a uma taxa de tipo de 2 x 10 4 eventos totais / seg. Esperar ~ 2,5 x 10 6 CD4 transgênicos não ativados + células T por rato após separação de células.
- Registe o número absoluto de células classificadas no final do tipo e centrifugar para durante 7 minutos a 300-400 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células (2 x 10 6 células / ml) em fosfato estéril-salino tamponado (PBS) (Mg 2 + / Ca2 + livre) para a transferência adoptiva de células T.
3. Transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 + de BDC2.5 Mice
- Usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de calibre 18-1 ½, gentilmente re-suspender as células CD4 FACS-purificadas +Células T e carregar a seringa de 1 ml. Em preparação para a injeção, substitua o 18-1 ½ agulha de calibre com uma agulha de calibre 27 ½.
- Expor 6-8 semanas de idade, do sexo feminino ratos destinatário NOD.SCID a uma lâmpada de aquecimento até que exibem comportamento de limpeza.
- Conter em ratinhos receptores limitador e limpar a sua cauda com etanol a 70% (v / v) para desinfectar o local da injecção.
- Injectar 1-2 x 10 6 células / murganho FACS classificados (em até 500 ul de PBS) em qualquer uma das veias laterais da cauda.
Não force o êmbolo. Se a agulha está localizado apropriadamente na veia, a injecção terá lugar com quase nenhuma resistência.
4. Monitoramento Mice destinatário para hiperglicemia e DM1
- Começando cinco dias após a transferência de células T, ratinhos receptores NOD.SCID são monitorados diariamente para glucose na urina elevada usando tiras reagentes (Bayer Diastix) de acordo com as instruções do fabricante. Ratos com duas urin consecutivoleituras electrónicos glicose> 250 mg / dl são considerados diabéticos.
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Representative Results
Os nossos resultados mostram o isolamento de células que expressam transgénicos BDC2.5 CD62L, o qual é crítico para as células T para a casa de órgãos linfóides secundários, tais como os nódulos linfáticos pancreáticas. Os resultados demonstram ainda a capacidade potente desta população de células T monoespecífico para transferir rápida e eficientemente a T1D ratinhos receptores NOD.SCID.
Isolamento de células T CD4 + células T diabetogênicas BDC2.5 de ratinhos é mostrado na Figura 2. Aproximadamente 5 x 10 7 células de baço e os linfonodos agrupados foram obtidos por camundongo doador antes da separação de células. Seguindo o fluxo de citometria tipo, ~ 2,5 x 10 6 transgénicos ingénuas CD4 + de células T (CD4 +, TCR Vβ4 + CD62L +) foram obtidas a partir de cada rato doador BDC2.5 usando a estratégia de propagação indicado.
Como esperado, a transferência adoptiva de pequenos números de células CD4 +, TCR Vβ4 + CD62L + (~ 1 x 10 6 células / murganho) a partir de ratinhos dadores induzido BDC2.5 T1D em todos os re NOD.SCID cipients (100% de incidência) no dia 11, como determinado por níveis elevados de glucose na urina (Figura 3). Em comparação, a transferência de heterogénea CD3 + BDC2.5 células T necessárias 3-5 vezes mais células para induzir T1D 80% em receptores NOD.SCID por 3 Semanas 21.
Estes dados demonstram que a transferência adoptiva de pequenos números de FACS purificadas BDC2.5 transgénicos células CD4 + CD62L + T em ratinhos induzidos NOD.SCID T1D mais rápida e eficientemente.
Figura 1. Seqüência de eventos experimentais. Baço e linfonodos foram coletadas em BDC2.5 camundongos. CD4 + T Naive transgénicos células (linfócitos CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) foram isolados por FACS. As células T foram novamente suspensas em PBS e injectadas por via intravenosa em receptores NOD.SCID, que foram posteriormente monitorizados para a elevação da glicose na urina, indicando DM1.
Figura 2. Estratégia de propagação de tipo CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + baço e linfonodos células nó derivadas de camundongos BDC2.5 por FACS. Uma suspensão de uma única célula do baço e linfonodos agrupados estava manchada com fluorescente-rotuladas anti-CD4 (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC), e anti-CD62L (PE), o mAb. O gráfico de pontos da esquerda mostra os CD4 + TCR Vβ4 + população celular que foi usado para a porta das células CD62L +, mostrados na trama ponto certo. Células em caixas representam percentagens de populações de células fechadas.
Figura 3. A transferência adoptiva de células T CD4 + diabetogênicas. FACS isolado Vβ4 TCR + CD4 + CD62L + BDC2.5 células de ratinhos foram injectados por via intravenosa (1,3 x 10 6 células / ratinho) em ratinhos receptores NOD.SCID (n = 5). Ratos were monitorizados para DM1 por medição das concentrações de glicose na urina nos receptores. Ratos com duas leituras consecutivas de> 250 mg / dl foram considerados diabéticos.
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Discussion
DM1 pode ser induzida em ratinhos receptores em diferentes eficiências de transferência adoptiva de células do baço inteiro ou subconjuntos de células T a partir de ratinhos NOD diabéticos ou ratinhos transgénicos para TCRs derivados de clones de células T diabetogênicas. Nós relatamos aqui um método reprodutível para induzir DM1 em camundongos receptores dentro de duas semanas a 100% de incidência, transferindo FACS-purificadas CD62L + BDC2.5 CD4 + células T transgênicos em camundongos NOD.SCID.
As vantagens específicas do modelo de transferência de células T BDC2.5 aqui descrito incluem o tempo de indução muito curto de DM1 em relação ao mês para a diabetes espontânea e até várias semanas para a transferência de diabetes por diabetogênicas subconjuntos de células T ou clones de células T. Além disso, devido à sua homogeneidade, apenas um pequeno número de células transgénicas BDC2.5 T purificadas são necessários para transferir T1D com alta eficiência e consistência. Em contraste com alguns outros métodos de transferência de células T, a activação in vitro de células transgénicas BDC2.5 T antes de transfer não é necessário no nosso protocolo. Outra vantagem do nosso método de transferência de células T monoespecífico é que as estratégias terapêuticas para intervir na direcção de células específicas para o antigénio da ilhota T para o órgão-alvo pode ser investigada de forma mais selectiva do que com outros protocolos de transferência de que a diabetes com populações de células T heterogéneos.
Uma limitação potencial do nosso método é que ele não é adequado para determinar a contribuição de ambas as subpopulações de células T CD8 + T na patogénese T1D CD4 + e por células T CD4, monoespecíficos diabetogênicas + são utilizados para transferir a diabetes.
Na ausência de um instrumento FACS, BDC2.5 células T transgénicas podem ser isolados por coluna de purificação utilizando PE-anti-TCR marcado Vβ4 mAc anti-PE e as esferas magnéticas, seguido por linfócitos T CD4 + CD62L + esferas magnéticas (Miltenyi).
Deve notar-se que FACS purificado, bem como células T coluna purificado, incluirá uma população pequena de células T CD4 + tha não expressar a TCR transgênico devido à exclusão alélica incompleta de genes TCR endógenos 15. A fracção purificada de células T pode também incluir CD4 + CD25 + Treg que possam suprimir o desenvolvimento DM1 em receptores. Uma vez que ambas as populações de células T têm sido relatados a aumentar em BDC2.5 camundongos com idade, recomendamos o uso BDC2.5 ratos que não têm mais de seis semanas 22,23. CD4 + células T reguladoras CD25 + podem, alternativamente, ser excluídas BDC2.5 células T por FACS de triagem ou de separação com células CD4 + CD25 + esferas magnéticas (Miltenyi) em ratinhos mais velhos BDC2.5.
Alternativamente, ou em adição ao controlo DM1 por medições de glicose na urina, os níveis de glicose no sangue pode ser determinada com maior precisão, em ratinhos receptores usando um glucómetro portátil.
Etapas críticas dentro deste protocolo incluem a idade de BDC2.5 doador e ratos destinatário NOD.SCID. Usando jovens BDC2.5 camundongos (6 semanas) irá garantir que eles são livres de diabetes e que a freqüência de ambos enendógenas células T não-transgênicos e células Treg são baixos, como apontado acima. É também importante a utilização de jovens (<12 semanas) ratinhos NOD.SCID como ratinhos receptores, porque esta estirpe é propenso ao desenvolvimento de timoma que se manifestam após 20 semanas de idade e 24 podem confundir T1D desenvolvimento após a transferência adoptiva de células T.
Futuras aplicações do método descrito incluem a investigação em células CD4 T mecanismos mediadas por células da patogênese DM1 e novas estratégias de intervenção selectiva na indução da doença, o que não é viável em humanos.
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Disclosures
Todos os animais foram alojados na Penn State College of livre de patógenos instalação específica Medicine (SPF), de acordo com as diretrizes da Penn State Institutional Animal Care e do Comitê Use.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos drs. Robert Bonneau e Neil Christensen pelos comentários úteis.
Este trabalho foi apoiado pela Pennsylvania State University College of Medicine fundos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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