膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

Summary

膵臓癌生物学の理解の向上は非常に重要膵臓癌を治療するための良好な治療選択肢の開発を可能にするために必要とされる。このニーズに対応するために、我々は使用して癌の進行の非侵襲的なモニタリングを可能に膵臓癌の同所性モデルを示す

Abstract

Introduction

膵臓癌は4〜6％の5年生存率は、癌関連死因の第4位である。患者の^1,2だけが15％、手術の対象になる病気の早い段階で十分に診断され、腫瘍が再発している>でこれらの患者の80％は^3,4ゲムシタビンは、膵臓腺癌の治療に使用されているが、化学療法耐性が一般的であり、多くの場合、薬物は、全体的な生存率にほとんど影響を与えない。膵臓癌を治療するために⁵新しい薬理学的戦略が決定的に必要とされる。その開発は、治療的介入に敏感かもしれない病気の進行の重要なステップの大幅に改善理解に依存します。

膵臓癌の同所性モデルは、膵臓癌の生物学を研究するための理想的なツールがそれらを作り、ヒトの疾患の重要な側面をエミュレートする。膵臓癌細胞の挙動のin vitroでの細胞ベースのアッセイとは対照的に^6-9dは皮下膵臓癌のin vivoモデルにおいて 、同所性モデルは、膵臓腫瘍細胞微小環境との相互作用の調査を可能にする。病気の進行の速度論は同所性モデルで再現性の高いであり、それらはよく小説治療薬の前臨床試験に適しています短い時間枠（週）にわたって生じる。これにより、疾患発症が長く、より可変時間枠（ヶ月〜1年間）にわたって生じるトランスジェニックモデルとは対照的である^。10は、より積極的な細胞株と一緒に使用すると、膵臓癌の同所性モデルは、に見られるものと同様の自然転移のパターンを有する患者はこのようなホタルルシフェラーゼが治療に転移性播種、再発および応答、腫瘍増殖の縦監視を容易にします^。6,11のように生物発光レポーター遺伝子の発現は⁸

ここでは、MATRを利用膵臓癌の同所性モデルを記述腫瘍進行の非侵襲的なモニタリングのためのローカライズされた細胞送達およびin vivoの生物発光イメージングのためのIGEL。膵臓癌の同所このモデルは、疾患の進行および同系移植片または異種移植片モデルにおける治療的介入に対する応答の非侵襲的な分析を可能にする。

Protocol

実証されているプロトコルは、著者の機関の動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行されます。

1。膵臓癌細胞株を形質導入

1. ^12,13 PANC-1。前述したように、ルシフェラーゼ発現させる膵臓癌細胞を形質導入し、ホタルルシフェラーゼを形質導入CAPAN-1膵臓癌細胞株は、ここで使用される。

注：ウミシイタケルシフェラーゼ又は細菌ルシフェラーゼを用いてもよい。

2。膵臓癌細胞の調製

1. 培養は、70％コンフルエントになるまで膵臓癌細胞を形質。
2. 膵臓細胞を持ち上げて、生存能力が90％以上であることを確認してください。
3. チルドマトリゲルの午前3時02混合物中の2×10 ⁷細胞/ mlで再懸濁し：リンSALは、バッファINE（PBS）。
4. 事前の膵臓への注入に、氷上でマトリゲル細胞懸濁物を保管してください。

注：マトリゲルの急冷凝固を確保するために、細胞ペレットの量を考慮して、PBS量を減らす。注入前に凝固を防ぐために、すべての回で氷冷楽器や注射器を使用したマトリゲルを扱う。提案された細胞数がガイドされ、各細胞株に対して経験的に決定されるべきである。

3。マウス準備

1. 2〜3％イソフルラン吸入使用して、マウスを麻酔。穏やかなつま先のピンチにペダル反射の欠如によって麻酔の深さを決定します。
2. 乾燥を防ぐために、目には潤滑剤を適用します。
3. 37°Cの加熱パッドでその背中の上にマウスを置き、そっと腹部の左側を上げるには、マウスの電源を入れます。
4. 10％ポビドンヨード液で腹部を準備します。

注：Injectabル麻酔は吸入麻酔の代わりに使用することができる。術前の絶食は必要ありません。

4。開腹

1. 無菌の手術器具を使用すると、約1cmが正中線からの横方向のままに皮膚は1.5センチ切開を行います。
2. 基礎腹筋1.5センチ切開を行います。
3. ピンセットを用いて脾臓を見つけて、優しく腹腔から脾臓を除去します。基礎膵臓を公開するために滅菌綿棒に沿って脾臓を固定します。
4. 脾臓に隣接した膵尾部の位置を確認します。
5. 29 G 0.3ミリリットルのインスリン注射器を用いて、膵臓にマトリゲル細胞懸濁液20μLを注入します。
6. マトリゲルが固化するまで注入後、30〜60秒のために膵臓でシリンジを保持します。これは重要なステップは、セルの漏れを最小限に抑えます。
7. 漏れが発生していないことを確認するために注射部位を検査します。
8. 腹腔に脾臓と膵臓を返します。

注意：薄いかもしれない膵臓の背側を穿刺しないように注意してください。

5。腹壁閉鎖

1. 連続的なステッチを使用してラウンド針で吸収性編組4-0縫合糸でマウスの腹部の筋肉を閉じます。
2. 連続的なステッチを使用してカッティング針で非吸収性モノフィラメント6-0縫合糸で皮膚外用を閉じます。
3. 吸入麻酔薬と皮下注射0.05 mg / kgでブプレノルフィンからマウスを外します。
4. マウスは、食品や水への無料アクセスを37℃の加温パッド上に置かれ、そのケージに回復することができます。マウスは、このようなハンチングまたは身体障害などの疼痛の兆候を示す場合は、ブプレノルフィンを、36時間かけて12時間毎に与えられてもよい。
5. 創傷治癒（7-10日）の後、マウスを麻酔し、外部の縫合糸を除去する。

6。膵臓CANCの生物発光トラッキングえー進行

1. イソフルラン吸入使用して、マウスを麻酔。
2. 尾静脈を経由して150 mg / kgをD-ルシフェリンを注入。
3. 生物発光イメージングシステムでマウスを置き、前述のように白色光と生物発光の画像をキャプチャします^。14,15は
4. 吸入麻酔からマウスを削除し、それがそのホームケージで回復することができます。

注：生物発光撮像では非侵襲的であり、腫瘍増殖動態を調査するために定期的に実施することができる。膵尾部の画像腫瘍に、その左側にマウスを置くことが重要である、カメラに向かって腫瘍ポイントそう。周波数が前FOV 12.5ビニング4とリビングイメージング4.3.1ソフトウェアを実行ルミナIIイメージングシステム（パーキンエルマー、以前はキャリパーライフサイエンス）を用いた実験のエンドポイントに週3回まで増加したと我々は、週一回撮像するF-ストップ1、露出1から60秒（最高EXPによって決定ピクセル飽和なしosure）。

Representative Results

この方法は、麻酔導入、開腹、マトリゲル、腹部閉止（ 図1A）中の癌細胞の注射を含む外科的処置を用いて膵臓癌の同所性モデルについて説明する。注入された細胞は、膵臓の表面の気泡（ 図1B）を形成する。膵臓癌の進行を非侵襲的に癌細胞の増殖と普及し（ 図2）を追跡するためにインビボ生物発光撮像で使用して監視することができる。肝転移は、外科的切除の間に肝臓における生物発光を観察することにより示される（ 図2）および組織学（ 図4B）によってex vivoで確認した。原発腫瘍は移植後6週間で膵尾部と脾臓を切除した。この同所注入モデルにおける腫瘍増殖のダイナミクスは、再現され、密接にPAの同所移植モデルの動力学に似 ncreaticがん（ 図3）。膵臓の腫瘍の成長は、局所浸潤し、肝臓（ 図4）を含む臓器に転移。

図1。膵臓癌の進行の同所性マウスモデル。）は、i。麻酔したマウスは、テープを使用して所定の位置に固定され、腹部を消毒される。 II。縦開腹後、脾臓と膵臓尾を穏やかに体外され、滅菌綿棒上の場所で開催された。 III。マトリゲルに埋め込まれた膵臓腫瘍細胞は、膵臓の尾部に注入される。 IV。腹部は2層に閉じている。B）拡大画像を体外に脾臓と膵臓を示す。注入された細胞は、バブル（矢印）を形成する。 ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。

図2。生物10日間注射後同所性膵臓腫瘍のイメージング（A）、（B）31日後に注射し、腫瘍切除後の（C）5日間。

図3 PANC-1のインビボ原発腫瘍の成長とその CAPAN-1細胞株は生物発光イメージング（N = 4）で表さ時間（注射後の日数）にわたって監視した。腫瘍増殖の動態を、マトリゲルに埋め込 ​​まれた膵臓腫瘍細胞の注射後膵臓腫瘍の移植片を使用して、同所性モデルと同様である。

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図4。ヘマトキシリンおよび（A）PANC-1一次膵臓腫瘍、およびPANC-1一次膵臓腫瘍から（B）肝転移のエオシン染色切片。周囲の器官への膵臓癌細胞の浸潤ローカル*。

Discussion

ここでは、膵臓腫瘍発生および進行の長手方向の評価のための同所性モデルを記述。原発腫瘍増殖動態は、再現性がある（ 図3）と非侵襲的に新規抗膵臓癌治療に対する腫瘍の応答の分析のために、例えば 、ルシフェラーゼタグ付き細胞の生物発光撮像を用いてモニターすることができる。ヒトの疾患と一致して、モデルは、膵臓微小環境と腫瘍細胞との相互作用の調査を可能にするローカル膵臓侵攻（ 図4A）を示しています。ルシフェラーゼタグ付き細胞株の使用は、転移性播種の周波数、位置および速度論の解析を可能にする。彼らは視覚的に明らかになり、転移の組織局在をex vivoで撮像及び組織学により確認することができる前に、ルシフェラーゼタグ付き細胞株の使用は、転移の検出を容易にする。臨床的状況のように、モデルは、組織への転移を示す腸間膜リンパ節、肝臓、胃腸管および腹膜腔（ 図^4）。8生物発光撮像含むアンスも成功した切除および発生率および原発腫瘍再発の動態（ 図2C）を決定するために使用することができる^。16

入念な準備および膵臓癌細胞の処理は、モデルの再現性に必須である。 PBSにマトリゲルの比は、注射後の細胞ペレットの急速凝固のために最適化されている。ペレット化した細胞（10 ⁷腫瘍細胞は約35μL）の容積はマトリゲルの最後の3時02分比PBSの容積から減算する必要があります：セル+ PBS。注射の間、セル漏れをマトリゲル（ 図1）は固化するまで30〜60秒間その場で針を維持することにより防止される。漏れが発生した場合マトリゲルが着色​​されて、容易に検出され、それらのマウスは、fは除外することができるROMの更なる分析。腫瘍細胞の漏れを防止すると、その転移は、腫瘍細胞の播種からではなく注入法のようなアーチファクトが発生保証する。

腫瘍発生の動態は、細胞数注入し、各細胞株に対して経験的に決定されるべきであることによって影響を受ける。私たちは、4×10 ⁵ PANC-1またはCAPAN-1細胞（ 図3）を注入した後に再現可能な腫瘍の成長パターンを発見した。転移の生物発光を検出するための閾値は、構築物は、プロモーター強度とコドン最適化ルシフェラーゼの使用を含む、使用される式の特性によって影響される。ここで説明異種移植モデルに加えて、技術も、免疫応答性の設定で膵臓の進行を調べるために同系膵臓細胞株を使用することができる。同様の腫瘍ダイナミクスは雄または雌マウス（データは示されていない）で観察された。

方法が記載され、彼再は、膵臓癌の同所移植モデルに変更されている。このモデルでは、腫瘍がドナーマウスの皮下成長させ、次いで、1ミリメートル³個レシピエントマウスの膵臓の尾の小さなポケットに移植する^。6-8,17原発腫瘍の成長がドナー腫瘍を用いて生物発光撮像を用いてモニターすることができるルシフェラーゼタグ付き腫瘍細胞由来。ここで説明する同所性モデルとは対照的に、移植モデルは、追加の時間（最大1ヶ月）とドナー腫瘍の生成のための付加的なマウスが必要です。移植モデルを用いた結果は、移植腫瘍片の不均一な組成によって影響され得る。私たちは、マトリゲル埋細胞の注入後動態は移植モデルに類似していることをここで示した。移植モデルは、臨床患者試料を研究し、拡大するために使用されてきた^。18-21

ここで説明する同所性モデルは、トランスジェニックMを補完プレ侵襲および浸潤膵臓癌の^{odels。10,22,23}トランスジェニックモデルは癌遺伝子の変異を含むヒト膵臓癌の重要な側面を要約するが、疾患発症（> 1歳〜7週）の大幅な変動を示しています^。10,23ほとんどのトランスジェニックモデルが行うルシフェラーゼ発現していので、病気の進行のin vivo生物発光イメージングには適していません。対照的に、膵臓癌の同所性モデルは、腫瘍進行の再現可能な動態を示し、それらが十分に前臨床研究の治療に適した製造、非侵襲的なモニタリングを可能にする。

新しい治療アプローチは決定的に膵臓癌のための非常に低い生存率と戦うために必要である。転移や再発の可視化を可能にすることによって、ここで説明する膵臓癌の同所性モデルは、最新の治療は一時しのぎである臨床、に関連しています。さらに、同所モデルラーニング膵臓腫瘍生物学を調査し、 生体内の設定で新たな治療戦略を評価するために非常に貴重なものです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913