Summary
Nous fournissons une méthode reproductible pour induire un diabète de type 1 (DT1) chez la souris dans les deux semaines par le transfert adoptif de l'îlot spécifiques de l'antigène, CD4 + primaires des cellules T.
Abstract
Les diabétiques (NOD) souris non obèses se développe spontanément diabète auto-immun après 12 semaines d'âge et est le modèle le plus largement étudié animal humain de type 1 du diabète (DT1). études sur le transfert des cellules dans des souris receveuses irradiées ont établi que les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du DT1 dans ce modèle. Nous décrivons ici une méthode simple pour rapidement induire une DT1 par transfert adoptif de purifié, CD4 + primaires des cellules T de souris NOD pré-diabétiques transgéniques pour le récepteur des cellules T îlot spécifique (TCR) BDC2.5 dans des souris receveuses NOD.SCID. Les principaux avantages de cette technique sont que l'isolement et le transfert adoptif de lymphocytes T diabétogéniques peut être complété dans le même jour, l'irradiation des bénéficiaires n'est pas nécessaire, et une forte incidence de diabète de type 1 est provoqué dans les 2 semaines après le transfert de cellules T. Ainsi, les études sur la pathogenèse et les interventions thérapeutiques dans le DT1 peuvent se réaliser à un rythme plus rapide que les méthodes qui s'appuient sur des populations de cellules T hétérogènes ou des clonesprovenant de souris NOD diabétiques.
Introduction
La souris NOD développe un diabète auto-immune spontanément et a été largement utilisé comme modèle animal pour 1,2 DT1 humaine. Pathogenèse du DT1 chez les souris NOD est caractérisée par l'infiltration, à partir de 3-4 semaines d'âge, des îlots de Langerhans du pancréas par les cellules dendritiques et les macrophages, suivis par les cellules T et B. Cette phase de non-destructive péri-insulite conduit à une lente destruction progressive des cellules β pancréatiques productrices d'insuline, entraînant un diabète patent de 4-6 mois d'âge de 3 ans. Transfert de splénocytes 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 lymphocytes T de souris NOD diabétiques ont été montrés à la médiation du diabète chez la souris NOD immunodéprimés, ce qui indique que les cellules T îlots réactifs jouent un rôle central dans la pathogenèse du DT1. Selon les conditions expérimentales, le diabète développé dans les souris receveuses lentement, sur plusieurs semaines dans ces études. De même, les différents clones de lymphocytes T, dérivé par le temps et coûteuseculture de cellules T diabétogéniques, ont été signalés à la médiation diabète plusieurs semaines après transfert dans des souris receveuses 7,10. Avec la disponibilité de souris transgéniques exprimant des TCR dérivées de CD4 ou des clones de lymphocytes T CD8 diabétogéniques restriction, plusieurs laboratoires ont ensuite montré que les cellules T spléniques de ces souris ont été en mesure de transférer le diabète aux bénéficiaires 11-13. Plus précisément, BDC2.5 souris NOD sont transgéniques pour le TCR BDC2.5, qui est spécifique de la chromogranine A, une protéine dans les cellules bêta du pancréas 14-16. Le transfert de cellules en non activées rate entières ou fractionnées de diabétiques ou prédiabétiques ouvertement BDC2.5 souris transférés diabète de souris NOD néonatales ou immunodéficientes à des efficacités variables 11,17-19 vitro activé ou.
Nous décrivons une méthode simple qui utilise CD4 + purifiés transgéniques cellules T de pré-diabétiques BDC2.5 souris pour induire le DT1 dans les souris receveuses à haut rendement et Consistence. Un grand nombre d'îlots de Langerhans, naïfs CD4 + spécifiques d'un antigène des cellules T sont isolés à partir de ces souris par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour CD4 + CD62L + des cellules T exprimant la chaîne TCR transgénique Vβ4. Les cellules T transgéniques purifiés sont ensuite transférés dans des souris sans activation NOD.SCID, qui manquent T fonctionnelles et les lymphocytes B et sont sans diabète insulite et 20. Les souris receveuses sont surveillés pour des concentrations élevées de glucose dans l'urine indiquant DT1, qui se développe rapidement dans les deux semaines après le transfert de cellules T.
Contrairement à d'autres méthodes qui transfèrent des cellules T diabétogéniques avec des spécificités hétérogènes, notre protocole utilise triées par FACS cellules T CD4 + qui expriment presque exclusivement le diabetogenic BDC2.5 TCR. En raison de leur homogénéité, seul un petit nombre de cellules T transférées (~ 1x10 6 cellules / souris) sont nécessaires pour le développement du DT1 rapide dans les 2 semaines à 100% d'incidence. Un autre avantage de notre protocole est que irradiation des souris receveuses n'est pas nécessaire que ce soit pour d'autres méthodes. Une limitation potentielle de cette méthode est qu'elle ne permet pas à l'enquête sur la contribution des deux CD4 et CD8 sous-ensembles de cellules T CD8 ou spécifiquement les lymphocytes T dans le diabète.
Le protocole décrit sera utile pour étudier le développement rapide DT1, médiée par les naïfs CD4 monospécifiques cellules T, ainsi que des stratégies thérapeutiques pour intervenir dans homing des cellules Th spécifiques de l'antigène îlots à l'organe cible.
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Protocol
1. Isolement des cellules T de la rate et des ganglions lymphatiques de souris BDC2.5
- Utilisez 6 semaines d'âge pré-diabétiques féminins BDC2.5 souris en tant que donneurs de cellules CD4 + lymphocytes T diabétogéniques. Souris doivent être sans diabète telle que déterminée par la mesure de la glycosurie (voir ci-dessous).
- Euthanasier chaque souris en utilisant le CO 2 asphyxie et enlever la rate, axillaires et brachial ganglions lymphatiques dans des conditions stériles. Pour enlever la rate, faire tremper la fourrure à l'éthanol 70%, puis les couper et retirer la peau. La rate est visible en tant qu'organe rouge foncé sur le côté gauche de la souris. Faire une incision de 1 pouce dans le péritoine à l'aide des petits ciseaux et de saisir la rate doucement dans le centre d'une paire de petites pinces. Couper délicatement le tissu conjonctif et la graisse attachée autant que possible et enlever la rate.
- Recueillir les rates et les ganglions lymphatiques dans 10 ml moyen de Dulbecco's-Modified Eagle (DMEM) dans un tube conique de 15 ml sur la glace.
- Préparer une suspension cellulaire unique en utilisant èmee fin d'une seringue de 10 ml piston stérile pour appuyer doucement sur les organes lymphoïdes à travers 70 filtres cellulaires um (une rate par crépine et 4-6 ganglions lymphatiques par filtre) dans le même tube conique de 50 ml.
Pendant le processus, rincer chaque crépine avec 1 ml de DMEM plusieurs fois afin de maximiser la récupération des cellules de la crépine.
- Transférer les cellules sont prélevées du tube conique de 50 ml dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300-400 g pendant 7 min à température ambiante.
- Pour lyse des globules rouges, éliminer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 5 ml Le chlorure de potassium-(ACK) tampon (pH 7,2), et incuber la suspension ACK-cellule à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter 10 ml de DMEM à la suspension ACK-cellules et centrifuger le tube comme ci-dessus. Laver le culot cellulaire une fois dans 10 ml de DMEM.
2. Le tri cellulaire activé par fluorescence des cellules CD4 + T Cells diabétogéniques de BDC2.5 Souris
- Re-suspendre les cellules dans 5 ml FACS scontenant un tampon et de compter le nombre de cellules viables (en utilisant un microscope à contraste de phase et un hémocytomètre) par colorant bleu trypan exclusion.
- En utilisant un tampon FACS, régler le volume de la suspension cellulaire à 5 x 10 7 cellules / ml. Retirer ~ 1 x 10 6 cellules par le contrôle de la coloration (1 NO, 3 taches simples taches). Colorer l'échantillon de CD4 transgéniques non activés cellules T avec des anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) et anti-CD62L (PE) anticorps monoclonaux (mAb) dans un tube de 15 ml. Effectuer coloration des cellules en utilisant les concentrations mAb suggérés par le fabricant pour 20-30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver l'échantillon et des contrôles simples tache avec du tampon FACS à> 3X le volume de la réaction de coloration. Centrifuger le tube à 300-400 xg, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS (1-2 x 10 7 cellules / ml pour le tri des échantillons et 300 pi pour les contrôles tache unique) et magasins sur la glace jusqu'à la prochaine étape.
- Passer l'échantillon de cellules à travers une cellule de 35 umTube cap passoire pour enlever des amas de cellules. Trier les échantillons de CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellules sur un trieur de cellules avec un opérateur qualifié. Recueillir les cellules triées dans 3 ml DMEM dans un tube de 15 ml. Laisser 2,5-3 h, y compris la configuration, pour trier 1,5 x 10 8 cellules (le nombre approximatif de cellules obtenues à partir de 3 souris donneuses) à un taux de tri de 2 x 4 au total 10 événements / sec. Attendez-vous à ~ 2,5 x 10 6 cellules CD4 transgéniques non activés + T cellules par souris après tri cellulaire.
- Notez le nombre absolu de cellules triées à la fin de la sorte et centrifuger les pendant 7 min à 300-400 g. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules (2 x 10 6 cellules / ml) dans stérile tampon phosphate salin (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + libre) pour le transfert de cellules T adoptive.
3. Le transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques de BDC2.5 Souris
- Utiliser une seringue de 1 ml et une ½ aiguille de calibre 18-1, doucement remettre en suspension les cellules CD4 + purifiées par FACSLymphocytes T et charger la seringue de 1 ml. En préparation pour injection, remplacer le 18-1 ½ aiguille de la jauge avec un 27 ½ aiguille de la jauge.
- Expose 6-8 semaines, âgé de souris receveuses NOD.SCID femmes à une lampe chauffante jusqu'à ce qu'ils ont un comportement de toilettage.
- Restrain souris receveuses dans un dispositif de retenue et essuyer leur queue avec 70% (v / v) d'éthanol pour désinfecter le site d'injection.
- Injecter 1-2 x 10 6 FACS __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ cellules / souris triés (dans un maximum de 500 pi de PBS) dans l'une des veines de la queue latérales.
Ne forcez pas le piston. Si l'aiguille se trouve de manière appropriée dans la veine, l'injection aura lieu pratiquement sans résistance.
4. Suivi des souris receveuses pour Hyperglycémie et diabète de type 1
- Commençant cinq jours après le transfert de cellules T, les souris receveuses NOD.SCID sont surveillées quotidiennement pour le glucose urinaire élevée en utilisant des bandelettes réactives (Bayer Diastix) selon les instructions du fabricant. Souris avec deux urin consécutivelectures de glucose E> 250 mg / dl sont considérés comme diabétique.
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Representative Results
Nos résultats montrent l'isolement des cellules transgéniques exprimant CD62L BDC2.5, ce qui est essentiel pour les cellules T à la maison vers les organes lymphoïdes secondaires comme les ganglions lymphatiques pancréatiques. Nos résultats démontrent en outre la capacité puissante de cette population de cellules T monospécifiques de transférer rapidement et efficacement à DT1 souris receveuses NOD.SCID.
Isolement de CD4 diabétogéniques cellules T de souris BDC2.5 est montré à la figure 2. Environ 5 x 10 7 cellules de rate en commun et les ganglions lymphatiques ont été obtenus par souris donneuse avant le tri cellulaire. Après le tri par cytométrie de flux, ~ 2.5 x 10 6 cellules CD4 + naïves transgéniques cellules T (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) ont été obtenus à partir de chaque souris BDC2.5 des bailleurs de fonds à l'aide de la stratégie de déclenchement indiqué.
Comme prévu, le transfert adoptif d'un petit nombre de cellules CD4 + TCR Vβ4 + + cellules CD62L (~ 1 x 10 6 cellules / souris) de BDC2.5 souris donneuses induite par le DT1 dans tous les re NOD.SCID excipients (100% d'incidence) au jour 11, tel que déterminé par les niveaux élevés de glucose dans l'urine (figure 3). En comparaison, le transfert des hétérogène CD3 + BDC2.5 cellules T nécessaire 3-5 fois plus de cellules pour induire le DT1 dans 80% des destinataires NOD.SCID de 3 semaines 21.
Ces données démontrent que le transfert adoptif d'un petit nombre de FACS-purifiées BDC2.5 CD4 des cellules transgéniques + CD62L + T chez la souris NOD.SCID induites DT1 plus rapidement et plus efficacement.
Figure 1. Déroulement des faits expérimentaux. Rate et les ganglions lymphatiques ont été recueillies à partir de BDC2.5 souris. CD4 + naïves transgéniques cellules T (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) ont été isolés par FACS. Les cellules T ont été remises en suspension dans PBS et injectées par voie intraveineuse chez des receveurs NOD.SCID, qui ont ensuite été suivis pendant glucose dans l'urine élevée indiquant DT1.
Figure 2. stratégie d'ouverture de porte de CD4 de tri + TCR Vβ4 + CD62L + cellules noeud dérivés rate et des ganglions de BDC2.5 souris par FACS. Une suspension à cellule unique de la rate communs et les ganglions lymphatiques ont été colorées avec des anti-CD4 marqués par fluorescence (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC) et anti-CD62L (PE) MAB. Le tracé de points sur la gauche montre les CD4 + TCR Vβ4 + population de cellules qui a été utilisé à la porte des cellules de + CD62L, présentés dans le dot plot droit. Coffret cellules représentent des pourcentages de populations de cellules fermées.
Figure 3. Le transfert adoptif de lymphocytes CD4 + lymphocytes T diabétogéniques. FACS isolé CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellules de BDC2.5 souris ont été injectés par voie intraveineuse (1,3 x 10 6 cellules / souris) dans des souris receveuses NOD.SCID (n = 5). Souris were surveillée pour DT1 en mesurant les concentrations de glucose dans l'urine chez les receveurs. Souris avec deux lectures consécutives de> 250 mg / dl ont été considérées comme diabétiques.
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Discussion
DT1 peut être induite chez la souris bénéficiaires à des efficacités variables par transfert adoptif de cellules de rate entières ou des sous-ensembles de lymphocytes T de souris NOD diabétiques ou les souris transgéniques pour le TCR provenant de clones de lymphocytes T diabétogéniques. Nous rapportons ici une méthode reproductible pour induire le DT1 dans les souris receveuses dans les deux semaines à 100% d'incidence en transférant FACS purifiés CD62L + BDC2.5 CD4 + lymphocytes T transgéniques dans des souris NOD.SCID.
Les avantages spécifiques de la T modèle de transfert de cellules BDC2.5 décrites ici comprennent le temps d'induction très court de DT1 par rapport aux mois pour le diabète spontané et jusqu'à plusieurs semaines pour le transfert du diabète par des sous-ensembles de cellules T diabétogéniques ou des clones de lymphocytes T. En outre, en raison de leur homogénéité, seul un petit nombre de cellules transgéniques BDC2.5 T purifiée sont nécessaires pour transférer le DT1 avec une grande efficacité et de cohérence. Contrairement à d'autres méthodes de transfert de cellules T, l'activation in vitro des cellules T transgéniques BDC2.5 avant de transfer n'est pas nécessaire dans notre protocole. Un autre avantage de notre méthode de transfert de cellules T monospécifiques, c'est que les nouvelles stratégies thérapeutiques pour intervenir dans le homing des lymphocytes T spécifiques de l'antigène îlot à l'organe cible peut être étudiée de manière plus sélective qu'avec d'autres protocoles que le diabète de transfert des populations de lymphocytes T hétérogènes.
Une limitation potentielle de notre méthode est qu'elle n'est pas adaptée pour déterminer la contribution des deux CD4 + et CD8 + de cellules T dans la pathogenèse du DT1 car monospécifiques, CD4 diabétogéniques cellules T sont utilisés pour transférer le diabète.
En l'absence d'un instrument FACS, BDC2.5 cellules transgéniques T peuvent être isolés par la colonne de purification utilisant PE-anticorps anti-TCR Vβ4 MAB et des billes magnétiques anti-PE suivie de CD4 + CD62L + billes magnétiques (Miltenyi).
Il convient de noter que FACS-purifiée, ainsi que les cellules T colonne purifié, comprendra une population minoritaire de cellules T CD4 + eà ne pas exprimer le TCR transgénique en raison de l'exclusion allélique incomplète des gènes du TCR endogènes 15. La fraction de cellules T purifiées peuvent également inclure des CD4 + CD25 + Treg susceptibles d'empêcher le développement du DT1 chez les receveurs. Comme les deux populations de cellules T ont été rapportés à augmenter en BDC2.5 souris avec l'âge, nous recommandons d'utiliser BDC2.5 souris qui n'ont pas plus de 6 semaines 22,23. CD4 + CD25 + Treg peuvent également être exclus de BDC2.5 cellules T par FACS de tri ou de séparation avec CD4 + CD25 + billes magnétiques (Miltenyi) dans les anciens BDC2.5 souris.
En variante, ou en plus de la surveillance DT1 par des mesures de glucose dans l'urine, les niveaux de glucose dans le sang peuvent être déterminées avec plus de précision dans les souris receveuses à l'aide d'un glucomètre portatif.
Les étapes critiques au sein de ce protocole comprennent l'âge de BDC2.5 donateurs et les souris receveuses NOD.SCID. Utiliser jeunes BDC2.5 souris (6 semaines) sera de s'assurer qu'ils sont sans diabète et que la fréquence des deux encellules T non transgéniques endogènes et les cellules Treg sont faibles, comme l'a souligné ci-dessus. Il est également important d'utiliser des souris jeunes (<12 semaines) NOD.SCID que les souris receveuses parce que cette souche est enclin à développer thymomes qui se manifestent après 20 semaines de 24 ans et peut confondre développement DT1 après le transfert de cellules T adoptive.
Les futures applications de la méthode décrite incluent enquête en T CD4 des mécanismes à médiation cellulaire de la pathogenèse du DT1 et de nouvelles stratégies d'intervention sélective dans l'induction de la maladie, ce qui n'est pas possible chez les humains.
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Disclosures
Toutes les souris ont été logées à la Penn State College of Medicine établissement exempt d'agents pathogènes (SPF) spécifique en conformité avec les lignes directrices de la Penn State Institutional Animal Care et utiliser Comité.
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs. Robert Bonneau et Neil Christensen pour leurs commentaires utiles.
Ce travail a été soutenu par la Pennsylvania State University College de fonds de la médecine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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