Summary
Vi tilbyr en reproduserbar metode for å indusere type 1 diabetes (T1D) i mus innen to uker etter at adoptiv overføring av holmen antigen-spesifikke, primære CD4 + T celler.
Abstract
Den nonobese diabetiker (NOD) mus utvikler spontant autoimmune diabetes etter 12 ukers alder og er den mest omfattende studert dyremodell av menneskelig Type 1 diabetes (T1D). Cell overføre studier i bestrålte mottaker mus har fastslått at T-cellene er sentrale virkemidler T1D patogenesen i denne modellen. Vi beskriver her en enkel metode for å raskt gi muligheter T1D av adoptiv overføring av renset, primære CD4 + T celler fra pre-diabetes NOD mus transgene for holmen-spesifikke T-celle reseptor (TCR) BDC2.5 inn NOD.SCID mottaker mus. De største fordelene med denne teknikken er at isolasjon og adoptiv overføring av diabetogenic T-celler kan gjennomføres innen samme dag, er bestråling av mottakerne ikke nødvendig, og en høy forekomst av T1D er fremkalte innen to uker etter at T celle overføring. Dermed kan studier av patogenese og terapeutiske intervensjoner i T1D fortsette i et raskere tempo enn med metoder som er avhengige av heterogene T celle populasjoner eller kloneravledet fra diabetiske NOD mus.
Introduction
Den NOD mus utvikler autoimmune diabetes spontant og har vært mye brukt som en dyremodell for human T1D 1,2. Pathogenesis av T1D i NOD mus er preget av infiltrasjon, som begynner ved 3-4 ukers alder, av bukspyttkjertelen holmer av Langerhans av dendrittiske celler og makrofager, etterfulgt av T og B-celler. Denne fasen av ikke-destruktiv peri-insulitis fører til en langsom, progressiv ødeleggelse av insulin-produserende bukspyttkjertelen β-celler, noe som resulterer i overt diabetes ved 4-6 måneders alder tre. Overføring av splenocytes 4,5, CD4 + 6,7 eller CD8 + 8,9 T celler fra diabetiske NOD mus har vist seg å megle diabetes hos immunsupprimerte NOD mus, noe som indikerer at holme-reaktive T-celler spiller en sentral rolle i T1D patogenesen. Avhengig av eksperimentelle forhold, utviklet diabetes i mottakerlandene mus sakte, over flere uker i disse studiene. Tilsvarende ulike T-celle kloner, avledet av tidkrevende og kostbaredyrking av diabetogenic T-celler, har blitt rapportert å megle diabetes flere uker etter overføring til mottaker mus 7,10. Med tilgjengeligheten av transgene mus som uttrykker TCR avledet fra CD4-eller CD8-restricted diabetogenic T-celle kloner, flere laboratorier har i ettertid vist at spleniske T-celler fra slike mus var i stand til å overføre diabetes til mottakere 11-13. Spesielt BDC2.5 NOD mus er transgene for BDC2.5 TCR, som er spesifikk for kromogranin A, et protein i betaceller i bukspyttkjertelen 14-16. Overføring av in vitro-aktivert eller un-aktiverte hele eller fraksjonert miltceller fra åpenlyst diabetiker eller prediabetic BDC2.5 mus overført diabetes til nyfødte eller immunodeficient NOD mus ved varierende effektivitet 11,17-19.
Vi beskriver en enkel metode som benytter renset transgene CD4 + T celler fra pre-diabetes BDC2.5 mus å indusere T1D i mottakerlandene mus med høy effektivitet og consisteNCY. Et stort antall naive, holmen antigen-spesifikke CD4 + T celler er isolert fra disse musene av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for CD4 + CD62L + T celler som uttrykker transgene TCR Vβ4 kjeden. Renset transgene T-celler blir deretter overført uten aktivering inn NOD.SCID mus, som mangler funksjonelle T-og B-celler og er insulitis-og diabetes-fri 20.. Mottakeren mus overvåkes for forhøyede konsentrasjoner av urin glukose indikerer T1D, som utvikler seg raskt innen to uker etter at T-celle overføring.
I motsetning til andre metoder som overfører diabetogenic T-celler med heterogene særegenheter, bruker vår protokoll FACS-sortert CD4 + T celler som nesten utelukkende uttrykker diabetogenic BDC2.5 TCR. På grunn av homogenitet deres, er bare et lite antall overførte T-celler (~ 1x10 6 celler / mus) som kreves for rask T1D utvikling innen 2 uker med 100% insidens. En annen fordel med protokollen vår er at irradiation av mottaker-mus er ikke nødvendig, fordi det er for enkelte andre metoder. En potensiell begrensning med denne metoden er at den ikke tillater etterforskningen av bidrag fra både CD4 og CD8 T-celle undergrupper eller spesielt CD8 T-celler i diabetes.
Den beskrevne protokollen vil være nyttig for å studere rask T1D utvikling, formidlet av naive, monospesifikke CD4 + T celler, samt terapeutiske strategier for å gripe inn i homing av holmen antigen-spesifikke Th celler til målorganet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Isolering av T-celler fra milt og lymfeknuter av BDC2.5 Mus
- Bruk seks uker gamle pre-diabetes kvinnelige BDC2.5 mus som givere av diabetogenic CD4 + T celler. Mus bør være diabetes-fri som bestemt ved måling av glukose i urinen (se nedenfor).
- Avlive hver mus ved hjelp av CO 2 kvelning og fjerne milten, armhule og brachialis lymfeknuter under sterile forhold. For å fjerne milten, suge pels med 70% etanol, og deretter klippe og trekke huden. Milten vil være synlig som en mørk rød organ på venstre side av musen. Gjør en en-tommers snitt i peritoneum ved hjelp av liten saks og forsiktig tak milten i midten med et par små pinsett. Skjær forsiktig bindevev og festet fett så mye som mulig og fjerne milten.
- Samle miltene og lymfeknuter i 10 ml Dulbecco's-modifiserte Eagles medium (DMEM) i et 15 ml konisk rør på is.
- Forbered en enkelt celle suspensjon ved å bruke the slutten av en steril 10 ml sprøyte stempelet å trykke forsiktig de lymfoide organer gjennom 70 mikrometer celle siler (ett milt per sil og 4-6 lymfeknuter per sil) i den samme 50 ml konisk tube.
Under prosessen, skyller hver sil med 1 ml DMEM flere ganger for å maksimere utvinningen av celler fra silen.
- Overføre de innsamlede celler fra 50 ml konisk rør inn i et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 300-400 x g i 7 min ved RT.
- For å lysere røde blodceller, kast supernatanten, resuspendere cellene i 5 ml ammonium-klorid-Kalium (ACK) buffer (pH 7,2), og inkuber ACK-cellesuspensjon ved RT i 5 min.
- Tilsett 10 ml DMEM til ACK-cellesuspensjon og sentrifuger røret som ovenfor. Vask cellepelleten gang i 10 ml DMEM.
2. Fluorescens-aktivert celle sortering av diabetogenic CD4 + T celler fra BDC2.5 Mus
- Re-suspendere celler i 5 ml FACS sopprettholde buffer og telle antallet levedyktige celler (ved hjelp av et fasekontrastmikroskop, og et hemocytometer) ved trypan blå eksklusjon fargestoff.
- Ved hjelp av FACS-buffer, justere cellesuspensjon volum til 5 x 10 7 celler / ml. Fjern ~ 1 x 10 6 celler per flekker kontroll (en ingen flekken, 3 enkle flekker). Flekk prøven til ikke-transgene aktiverte CD4 + T-celler med anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC), og anti-CD62L (PE) monoklonale antistoffer (mAb) i et 15 ml rør. Utfør cellefarging hjelp av MTB konsentrasjoner foreslått av produsenten for 20-30 min ved 4 ° C i mørket.
- Vask prøven og enkelt flekken kontroller med FACS buffer ved> 3x farvereaksjon volum. Sentrifuger røret på 300-400 xg, fjern supernatanten og re-suspendere cellene i FACS buffer (1-2 x 10 7 celler / ml for sortering prøven og 300 mL for enkelt flekken kontroller) og lagre på is frem til neste trinn.
- Pass cellen prøven gjennom en 35 mikrometer cellesil cap røret for å fjerne celle klumper. Sortere prøvene for CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler på en celle sorter med en trenet operatør. Samle de sorterte celler i 3 ml DMEM i en 15 ml tube. Tillate 2,5-3 timer, inkludert oppsett, for å sortere 1,5 x 10 8 celler (omtrentlig antall celler hentet fra tre donor mus) på en slags hastighet på 2 x 10 4 totalt hendelser / sek. Forvent ~ 2,5 x 10 6 ikke-aktiverte transgene CD4 + T celler per mus etter celle sortering.
- Ta opp det absolutte antallet sorterte cellene ved slutten av den typen og sentrifuger dem i 7 minutter ved 300-400 x g. Kast supernatanten og resuspendere cellene (2 x 10 6 celler / ml) i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) (Mg 2 + / Ca2 + fri) for adoptive T-celle-overføringen.
3. Adoptiv Overføring av diabetogenic CD4 + T celler fra BDC2.5 Mus
- Bruk en 1 ml sprøyte og en 18-1 ½ gauge nål, forsiktig re-suspendere FACS-rensede CD4 +T-celler og laste 1 ml sprøyte. I forberedelsene til injeksjon, erstatte 18-1 ½ gauge nål med en 27 ½ kanyle.
- Expose 6-8 uker gamle kvinnelige NOD.SCID mottaker mus til en varmelampe før det på sommerstid grooming atferd.
- Beherske mottaker mus i en restrainer og tørk halen med 70% (v / v) etanol å desinfisere injeksjonsstedet.
- Injisere 1-2 x 10 6 FACS sortert celler / mus (i opp til 500 mL PBS) i hver av de laterale halevenen.
Ikke tving stempelet. Hvis nålen er plassert på riktig måte i venen, vil injeksjonen foregå med nesten ingen motstand.
4. Overvåking Mottaker Mus for hyperglykemi og T1D
- Fra og fem dager etter T-celle overføring, er NOD.SCID mottaker mus overvåkes daglig for forhøyet urin glukose ved hjelp reagens strimler (Bayer Diastix) i henhold til produsentens instruksjoner. Mus med to etterfølgende urine blodsukkeravlesninger> 250 mg / dl anses diabetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre resultater viser isolering av transgene BDC2.5 celler uttrykker CD62L, som er avgjørende for T-celler til hjem til sekundære lymfoide organer som bukspyttkjertelen lymfeknuter. Våre funn ytterligere demonstrere potent evne til denne monospesifikke T cellepopulasjonen å overføre raskt og effektivt T1D til NOD.SCID mottaker mus.
Isolering av diabetogenic CD4 + T celler fra BDC2.5 mus er vist i figur 2.. Ca 5 x 10 7 celler fra sammenslåtte milt og lymfeknuter ble innhentet per donor mus før celle sortering. Etter flowcytometrisk sortere, ~ 2,5 x 10 6 naive transgene CD4 + T celler (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) ble innhentet fra hver BDC2.5 donor mus ved å bruke den angitte gating strategi.
Som forventet, adoptiv overføring av små mengder CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler (~ 1 x 10 6 celler / mus) fra BDC2.5 donor mus indusert T1D i alt NOD.SCID re mottakere (100% utbredelse) ved dag 11, som bestemmes av forhøyede nivåer av glukose i urinen (figur 3). Til sammenligning overføring av heterogene CD3 + BDC2.5 T-celler kreves 3-5 fold flere celler for å indusere T1D i 80% NOD.SCID mottakere av 3 uker 21.
Disse dataene viser at adoptiv overføring av små mengder FACS-rensede BDC2.5 transgene CD4 + CD62L + T celler i NOD.SCID mus indusert T1D raskere og mer effektivt.
Figur 1. Sekvens av eksperimentelle hendelser. Spleen og lymfeknuter ble samlet inn fra BDC2.5 mus. Naive transgene CD4 + T celler (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +) ble isolert ved FACS. T-celler ble re-suspendert i PBS og injisert intravenøst i NOD.SCID mottakere, som senere ble overvåket for forhøyet urin glukose indikerer T1D.
Figur 2. Gating strategi for å sortere CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + milt og lymfeknute-deriverte celler fra BDC2.5 mus ved FACS. En encellet suspensjon av sammenslåtte milt og lymfeknuter ble farget med fluorescently-merket anti-CD4 (APC), anti -TCR Vβ4 (FITC), og anti-CD62L (PE) mAb. Punktet tomten til venstre viser CD4 + TCR Vβ4 + cellen befolkningen som ble brukt til gate de CD62L +-celler, som vises i høyre prikk tomten. Eske celler representerer prosentandeler av gated celle populasjoner.
Figur 3. Adoptiv overføring av diabetogenic CD4 + T celler. FACS-isolerte CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + celler fra BDC2.5 mus ble intravenøst injisert (1,3 x 10 6 celler / mus) i NOD.SCID mottaker mus (n = 5). Mus were overvåkes for T1D ved måling av glukose i urinen konsentrasjoner i resipientene. Mus med to påfølgende målinger av> 250 mg / dl ble vurdert diabetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D kan induseres i mottakerlandene mus med varierende effektivitet ved adoptiv overføring av hele milt celler eller T-celle undergrupper fra diabetiske NOD mus eller mus transgene for TCR avledet fra diabetogenic T-celle kloner. Vi rapporterer her en reproduserbar metode for å indusere T1D i mottakerlandene mus i løpet av to uker på 100% insidens ved å overføre FACS-rensede CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T celler i NOD.SCID mus.
Spesifikke fordeler ved BDC2.5 T-celle overføring modell som er beskrevet her inkluderer meget kort induksjonstid på T1D forhold til måneder for spontan diabetes og opptil flere uker for diabetes transfer av diabetogenic T-celle-undergrupper eller T-celle-kloner. I tillegg, på grunn av deres homogenitet, blir bare små mengder renset BDC2.5 transgene T-celler ved å overføre et T1D med høy virkningsgrad og konsistens. I motsetning til enkelte andre T-celle-overføringsmetoder, in vitro-aktivering av transgene BDC2.5 T-celler før transfer er ikke nødvendig i protokollen vår. En annen fordel med vår monospesifikke T celle overføring metoden er at nye terapeutiske strategier for å gripe inn i homing av holme antigen-spesifikke T celle til målet organ kan undersøkes mer selektivt enn med andre protokoller som overfører diabetes med heterogene T celle populasjoner.
En potensiell begrensning av vår metode er at den ikke er egnet til å bestemme bidraget av både CD4 + og CD8 + T-celle undergrupper i T1D patogenesen fordi monospesifikke, diabetogenic CD4 + T-celler blir brukt til å overføre diabetes.
I fravær av et FACS instrument, kan BDC2.5 transgene T-celler isoleres ved kolonne-rensing ved hjelp av PE-merket anti-TCR Vβ4 mAb og PE-anti-magnetiske kuler etterfulgt av CD4 + CD62L + magnetiske kuler (Miltenyi).
Det bør bemerkes at FACS-renset, så vel som en kolonne-rensede T-celler, vil inneholde en mindre populasjon av CD4 + T-celler thved ikke uttrykke den transgene TCR grunn av ufullstendig allelisk utelukkelse av endogene TCR gener 15. Den rensede T celle brøkdel kan også omfatte CD4 + CD25 + Treg celler som kan undertrykke T1D utviklingen i mottakere. Siden både T-celle populasjoner har blitt rapportert å øke i BDC2.5 mus med alderen, anbefaler vi å bruke BDC2.5 mus som ikke er eldre enn seks uker 22,23. CD4 + CD25 + Treg celler kan alternativt bli ekskludert fra BDC2.5 T celler ved FACS-sortering eller separasjon med CD4 + CD25 + magnetiske kuler (Miltenyi) i eldre BDC2.5 mus.
Alternativt, eller i tillegg til T1D overvåkning av glukose i urinen målinger, kan blodglukosenivået bestemmes mer nøyaktig i mottaker-mus ved anvendelse av en håndholdt glucometer.
Kritiske trinnene i denne protokollen omfatter en alder av BDC2.5 donor og NOD.SCID mottaker mus. Ved hjelp av små BDC2.5 mus (6 uker) vil sikre at de er fri-diabetes, og at frekvensen av begge en-dogenous ikke-transgene T-celler og Treg celler er lav, som påpekt ovenfor. Det er også viktig å bruke unge (<12 uker) NOD.SCID mus som mottaker mus fordi denne belastningen er utsatt for å utvikle thymomas som manifesterer seg etter 20 ukers alder 24 og kan forvirre T1D utvikling etter adoptiv T celle overføring.
Fremtidige anvendelser av den beskrevne metode omfatter undersøkelse i CD4 T-celle-medierte mekanismer av T1D patogenese og nye strategier for å gripe selektivt inn sykdom induksjon, noe som ikke er mulig hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle musene ble plassert på Penn State College of Medicine spesifikk patogen-fri (SPF) anlegg i samsvar med retningslinjene fra Penn State Institutional Animal Care og bruk komité.
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker legene. Robert Bonneau og Neil Christensen for nyttige kommentarer.
Dette arbeidet ble støttet av Pennsylvania State University College of Medicine midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
