Summary
Лучшее понимание биологии рака поджелудочной железы крайне необходимо для того, чтобы развитие лучших терапевтические возможности для лечения рака поджелудочной железы. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы демонстрируем ортотопической модели рака поджелудочной железы, который позволяет неинвазивного мониторинга прогрессирования рака использования
Abstract
Introduction
Рак поджелудочной железы является четвертой ведущей причиной онкологической смертности, связанной, с 5-летняя выживаемость составляет 4-6%. 1,2 Только 15% больных диагностируются достаточно рано в болезни, чтобы иметь право на операцию, и опухоли повториться в> 80% пациентов. 3,4 Гемцитабина используется для лечения рака поджелудочной аденокарциномы, однако, устойчивость к химическому воздействию является общим и часто препарат оказывает незначительное влияние на общую выживаемость. 5 новых фармакологических стратегий для лечения рака поджелудочной железы критически необходимы. Их развитие зависит от значительно улучшили понимание ключевых шагов прогрессирования заболевания, которые могут быть чувствительны к терапевтическому вмешательству.
Ортотопическая модели рака поджелудочной железы подражать ключевые аспекты болезней человека, что делает их идеальным инструментом для изучения биологии рака поджелудочной железы. 6-9 В отличие от в пробирке на основе клеток поджелудочной поведение раковых клетокD подкожной в естественных условиях модели рака поджелудочной железы, ортотопический модели позволяют исследование опухоли взаимодействия клетки с поджелудочной микросреды. Кинетика прогрессирования заболевания являются высокая воспроизводимость в ортотопический моделей и происходят в течение короткого промежутка времени (недели), что делает их хорошо подходит для доклинических испытаний терапии романа. Это в отличие от трансгенных моделей, в которых начало заболевания происходит в течение более длительного и более переменных времени кадра (месяцев до 1 года). 10 При использовании с более агрессивными клеточных линий, ортотопической модели рака поджелудочной железы у модели спонтанной метастазов аналогичны тем, которые наблюдаются при пациентов. 8 Выражение биолюминесцентного репортерных генов, таких как люциферазы светлячка облегчает продольной мониторинга роста опухоли, метастазирование, рецидив и ответ терапии. 6,11
Здесь мы опишем ортотопической рак поджелудочной железы, который использует MatrИгель для локализованной доставки клетке и в естественных изображений биолюминесценции для неинвазивного мониторинга прогрессирования опухоли. Это ортотопический модели рака поджелудочной железы позволяет неинвазивные анализы прогрессирования заболевания и ответ на терапевтические вмешательства в сингенные или ксенотрансплантатом моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол демонстрируются осуществляется под руководством и утверждения учреждения автора уходу и использованию животных комитета. Все эксперименты выполнены с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов.
1. Трансдуцирующих поджелудочной клеточных линиях рака
- Трансдукции клетки поджелудочной железы выразить люциферазы, как описано выше. 12,13 Panc-1 и Capan-1 панкреатических раковых клеточных линий, трансдуцированных люциферазы светлячка не используются.
Примечание: люциферазы Renilla или бактериальной люциферазы также могут быть использованы.
2. Клеток рака поджелудочной железы подготовка
- Культура не трансдуцированных клеток рака поджелудочной железы до 70% вырожденная.
- Лифт клеток поджелудочной железы и обеспечить жизнеспособность превышает 90%.
- Ресуспендируют в 2 × 10 7 клеток / мл в смеси 3:2 охлажденной Матригель: фосфатным буфером салине (PBS).
- Держите матригелем клеточной суспензии на льду до инъекции в поджелудочной железе.
Примечание: Для обеспечения быстрого затвердевания матригеля, уменьшите громкость PBS для учета объема осадок клеток. Ручка Матригель использованием ледяной инструменты и шприцы в любое время, чтобы предотвратить затвердевание перед инъекцией. Предложенные сотового телефона представляет собой руководство и определяется опытным путем для каждой клеточной линии.
3. Подготовка Мышь
- Обезболить мыши ингаляций 2-3% изофлурана. Определите глубину анестезии из-за отсутствия педали рефлекс на нежный щепотку ног.
- Нанесите смазку на глаз, чтобы предотвратить высыхание.
- Поместите мышь на спине на 37 ° грелку C и осторожно повернуть мышь, чтобы поднимать с левой стороны живота.
- Подготовьте живота с 10%-ным раствором йода повидон.
Примечания: Injectabле анестезии может быть использован вместо ингаляционных анестезии. Предоперационная подготовка натощак не нужно.
4. Лапаротомия
- Использование стерильных хирургических инструментов сделать 1,5 см разрез в коже приблизительно в 1 см от левой боковой линии.
- Сделайте 1,5 см разрез в базовой брюшной мышцы.
- Найдите селезенки помощью щипцов и аккуратно удалить селезенку из брюшной полости. Закрепите селезенки по стерильным ватным тампоном, обнажив расположенную внизу поджелудочной железы.
- Местонахождение хвоста поджелудочной железы, прилегающих к селезенке.
- С помощью 29 G 0,3 мл шприц инсулина, вводят 20 мкл Матригель клеточной суспензии в поджелудочной железе.
- После инъекции Держите шприц в поджелудочной железе в течение 30-60 сек, пока Матригель не затвердеет. Этот важный шаг ячейки минимизирует утечку.
- Осмотр в месте инъекции, чтобы исключить утечки не наблюдалось.
- Возврат селезенки и поджелудочной железы в брюшную полость.
Внимание: Будьте внимательны, чтобы избежать проколов спинной стороны поджелудочной железы, которые могут быть тонкими.
5. Брюшной стенки пробки
- Закрыть брюшную мускулатуру мышь с рассасывающиеся плетеные 4-0 шва с круглой иглой с использованием непрерывного шва.
- Закрыть внешней обшивки с нерассасывающихся мононити 6-0 шва с режущей иглой с использованием непрерывного шва.
- Отключив мышь от вдыхаемого анестезией и вводят внутривенно 0,05-0,1 мг / кг подкожно бупренорфин.
- Разрешить мышь, чтобы восстановить в клетке помещают на 37 ° C грелку со свободным доступом к пище и воде. Если мышей демонстрировать признаки боли, такие как скрючившись или ограниченной подвижностью, бупренорфин может быть дано каждые 12 часа в течение периода 36 час.
- После заживления раны (7-10 дней), анестезию мыши и удаления внешнего швов.
6. Биолюминесцентный Tracking поджелудочной CancER прогрессии
- Обезболить мыши с помощью вдыхания изофлурана.
- Введите 150 мг / кг D-люциферином через хвостовую вену.
- Наведите в биолюминесцентными системы визуализации и захвата белого света и изображений биолюминесценции как описано выше. 14,15
- Отключив мышь от ингаляционных анестетиков и дать ему восстановиться в своем доме клетку.
Примечание: Биолюминесцентный изображений является неинвазивным и может проводиться периодически исследовать опухоли кинетики роста. Чтобы изображение опухоли в поджелудочной хвост важно поставить мыши на его левой стороне, так опухоли указывает на камере. Мы отображаемого один раз в неделю с частотой увеличена до трех раз в неделю до экспериментальных конечную точку, используя Lumina II изображений (Perkin-Elmer, ранее суппорт Life Sciences) работает гостиная программного обеспечения 4.3.1 Формирование изображений с помощью биннинге 4, угол обзора 12,5, F-стоп 1, выдержка 1 - 60 сек (определяется по наибольшему Exposure без пиксельных насыщенность).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод описывает ортотопической рака поджелудочной железы с помощью хирургического вмешательства, в том числе индукции анестезии, лапаротомия, инъекции раковых клеток в Матригель и брюшной закрытия (рис. 1А). Вводили клетки образуют пузырей на поверхности поджелудочной железы (фиг.1В). Прогрессирование рака поджелудочной железы может быть неинвазивным контролируется с использованием в естественных изображений биолюминесценции отслеживать пролиферации раковых клеток и распространению (рис. 2). Метастазов в печени было указано наблюдения биолюминесценции в печени при хирургической резекции (рис. 2) и подтвердил бывший естественных условиях гистологии (рис. 4В). Первичные опухоли иссекают с хвостом поджелудочной железы и селезенки через 6 недель после имплантации. Динамики роста опухоли в этой ортотопической инъекции воспроизводимым и напоминают кинетики ортотопический моделей трансплантации годовых ncreatic рака (рис. 3). Рост опухоли в поджелудочной железе локально инвазивной и дает метастазы в органах, включая печень (рис. 4).
Рисунок 1. Ортотопический мышиной модели рака поджелудочной прогрессии.) Я. Анестезию мыши фиксируется на месте с помощью ленты и живот дезинфицируется. II. После продольной лапаротомии селезенки и поджелудочной железы хвоста аккуратно выводили и удерживается на месте на стерильной ваты. III. Матригель встраиваемый клетки опухоли поджелудочной железы вводят в поджелудочной железе хвост. внутривенно Живот закрыт в два слоя. B) увеличенное изображение показывает выводили селезенки и поджелудочной железы. Вводили клетки образуют пузырь (стрелка). ftp_upload/50395/50395fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 2. Биолюминесцентный визуализации опухоли поджелудочной ортотопический (A) через десять дней после инъекции, (B) 31 дней после инъекции, и (С) пять дней после резекции опухоли.
Рисунок 3. В естественных условиях роста первичной опухоли Panc-1 и Capan-1 линий клеток контролировали с течением времени (суток после инъекции) по биолюминесценции изображений (п = 4). Кинетика роста опухоли после инъекции Матригель встроенный клетки опухоли поджелудочной железы аналогичны ортотопической модели, используя трансплантации части опухоли поджелудочной железы.
_upload/50395/50395fig4.jpg "Alt =" Рисунок 4 "/>
Рисунок 4. Гематоксилином и эозином окрашенных участков (А) Panc-1 первичной опухоли поджелудочной железы, и (Б) метастазов в печень от Panc-1 первичной опухоли поджелудочной железы. * Местное вторжение клеток поджелудочной железы в окружающие органа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем ортотопической для продольного оценки развития поджелудочной железы и прогрессию опухолей. Первичная опухоль кинетики роста воспроизводимые (рис. 3) и может быть неинвазивно контролировать с помощью биолюминесценции люциферазы изображений с метками клетках, например, для анализа ответа опухоли на новой противораковой терапии рака поджелудочной железы. В соответствии с заболевание человека, модель показывает локальной инвазии поджелудочной железы (фиг. 4А), которая позволяет исследовать опухоль взаимодействий клетка с поджелудочной микросреды. Использование люциферазы с метками линий клеток позволяет анализ частоты, местоположение и кинетика метастазирования. Использование люциферазы с метками линий клеток облегчает обнаружение метастазов прежде чем они станут очевидными визуально и тканей локализации метастазов может быть подтвержден бывших естественных изображений и гистологии. Как и в клинической ситуации, модель показывает метастазы в оргответа в том числе брыжеечных лимфатических узлов, печени, желудочно-кишечного тракта и брюшной полости (рис. 4). 8 биолюминесценции изображений также может быть использован для определения успешной резекции и заболеваемости и кинетики первичного рецидива опухоли (фиг. 2С). 16
Тщательная подготовка и обработка клеток рака поджелудочной железы имеет важное значение для воспроизводимости модели. Отношение Матригель в PBS был оптимизирован для быстрого затвердевания осадок клеток после инъекции. Объем осажденные клетки (приблизительно 35 мкл в течение 10 7 опухолевых клеток) следует вычитать из объема PBS до конечной 3:2 Матригель: + клеток PBS. Во время инъекции, клетки утечки предотвратить путем поддержания иглу на месте в течение 30-60 сек, пока Матригель не затвердеет (Рис. 1). Если утечка имеет место легко обнаружены как Матригель окрашен и те мыши, могут быть исключены FROM дальнейших анализов. Предотвращение утечки клетки опухоли гарантирует, что метастазы опухоли происходит от распространения клетки, а не как артефакт технику инъекции.
Кинетика развития опухоли будет зависеть от числа клеток вводили и должны быть определены эмпирически для каждой клеточной линии. Мы обнаружили, воспроизводимые модели роста опухоли после инъекции 4 х 10 5 Panc-1 или Capan-1 клеток (рис. 3). Пороговое значение для биолюминесцентного обнаружения метастазов будет зависеть от характеристик конструкции экспрессии, используемый в том числе силы промотора и использование оптимизированными кодонами люциферазы. В дополнение к ксенотрансплантата модели, описанные здесь способы могут также использоваться с сингенных линии клеток поджелудочной изучить поджелудочной прогрессии в иммунокомпетентных настройки. Подобная динамика опухоли наблюдались у мужчин или женщин мышей (данные не показаны).
Способ, описанный онповторное была изменена для ортотопической трансплантации поджелудочной железы. В этой модели опухоли выращивали подкожно в донорной мыши, а затем 1 мм 3 шт пересаживают в небольшой карман в поджелудочной железе хвост получателем мыши. 6-8,17 первичного роста опухоли можно контролировать с помощью биолюминесценции визуализации с использованием донорских опухолей полученные из люциферазы-меченый опухолевых клеток. В отличие от ортотопической модели, описанной здесь, трансплантация модели требуют дополнительного времени (до 1 месяца) и дополнительные мышей поколения донор опухолей. Результатов с помощью трансплантации модели может зависеть от неоднородный состав пересаженной части опухоли. Мы показали здесь, что кинетика после инъекции Матригель встраиваемый клетки сходны с трансплантированной модели. Трансплантация модели были использованы для изучения и расширения клинических образцах пациента. 18-21
Ортотопический модели, описанные здесь дополняют трансгенных мodels предварительной инвазивных и инвазивным раком поджелудочной железы. 10,22,23 трансгенные модели воспроизводят ключевые аспекты человеческого рака поджелудочной железы, включая мутации онкогенов, но показывают значительные различия в начале заболевания (7 недель до> 1 год). 10,23 Большинство трансгенных моделей делать Не выразить люциферазы и поэтому не подходит для прижизненного изображения биолюминесценции прогрессирования заболевания. В отличие от моделей ортотопический рака поджелудочной железы показывают воспроизводимые кинетики опухолевой прогрессии и позволяют неинвазивного мониторинга, что делает их хорошо подходит для доклинических терапевтических исследований.
Новых терапевтических подходов критически необходимы для борьбы с исключительно низкой выживаемости при раке поджелудочной железы. По позволяющие визуализации метастатическим и рецидивирующим заболеванием, ортотопический модели рака поджелудочной железы, описанные здесь, относятся к клинической обстановке, где самые современные методы лечения являются паллиативной помощи. Кроме того, в ортотопической моделиочень ценны для исследования биологии опухоли поджелудочной железы и оценке новых терапевтических стратегий в в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета, Австралия (1008865), Австралийский исследовательский совет (LE110100125), Национального института рака (CA138687-01), Эрика Слоана поддерживается Ранние стипендий карьеры от Национального рака молочной железы Фонд, Австралия. Корина Ким-Фукса поддерживается общение от швейцарской лиги рака и стипендии HDR от Монаш Института фармацевтических наук. Элиан Angst поддерживается грантом от Берна Рак лиги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean Bench coat | |||
| Heating pad | Set to 37 °C | ||
| Ivis Lumina ll Bioluminescent imager | Caliper | Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab) | |
| Dissecting scissors | |||
| Iris forceps (serrated) | |||
| Needle holder | |||
| 27 G 0.3 ml insulin syringe | Terumo | T35525M2913 |
References
- American Cancer Society. Facts and Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Hariharan, D., Saied, A., Kocher, H. M. Analysis of mortality rates for pancreatic cancer across the world. HPB (Oxford). 10, 58-62 (2008).
- Li, D., Xie, K., Wolff, R., Abbruzzese, J. L. Pancreatic cancer. Lancet. 363, 1049-1057 (2004).
- Oettle, H., et al. Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observation in patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer: a randomized controlled trial. JAMA. 297, 267-277 (2007).
- Andersson, R., et al. Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer: molecular mechanisms and potential solutions. Scand. J. Gastroenterol. 44, 782-786 (2009).
- Angst, E., et al. Bioluminescence imaging of angiogenesis in a murine orthotopic pancreatic cancer model. Mol. Imaging Biol. 12, 570-575 (2010).
- Angst, E., et al. N-myc downstream regulated gene-1 expression correlates with reduced pancreatic cancer growth and increased apoptosis in vitro and in vivo. Surgery. 149, 614-624 (2011).
- Hotz, H. G., et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas. 26, 89-98 (2003).
- Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the Panc02 and 6606PDA cell lines. Eur. Surg. Res. 47, 98-107 (2011).
- Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell. 4, 437-450 (2003).
- Sloan, E. K., et al. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res. 70, 7042-7052 (2010).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Morizono, K., et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat. Med. 11, 346-352 (2005).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. J. Vis. Exp. (56), e3175 (2011).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. J. Vis. Exp. (52), e2775 (2011).
- Burton, J. B., et al. Adenovirus-mediated gene expression imaging to directly detect sentinel lymph node metastasis of prostate cancer. Nat Med. 14, 882-888 (2008).
- Vezeridis, M. P., Doremus, C. M., Tibbetts, L. M., Tzanakakis, G., Jackson, B. T. Invasion and metastasis following orthotopic transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J. Surg. Oncol. 40, 261-265 (1989).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5645-5649 (1992).
- Reyes, G., et al. Orthotopic xenografts of human pancreatic carcinomas acquire genetic aberrations during dissemination in nude mice. Cancer Res. 56, 5713-5719 (1996).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Furukawa, T., Kubota, T., Watanabe, M., Kitajima, M., Hoffman, R. M. A novel "patient-like" treatment model of human pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res. 53, 3070-3072 (1993).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Brembeck, F. H., et al. The mutant K-ras oncogene causes pancreatic periductal lymphocytic infiltration and gastric mucous neck cell hyperplasia in transgenic mice. Cancer Res. 63, 2005-2009 (2003).
