Summary
Uma melhor compreensão da biologia do câncer de pâncreas é criticamente necessário para permitir o desenvolvimento de melhores opções terapêuticas para o tratamento de câncer no pâncreas. Para atender a essa necessidade, nós demonstramos um modelo ortotópico de câncer pancreático que permite o monitoramento não-invasivo de progressão do câncer usando
Abstract
Introduction
O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 4-6%. 1,2 Apenas 15% dos pacientes são diagnosticados logo no início da doença para ser elegível para a cirurgia, e os tumores se repetir em> 80% dos pacientes. 3,4 gemcitabina é utilizada para o tratamento do adenocarcinoma pancreático, no entanto, quimiorresistência é comum e muitas vezes a droga tem pouco impacto na sobrevivência global. cinco novas estratégias farmacológicas para o tratamento de cancro pancreático são urgentemente necessárias. Seu desenvolvimento depende melhorou significativamente a compreensão das principais etapas de progressão da doença que podem ser sensíveis à intervenção terapêutica.
Modelos ortotópico de câncer de pâncreas emular os principais aspectos da doença humana, tornando-as ferramentas ideais para o estudo da biologia do câncer de pâncreas. 6-9 Em contraste com os ensaios in vitro com células de comportamento de células de câncer de pâncreas umad subcutânea modelos in vivo de câncer de pâncreas, os modelos ortotópico permitir a investigação das interações de células tumorais com o microambiente pancreático. A cinética de progressão da doença são altamente reprodutível em modelos ortotópico e ocorrem ao longo de um curto espaço de tempo (semanas), o que os torna adequados para testes pré-clínicos de novas terapias. Isto está em contraste com os modelos transgénicos, onde o início da doença ocorre ao longo de um período mais e mais variáveis de tempo (meses a 1 ano). 10 Quando utilizado com linhas de células mais agressivas, os modelos ortotópicos de cancro do pâncreas têm padrões de metástases espontâneas semelhantes aos observados em pacientes. 8 Expressão de genes repórter bioluminescentes como vaga-lume luciferase facilita o acompanhamento longitudinal do crescimento tumoral, disseminação metastática, recorrência e resposta à terapêutica 6,11.
Aqui nós descrevemos um modelo ortotópico de câncer pancreático que utiliza Matrigel para entrega localizada de células e em imagiologia in vivo de bioluminescência para monitorização não invasiva da progressão do tumor. Este modelo ortotópico de câncer pancreático permite análises não invasivas de progressão da doença e resposta a intervenções terapêuticas em modelos singênicos ou heteróloga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo que está sendo demonstrado é realizada sob a orientação e aprovação de cuidados com os animais da instituição do autor e comitê uso. Todos os experimentos são executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras.
1. Transdução pancreáticas linhas celulares de cancro
- Transduzir as células de cancro do pâncreas para expressar luciferase, tal como descrito anteriormente. 12,13 Panc-1 e Capan-1 linhas de células de cancro pancreático transduzidas com luciferase do pirilampo são usados aqui.
Nota: a luciferase de Renilla, ou luciferase bacteriana podem também ser usados.
2. Pancreatic Cancer celular Preparação
- Cultura transduzidas células de câncer pancreático até 70% confluentes.
- Levante as células pancreáticas e assegurar a viabilidade é superior a 90%.
- Ressuspender a 2 x 10 7 células / ml numa mistura 03:02 de Matrigel refrigerados sal fosfato tamponadoine (PBS).
- Manter a suspensão de células de Matrigel em gelo antes da injecção no pâncreas.
Notas: Para assegurar uma rápida solidificação de Matrigel, reduzir o volume de PBS para ter em conta o volume do sedimento celular. Pega Matrigel utilizando instrumentos gelados e seringas em todos os momentos para evitar a solidificação, antes da injecção. O número de células é sugerido um guia e deve ser determinada empiricamente para cada linha celular.
3. Rato Preparação
- Anestesiar o mouse usando inalado 2-3% de isoflurano. Determinar a profundidade da anestesia por falta de pedal reflexo de uma pitada dedo gentil.
- Aplique lubrificante para os olhos para evitar a dessecação.
- Posicione o mouse sobre a sua volta em uma almofada de aquecimento ° C 37 e vire suavemente o mouse para levantar o lado esquerdo do abdômen.
- Preparar o abdómen com uma solução a 10% de iodo povidona.
Notas: Injectable anestesia pode ser usado em vez da anestesia por inalação. Jejum pré-operatório, não é necessário.
4. Laparotomia
- Usando instrumentos cirúrgicos estéreis fazer uma incisão de 1,5 cm na pele de aproximadamente 1 cm lateral esquerdo da linha média.
- Faça uma incisão de 1,5 cm no músculo abdominal subjacente.
- Mostrar o baço utilizando a pinça e retirar cuidadosamente o baço a partir da cavidade abdominal. Fixe o baço ao longo de um cotonete estéril para expor o pâncreas subjacente.
- Localizar a cauda do pâncreas adjacente ao baço.
- Utilizando uma seringa de 0,3 ml de L insulina 29, injecta-se 20 ul da suspensão de células no pâncreas Matrigel.
- Após a injecção, segure a seringa no pâncreas por 30-60 segundos até que o Matrigel solidificou. Este passo importante minimiza fugas célula.
- Inspecione o local da injeção para garantir que não haja vazamento ocorreu.
- Devolver o baço e pâncreas, na cavidade abdominal.
Nota: Tome cuidado para evitar a perfuração do lado dorsal do pâncreas que pode ser fino.
5. Fechamento da parede abdominal
- Feche a musculatura abdominal do rato com uma sutura absorvível 4-0 trançada com uma agulha rodada meio de sutura contínua.
- Feche a pele externa com um monofilamento não absorvível 6-0 com agulha cortante meio de sutura contínua.
- Remova o mouse do anestésico inalatório e injetado 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina subcutânea.
- Permitir que o rato se recuperar a sua gaiola colocada sobre uma almofada de aquecimento ° C, 37 º C com acesso livre a comida e água. Se os ratos demonstrar sinais de dor como hunching ou com mobilidade reduzida, a buprenorfina pode ser dada a cada 12 horas durante um período de 36 horas.
- Após a cicatrização de feridas (7-10 dias), anestesiar o mouse e remover as suturas externas.
6. Rastreamento bioluminescente do Canc pâncreaser Progressão
- Anestesiar o mouse usando isoflurano inalado.
- Injectar 150 mg / kg de D-luciferina, através da veia da cauda.
- Posicione o mouse no sistema de imagem de bioluminescência e capturar imagens de luz branca e bioluminescência como descrito anteriormente. 14,15
- Remova o mouse do anestésico inalatório e permitir que ele se recuperar em sua gaiola.
Nota: a imagem de bioluminescência é não-invasiva e pode ser realizada periodicamente para investigar a cinética de crescimento do tumor. Para tumor imagem na cauda do pâncreas é importante colocar o mouse sobre o seu lado esquerdo, de modo que os pontos do tumor para a câmera. Nós fotografada uma vez por semana com a freqüência aumentada até três vezes por semana, antes do ponto final experimental utilizando um sistema de imagem II Lumina (Perkin-Elmer, ex-Caliper Life Sciences) rodando software 4.3.1 Imagem de estar com binning 4, FOV 12.5, F-stop 1, exposição de 1 - 60 seg (determinada pela maior exposure sem saturação de pixels).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este método descreve um modelo ortotópico de câncer de pâncreas através de procedimentos cirúrgicos, incluindo a indução da anestesia, laparotomia, a injeção de células cancerosas no fechamento Matrigel e abdominal (Figura 1A). As células injectadas formar uma bolha na superfície do pâncreas (Figura 1B). A progressão do cancro do pâncreas podem ser monitorizados de forma não invasiva através de imagiologia in vivo bioluminescência para controlar a proliferação de células cancerosas e de difusão (Figura 2). Metástase do fígado foi indicado pela observação da bioluminescência no fígado durante a ressecção cirúrgica (Figura 2) e confirmado por histologia ex vivo (Figura 4B). Os tumores primários foram ressecados com a cauda do pâncreas e baço, às 6 semanas após a implantação. Dinâmica de crescimento tumoral nesse modelo de injeção ortotópico são reprodutíveis e se assemelham a cinética de modelos de transplante ortotópico de pa cancro ncreatic (Figura 3). O crescimento dos tumores no pâncreas é localmente invasivo e metástases para órgãos, incluindo fígado (Figura 4).
Figura 1. Um modelo de camundongo ortotópico de progressão do câncer de pâncreas. A) i. O rato anestesiado é fixada no lugar com fita eo abdômen é desinfetada. ii. Após laparotomia longitudinal do baço e cauda do pâncreas são gentilmente exteriorizado e mantido no lugar de um cotonete estéril. iii. Células tumorais pancreáticas Matrigel embutido são injetados na cauda do pâncreas. iv. O abdômen é fechada em duas camadas. Imagem B) ampliada mostrando baço exteriorizado e pâncreas. As células injetadas formar uma bolha (seta). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 2. A imagem de bioluminescência de tumor pancreático ortotópica (A) 10 dias após a injecção, (B), 31 dias após a injecção, e (C), cinco dias após a ressecção do tumor.
Figura 3. In vivo, o crescimento do tumor primário de Panc-1, Capan-1 e linhas de células foi monitorizada ao longo do tempo (dias após a injecção) por imagem de bioluminescência (n = 4). A cinética de crescimento do tumor após a injecção de células tumorais pancreáticas Matrigel incorporados são semelhantes aos modelos de transplante ortotópico de peças tumorais pancreáticas.
_upload/50395/50395fig4.jpg "alt =" Figura 4 "/>
Figura 4. Hematoxilina-eosina secções coradas de (A) de tumor pancreático Panc-1 primário, e (B) a metástase do fígado de Panc-1 tumor pancreático primário. * Invasão local de células de cancro do pâncreas em torno do órgão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós descrevemos um modelo ortotópico de avaliação longitudinal do desenvolvimento do tumor de pâncreas e progressão. Cinética de crescimento do tumor primário são reprodutíveis (Figura 3) e podem ser não-invasiva monitorizada utilizando imagem de bioluminescência de células marcadas com luciferase, por exemplo, para análises da resposta do tumor a novas terapêuticas anti-cancro do pâncreas. Consistente com a doença humana, o modelo mostra invasão pancreático local (Figura 4A), que permite a investigação das interacções das células tumorais com o microambiente pancreático. A utilização de linhas de células marcadas com luciferase permite análises de frequência, a localização e a cinética de difusão metastática. A utilização de linhas de células marcadas com luciferase facilita a detecção de metástases antes de se tornarem visualmente aparente e localização do tecido de metástases podem ser confirmados por ex vivo de imagens e histologia. Tal como na situação clínica, o modelo mostra metástases organs, incluindo nódulos linfáticos mesentéricos, fígado, tracto gastro-intestinal e na cavidade peritoneal (Figura 4). imagiologia bioluminescência 8 também pode ser usado para determinar a ressecção bem sucedida, e incidência e cinética de recorrência do tumor primário (Figura 2C) 16.
A preparação cuidadosa e tratamento de células de cancro do pâncreas é essencial para a reprodutibilidade do modelo. A proporção de Matrigel para PBS foi optimizado para a solidificação rápida do sedimento celular após a injecção. O volume de células sedimentadas (aproximadamente 35 ul por 10 7 células tumorais) deve ser subtraído o volume de PBS para uma proporção de 3:2 final, de Matrigel: Células + PBS. Durante a injecção, vazamento de células é evitada através da manutenção da agulha no local durante 30-60 segundos até que o Matrigel solidificou (Figura 1). Se a fuga ocorre, é facilmente detectado como Matrigel é colorido e os ratinhos podem ser excluídas from análises posteriores. Impedir vazamento célula tumoral metástase assegura que ocorre a partir de disseminação de células de tumor, em vez de como um artefacto da técnica de injecção.
A cinética de desenvolvimento de tumor irá ser influenciada pelo número de células injectadas e deve ser determinada empiricamente para cada linha celular. Encontrámos padrões de crescimento de tumor após injecção reprodutíveis de 4 x 10 5 Panc-1 ou o Capan-1, células (Figura 3). O limiar para a detecção de metástases bioluminescente será influenciada pelas características da construção de expressão utilizada, incluindo a força do promotor e a utilização da luciferase com codões optimizados. Além dos modelos de xenoenxerto aqui descritos, as técnicas podem também ser usados com linhas de células pancreáticas singénicos para examinar progressão pancreático num ambiente imunocompetentes. Dinâmica tumorais semelhantes foram observados em ratos do sexo masculino ou feminino (dados não mostrados).
O método descrito elere foi modificado para um modelo de transplante ortotópico de câncer pancreático. Neste modelo, os tumores são crescidos subcutaneamente em ratinhos dadores, em seguida, uma peça de 3 1 mm é transplantado para um pequeno bolso na cauda do pâncreas de um rato receptor. 6-8,17 o crescimento do tumor primário pode ser controlada por meio de imagem de bioluminescência usando tumores dadores derivada de células tumorais marcadas com luciferase. Em contraste com o modelo ortotópico aqui descrito, os modelos de transplante de exigir mais tempo (até 1 mês) e ratinhos adicionais para a geração de tumores de dadores. Resultados usando modelos de transplante pode ser influenciada pela composição heterogênea de peças tumorais transplantadas. Nós mostramos aqui que a cinética após a injeção de células-Matrigel incorporados são semelhantes ao modelo transplantado. Transplantation modelos têm sido utilizados para estudar e expandir amostras clínicas 18-21.
Os modelos ortotópicos descritos aqui complementar transgénico modelos de câncer de pâncreas pré-invasiva e invasiva. 10,22,23 modelos transgênicos recapitular os principais aspectos de câncer de pâncreas humano, incluindo mutações oncogênicas, mas mostram uma variabilidade significativa no início da doença (7 semanas a> 1 ano). 10,23 maioria dos modelos transgênicos fazer não expressam luciferase e por isso não são adequados para a imagem de bioluminescência vivo na progressão da doença. Em contraste, os modelos ortotópicos de cancro do pâncreas, demonstram uma cinética reprodutível de progressão tumoral e permitir a monitorização não-invasivo, tornando-os adequados para estudos pré-clínicos terapêuticos.
Novas abordagens terapêuticas são urgentemente necessárias para combater os excepcionalmente baixas taxas de sobrevivência de câncer de pâncreas. Ao permitir a visualização de doença metastática e recorrente, os modelos ortotópico de câncer de pâncreas aqui descritas são relevantes para a prática clínica, onde a maioria dos tratamentos atuais são paliativos. Além disso, os modelos ortotópicossão altamente valiosos para investigar a biologia do tumor de pâncreas e avaliar novas estratégias terapêuticas no cenário em vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council, na Austrália (1008865), o Australian Research Council (LE110100125), o Instituto Nacional do Câncer (CA138687-01), Erica Sloan é apoiado por uma bolsa de carreira precoce do cancro da mama Nacional Fundação, na Austrália. Corina Kim-Fuchs é apoiado por uma bolsa da Liga Cancer suíço e uma bolsa HDR a partir de Monash Instituto de Ciências Farmacêuticas. Eliane Angst é apoiado por uma bolsa da Bern Cancer League.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
